Summary
纳米纤维具有高的表面积与重量比，优异的机械完整性，并支持细胞生长和增殖。这些纳米纤维具有广泛的生物医学应用。在这里，我们制造角蛋白/ PCL纳米纤维，利用静电纺丝技术，和表征纤维用于组织工程可能的应用。
Abstract
静电纺丝，由于它的多功能性和潜在的在各个领域的应用中，被频繁用于制造纳米纤维。这些多孔纳米纤维的生产是非常感兴趣的，由于其独特的物理化学性质。在这里，我们阐述含有聚（ε -己内酯）角蛋白（PCL）纳米纤维（即，PCL /角蛋白复合纤维）的制造。水溶性角蛋白首次从人类头发萃取，用不同比例的PCL混合。 PCL /角蛋白的混合溶液转化成用实验室设计的静电设立纳米纤维膜。纤维形态，将得到的纳米纤维的机械性能进行了观察和使用扫描电子显微镜和拉伸试验机进行测定。此外，纳米纤维的降解和化学性质用FTIR分析。 SEM图像显示，对于不同的组合物的PCL /角蛋白纤维均匀的表面形貌。这些PCL / keratiÑ纤维也表现出优异的机械性能如杨氏模量与故障点。成纤维细胞能够附着并增殖从而证明良好的细胞生存力。根据上面讨论的特征，我们可以强烈认为天然和合成聚合物的共混纳米纤维可以表示可用于不同的生物医学应用的复合材料的优异的发展。
Introduction
电纺丝是公认的实现聚合物纳米纤维的一种普遍方法。该纤维可以在纳米级来制备和纤维的性能定制1。这些发展和纳米纤维的特性一直是他们在生物医学工程应用中特别有趣尤其是在组织工程。所述纳米纤维具有相似的细胞外基质，从而促进细胞粘附，迁移和增殖2。由于这种相似的胞外基质（ECM），电纺纤维可以用作材料，以协助在伤口敷料，药物递送，以及用于工程组织如肝，骨，心脏，肌肉3。
各种合成和天然来源的不同聚合物已被用于创建不同的生物医学工程应用4静电纤维。近来，在不断增长terest在复合纳米纤维的发展通过混合合成的和天然的聚合物4。在这些组合物的最终产品通常继承与合成聚合物结合的同时还采用生物线索和性质与天然聚合物的机械强度。
在该实验中，PCL和角蛋白被表示为要使用的复合纳米纤维的合成的合成和天然聚合物。角蛋白是在毛发，羊毛和指甲发现天然聚合物。它包含了许多氨基酸残基;值得注意的兴趣是半胱氨酸4,5。理想的是天然存在的聚合物是生物可再生的，生物相容和可生物降解的。角蛋白具有所有这三种特性，同时也增强细胞增殖和附着到它已在6被纳入的生物材料。
聚己内酯（PCL）是一个可再吸收的，合成的聚合物，在显著组织工程4。这种聚合物先前已经称赞其结构和机械稳定性，但是，它缺乏细胞亲和力并呈现一个冗长的降解速率。 PCL的疏水性质为缺乏细胞亲和性7的可能负责。然而，PCL由是与其他聚合物高度混溶弥补了其局限性。一个PCL /角蛋白复合应当证明PCL的力学性能，并纳入角蛋白的生物特性，使其成为各种生物医学应用的理想选择。
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Protocol
所有协议遵循研究合规与道德的北卡罗莱纳州A＆T州立大学办公室的指导方针。
1.化学制备角蛋白提取4
- 为了制备1,000ml中2％重量/体积的过乙酸溶液（PAS），在通风橱下20毫升过乙酸加至980毫升去离子（DI）水的。
- 为了制备1,000ml中的100mM Tris碱溶液（TBS）中，添加12.2克Tris碱的达1,000ml去离子水，搅拌至完全溶解。
- 通过倾倒4ml浓盐酸于30ml DI水中制备在通风橱稀盐酸溶液（DHAS）。
- 采购大约20g还没有经过化学处理或改变人的头发丝的剪报。头发可以是任意长度。
- 彻底清洗头发，用手，用温水和肥皂。使用去离子（DI）水进行最后冲洗。
- 把头发分成2台60毫升的烧杯中，并发生在80ºCØVEN 1小时。
- 从烧杯底部排出的液体和放回烘箱直到头发完全干燥。
- 鸿沟干头发均匀地600毫升的烧杯之间，将将10克发到每个烧杯中。不要让头发充满超过500毫升。
- 倒入500毫升PAS到每个烧杯中并确保覆盖所有的头发。用封口膜封住并存储12小时的烧杯。
2.角蛋白提取液的制备
- 使用500微米筛子分离PAS头发。收集废物的PAS在一个单独的容器中。用去离子水彻底冲洗头发，以消除任何剩余的PAS。
- 放置在一个500ml烧瓶中的漂洗毛发。倾400毫升的TBS到烧瓶中，确保毛发被覆盖。在设置为38ºC，65转1小时的惊天洗澡的地方瓶。
- 1小时后，从振荡浴中移除，并倒入液体，约400毫升角蛋白提取液（KES），我n要的1000ml烧杯中。
- 倾400毫升DI水到含有头发确保毛发被覆盖并放回振荡浴1小时烧瓶中。从晃动浴中取出烧瓶，并倒入剩余的将400ml KES入1000毫升烧杯中与先前收集的KES。头发不再需要并且可以倾倒出瓶中的并丢弃在最近的垃圾容器。
3.角蛋白提取液浓度
- 填写rotodistiller浴用蒸馏水顶线，并设置到90℃。设置旋转速度至200转。打开冷却剂冷却器泵和设置为-10ºC。
- 使用pH计来监视KES的pH值，用移液管至1mM DHAS慢慢添加到KES直到达到pH为7.0。慢慢搅拌的溶液中。
- 倾中和的KES到500毫升的圆底烧瓶中直到大约四分之一满。根据制造商的运行蒸馏协议1.25小时。
- 重复步骤3.3直到所有KES已经蒸馏。确保将烧瓶紧紧相连。
4.透析角蛋白提取液的
- 倒入KES解决方案均分为12个独立14毫升锥形管。离心试管在1050×g离心10分钟。
- 倒入离心KES到一个干净的烧杯中，并确保从收集的碎片倒掉。重复，直到所有的KES已经离心。
- 填写2,000量筒用去离子水。
- 切透析管纤维素膜到24英寸，和夹管的一端保持它关闭。
- 浸管的长度DI水在汽缸中，以使之更柔软和更容易打开。
- 打开透析管纤维素膜的非限幅端和慢慢倒入60毫升离心KES溶液进入管。使用另一个剪辑关闭管道的这一端。
- 把迪所述2000毫升气缸DI水在alysis管并允许放置24小时。改变DI水在气缸中，每3至4小时。
- 24小时周期之后，清空透析KES溶液放入加盖罐子，应确保在-20℃离开顶部和地点空间在冷冻24小时。
5.角蛋白提取液冻干
- 冻干机设置为-86ºC。
- 拆下冰箱冷冻含有KES罐子，把帽子脱罐子，并把它们放入冻干机安瓿。广场上的安瓿的密封和转动旋钮创造的0.133毫巴的真空压力。冻干样品约48小时，直到所有的水分已经一去不复返了。
6.准备静电解决方案（10％重量角蛋白溶液）
- 从冻干机中取出角蛋白粉和称重。
- DI水添加到角蛋白粉末以创建10％重量/重量角蛋白的解决方案。
7.准备10％的重量PCL解决方案
- 得到的PCL（ε - 己内酯的聚合物，锰70 - 90 kDa的），和三氟乙醇（TFE）。通过搅拌O / N中的TFE重量的PCL制备10％，将获得均匀的混合物。
8.制备角蛋白/ PCL解决方案
- 获得预先制备的10％（重量）的PCL溶液和10％（重量）角蛋白溶液。添加角蛋白进入PCL溶液滴在以创造10毫升PCL / 90:10，80:20，70:30角蛋白溶液，和60:40比率明智的。
- 用涡流混合器静电之前获得的PCL /角蛋白溶液均匀的混合物。
9.生产静电纺丝的PCL /角质纤维
- 放置约8毫升的PCL /角蛋白溶液在装有0.5毫米直径的塑料管10ml的一次性注射器。放置注射器在将流速设定为2.5毫升/小时的注射器泵。
- 运行示例之前包裹铝箔收集桶。确保该铝箔是通过将标签带在任一端是稳定的。
注：纤维将形成在铝箔上（ 见图 2）中，纤维覆盖箔储存于RT。
10. PCL /角质纳米纤维的力学分析
- 8 mm切割样品成60个毫米。确保通过使用数字千分尺来记录厚度。对于准备各组成，使用五个样本。
- 附着在拉伸试验机的60×8毫米的样本。使用自定义设计的试样架附加的样本。夹着它是从一个索引卡片使用双制成样品支架之间的样本双面胶带。以10毫米/分钟的位移速率施加10N的测力传感器。
注：样品保持器被设计为有62个毫米乘40毫米，38毫米50mm的内窗。 - 记录延伸，通过软件根据软件协议的负载值。
- 通过测试的样品的区域分割的力计算应力。接着，除以初始长度的长度变化计算应变。
- 产生由在y轴为x轴对应应变值绘制应力的应力 - 应变曲线。
- 从那里斜率等于弹性模量线性区域计算杨氏模量。通过取0.2％应变偏移和绘制平行线到线性域的曲线确定从应力应变图抗拉强度。
- 以前使用分析软件使用8单因素方差分析方法进行一式三份获得的机械数据的统计分析，P值均<0.05，我们再有统计学显著。
11.表面形貌和结构表征
- 使用具有加速15千伏的电压和5微安的电流来观察电纺丝纤维的形态的参数扫描电子显微镜（SEM）。
- 用SEM来成像之前，切纤维2厘米2段和使用铜带将其连接到一个SEM阶段。放置溅射镀膜机和涂层用金内部的阶段在15mA进行1分30秒的创建的金层大约11纳米厚。加载样品到SEM的腔室。观察纤维样品。
- 使用傅立叶变换红外光谱（FTIR）来表征PCL和角蛋白之间的化学结合。放置静电纳米纤维膜的2 平方厘米部分中的磁夹持器和测试之前吹扫 用干燥空气的系统。获取光谱200扫描和使用STA分析光谱根据软件协议ndard软件。
- 使用标准的软件进行频谱分析，并使用根据制造商的方案的纳米纤维的各个比率的一式三份。
12.细胞纤维相互作用研究
- 切纤维为16 平方毫米的样品。使用生物相容的，硅氧烷基胶固定每个样本盖玻片用直径为12毫米。
- 胶纤维样品到盖玻片的背面的一端，环绕盖玻片样品，然后粘上样品到盖玻片的背面的自由端，以及，留下覆盖有仅滑移的顶纤维样品。
- 放置纤维样品在24孔板中。通过在80％乙醇中浸渍1小时灭菌样品。
- 冲洗使用去离子水样品中的乙醇。然后，加入2 ml基础培养基上的样品中，并确保以覆盖整个样品。 5分钟后删除网上平台。
- 使用3成纤维细胞T3细胞种子的纤维样品。暂停补充有抗生素和10％胎牛血清（FBS），以便在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）的细胞有大约62000个细胞/ cm 2的每1ml DMEM中。
- 滴将1ml 3T3含细胞的DMEM溶液到每个孔板确保每个纤维样品覆盖有大约62000个细胞/ cm 2以下。孵育孔板在37℃下24小时和5％ 的 CO 2。注意：使用5％的CO 2，因为该水平通常可以保持细胞媒体在生理范围的pH值天。
13.降解纳米纤维矩阵
- 切干PCL /纳米纤维角蛋白膜成方形约30mm×30毫米。
- 消毒900 平方毫米的样品用80％酒精10分钟的潜伏期和去离子水彻底清洗。孵育样品在15毫升PBS中，pH为7.5的，在37ºC。更换BUFFER每3天。
- 取该膜从溶液中在指定的时间间隔，1周和7周，并用DI水冲洗。
- 将膜样品进入冻干机安瓿。放置在安瓿的密封和转动旋钮以产生真空。冻干24小时，直至完全干燥。
- 在干燥的样品将其连接到用铜带的SEM阶段。放置溅射镀膜机和涂层用金内部的阶段在15mA进行1分30秒的。
- 加载样品到SEM的腔室。在1.5千伏和5微安的电流的加速电压观察纤维样品。
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Representative Results
纤维形态
对于所有的纤维组合物得到的纤维的SEM图像。 参见图3。纤维图像证实了纤维被随机取向。
机械测试
机械强度高的纤维一般需要关于各种组织工程应用。这些纤维应保留一定的压力和环境条件9下足够的强度和柔韧性。通常，支架被期望具有接近目标组织的，以避免任何应力屏蔽效应模量和期间在体内和 /或体外的细胞生长10，以保持足够的强度。拉伸测试仪来测量杨氏模量，纤维的断裂强度。杨氏模量（兆帕）的PCL /角蛋白在100比率：00，90:10，80:20和70:30瓦特如结果为10±2,8±1,5±1.5和4.5±1.6， 分别为4。同样，断裂强度（MPa）在100比率的PCL /角蛋白：00，90:10，80:20和70:30被发现是3±1.2，2±0.5,1±0.2和1±0.3 分别为4如表 1所示。 图4显示的杨氏模量相对于PCL.keratin比率的变化的图形趋势。在进一步理解的断裂伸长率在图表助剂的趋势线。
结构和形态特征
在图5中，用于PCL /角蛋白复合纳米纤维红外透射光谱显示在2950厘米-1 1050 -1和1240厘米-1由于分别CH 2不对称伸缩振动，CO和COC基，频带。在1720cm -1处塔的羰基吸收峰t是PCL的特点也可见4,11。在吸收带（3286厘米-1），（3,056 - 3075厘米-1），（1600 - 1700厘米-1），（1,480 - 1580厘米-1），（1,220 - 1300厘米-1）是指示角蛋白的蛋白质。该乐队已经被记为酰胺A，B，I，II和III，分别为。
存在于与在复合材料中的增加角蛋白浓度的FTIR光谱变化的频带和峰。其外观表示存在和角蛋白链的结构构象，然而，高峰和带之间的相互作用并造成一定的困难。例如，酰胺Ⅰ本在1600频带- 1700厘米-1通常用于研究角蛋白，然而，带稍微被PCL峰毁容。幸运的是，酰胺Ⅱ带就足以证明PCL之间存在的角蛋白，角蛋白链构象，和键相互作用角蛋白的官能团。
细胞-纤维的相互作用
使用扫描电子显微镜对细胞-纤维的相互作用的影响。 图6示出了分别对纳米纤维的样品培养24小时的3T3成纤维细胞的SEM图像。细胞以纳米纤维样品的粘附是可见的，并表明，该细胞丝状伪足倾向于跟随纳米纤维的取向，当他们在直径相似。进行的Almar蓝（AB）测定以量化3T3细胞的生存力在纤维中。 AB是化学刃天青。这种非荧光染料进入活细胞，线粒体还原酶减少刃天青到resorrufin这是粉红色和荧光灯。没有了在PCL /角蛋白的不同比率的毒性水平显著差异。
< BR /> 图1. 图片的角蛋白提取工艺（一）清理提取前人的头发。角蛋白提取后（B）头发; （三）角蛋白提取液; （D）冻干粉的角蛋白。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.数码相机照片电纺纤维的。作为与收集铝箔不同比例CL /角质纤维的合成图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图3. PCL /纳米纤维角蛋白的SEM图像 （AC）从PCL / 70:30，80:20，90:10，分别比角质纺解决方案纳米纤维的图像。该插图显示每个相应的SEM图像的放大倍数更高的图像。 SEM图像（DF）和（GI）表示在图（AC）中所示的纤维后1-和7周劣化试验分别。在插图中比例尺代表500纳米（见图像 C的比例尺）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.图形模量与PCL /角质比率。角蛋白浓度与妍的曲线克氏模量显示了杨氏模量的变化的图形趋势。在认识断裂伸长率的趋势线的辅助工具。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5. PCL /角蛋白与纳米纤维不同比例的红外光谱，光谱确认PCL的角蛋白的结合。在1722厘米测主峰-1同意PCL吸收带的标准基本测量，是在所有光谱可见。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6.扫描电镜图像显示的3T3成纤维细胞形态接种于PCL /角蛋白纳米纤维膜。 图像 A，B 和 C代表PCL /角蛋白与80/20 90/10比例，和70/30分别。 图像（A'），（B'） 和（C'）为 （A）的较高放大倍数的图像，（B） 和 （C），分别。上的图像的较暗区域表示附着在上面，整个纳米纤维地形各成纤维细胞的位置。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 比率 | 杨氏模量（MPa） | 断裂强度（MPa） |
| 100/0 | 10±2 | 3±1.2 |
| 90/10 | 8±1 | 2±0.5 |
| 80/20 | 5±1.5 | 1±0.2 |
| 70/30 | 4.5±1.6 | 1±0.3 |
表1. PCL的力学性能/角蛋白纤维
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Discussion
从人发角蛋白的提取成功实现。过乙酸充当对人类的头发氧化剂，允许由Tris碱中提取的角蛋白。生产角蛋白粉的是小规模，由于这样的事实，它为研究目的才被完成。这个程序已经建立在工业的大规模生产。提取的小规模角蛋白的目的是，以控制污染，批次变异性，和成本效益。
角蛋白提取是这个过程的限速步骤。角蛋白粉末的产率是很低的，0.7 - 2％。人的头发丝20克产生0.14 - 0.4克角蛋白。生产电纺丝纤维的另一个关键步骤是制定一个解决方案，适用于静电。角蛋白是容易分散在去离子水中，然而，当静电纺丝时，角蛋白/水溶液不导致纤维形成。为了提供必要的米olecular相互作用以创建纳米纤维的共聚物被引入到溶液中。 PCL溶解于TFE，能够与角蛋白通过氢键更强烈的相互作用。的TFE是因为它的电负性和酸性行为的共聚物配合物的稳定性的主要原因。
混合以PCL溶液中的角蛋白溶液呈现由于这一事实，PCL被称为是疏水，而角蛋白已知是亲水性的新的挑战。由于我们增加角蛋白的比率，很难获得均匀的混合物。此问题是由角蛋白中加入滴液明智的PCL的解决方案，并手动涡旋它30分钟解决。
SEM照片显示出优良的表面形态，是理想的细胞生长和增殖。对比FTIR结果表明在电纺丝纤维PCL和角蛋白之间的相溶性好。这可能是由于分子间氢键bPCL和角蛋白之间onding。另一个因素是与电纺丝纤维凝固防止在混合物中的PCL聚合的速度。的结构和机械完整性被PCL和角蛋白之间的分子相互作用持续，使得该材料适合用于再生医学的应用程序。发现这些静电纤维有年轻的模量近，天然组织。机械强度高的纤维是能够支持细胞粘附和增殖。在PCL /角蛋白纳米纤维显示出良好的均匀性，结构完整性，合适的机械性能，和细胞相容性。杨氏模量（MPa）用于PCL /角蛋白，在100的比率：00，90:10，80:20和70:30被发现是10±2,8±1,5±分别为1.5和4.5±1.6， 。作为角蛋白的比率加入增加模量减少。在PCL /角蛋白纤维细胞的粘附和增殖证实了纤维没有毒性，并为细胞生长的支持。沿着纳米纤维丝状伪足的增长表示成纤维细胞和PCL /角蛋白纤维之间的良性互动。
静电纺丝技术已成功用于合成PCL /基于角蛋白纳米纤维。该技术中，不同于现有的其他方法，已被证明是可靠和具有成本效益的，并且可以潜在地在大规模的纳米纤维的生产中使用。从这项研究中，我们的结论是基于PCL /角蛋白复合纳米纤维支架具有用于生物医学应用和模拟天然的ECM用于组织工程应用的潜力。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者想通过工程技术研究中心革命化金属生物材料（ERC-0812348）和纳米技术本科教育（EEC 1242139）资助的支持，感谢国家科学基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Hair | Obtained from Local Barber Shop in Greensboro | ||
| Peracetic acid | Sigma Aldrich | ||
| PCL (e-caprolactone polymer) | Sigma Aldrich | 502-44-3 | Mn 70-90 kDa |
| Trifluoroethanol (TFE) | Sigma Aldrich | 75-89-8 | |
| Tris Base (TrizmaTM Base Powder) | Sigma Aldrich | >99.9% crystalline | |
| Hydrochloric Acid | Fischer Scientific | A144C-212 Lot 093601 | Waltham, MA |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | Sarasota, FL | |
| Cellulose membrane | Sigma Aldrich | 12 - 14 kDa molecular cut off | |
| optical microscope | Olympus BX51M | BX51M | Japan |
| scanning electron microscope | Hitachi SU8000 | SU8000 | Japan |
| Table-Top Shimadzu machine | North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series | AGS-X Series | Columbia, MD |
| Fourier transform infrared spectroscopy | Bruker Tensor 2 Instrument | Billerica, MA | |
| Microcal Origin software | Northampton, MA | ||
| X-ray diffraction (XRD) | Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer | Madison, WI | |
| Fibroblast 3T3 cell | American Tissue Type Culture Collection | Manassas, VA | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM | Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Spectra max Gemini XPS microplate reader | Molecular Devices | Sunnyvale, CA | |
| Student- Newman-Keuls post hoc test | SigmaPlot 12 software |
References
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).
- Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications. J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).
- Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence. Biochem J. 236, 705-712 (1986).
- Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata. J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).
- Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds. Tissue E. 6, 605-617 (2000).
- Fortin, M. -J.
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue E. 7, 679-689 (2001).
- Bhattarai, N., et al. Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications. Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).
