Summary
nanofibers electrospun יש שטח פנים גבוה יחס משקל, שלמות מכנים מעולה, ולתמוך גדילת תא תפוצה. יש nanofibers אלה מגוון רחב של יישומים ביו. כאן אנו לפברק nanofibers קרטין / PCL, באמצעות טכניקה electrospinning, ולאפיין את סיבי עבור יישומים אפשריים בהנדסת רקמות.
Abstract
Electrospinning, בגלל הרבגוניות ואת הפוטנציאל שלה עבור יישומים בתחומים שונים, נמצא בשימוש לעתים קרובות כדי לפברק nanofibers. הפקה של nanofibers הנקבובי אלה היא עניין רב בשל מאפיינים הייחודיים שלהם physiochemical. כאן נפרט על ייצור של קרטין המכיל פולי (ε-caprolactone) (PCL) nanofibers (כלומר, PCL / סיבים מרוכבים קרטין). קרטין נמס במים הופק הראשון שיער אדם מהול PCL ביחסים שונים. הפתרון מעורבב של PCL / קרטין הפך ממברנות nanofibrous באמצעות electrospinning תוכנן מעבדה להגדיר. מורפולוגיה סיבים תכונות מכניות של nanofiber השיג נצפו ונמדדו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בודק מתיחה. יתר על כן, נכסים פריקים והכימיים של nanofiber נחקרו על ידי FTIR. תמונות SEM הראו מורפולוגיה משטח אחידה עבור סיבי PCL / קרטין של קומפוזיציות שונות. אלה PCL / keratiסיבי n גם הראו תכונות מצוינות מכנות כגון נקודת מודולוס וכישלון של יאנג. תאים פיברובלסטים הצליחו לצרף מתרבים ובכך להוכיח כדאיות התא טוב. בהתבסס על מאפייני שנדונו לעיל, אנו יכולים לטעון בתוקף כי nanofibers מעורבב של פולימרים טבעיים וסינתטיים יכול לייצג פיתוח מעולה של חומרים מרוכבים, שניתן להשתמש בהם עבור יישומים ביו שונים.
Introduction
Electrospinning מוכרת כשיטה נפוצה להשגת nanofibers פולימר. הסיבים יכולים להיות מיוצרים על ננו ואת מאפייני הסיבים ניתנים להתאמה אישי 1. התפתחויות אלה ואת המאפיינים של nanofibers electrospun יכולים להיות מעניינות במיוחד עבור יישומים שלהם בהנדסה ביו-רפואי במיוחד בהנדסת רקמות. Nanofibers electrospun להחזיק דמיון לחומר הבין-תאי ובכך לקדם את הידבקות תאים, נדידה ושגשוגם 2. בשל הדמיון הזה לחומר הבין-תאי (ECM), ניתן להשתמש סיבי electrospun כחומריים לסייע הלבשת פצע, אספקת סמים, ועל רקמות הנדסה כגון כבד, עצם, לב, שריר 3.
מגוון של פולימרים שונים ממוצא הסינטטי וטבעי שמש ליצירת סיבי electrospun עבור יישומי הנדסה ביו שונה 4. לאחרונה יש כבר גדל בterest בפיתוח nanofibers מרוכבים על ידי ערבוב סינתטי 4 פולימרים טבעיים. בקומפוזיציות אלה המוצרים הסופיים בדרך כלל לרשת את חוזק המכנים הקשורים הפולימר הסינטטי תוך אימוץ רמזים ביולוגיים ומאפיינים מן הפולימר הטבעי.
בניסוי זה, PCL ו קרטין מוצגים כמו פולימרים סינתטיים וטבעיים לשמש לסינתזה של nanofiber מרוכבים. קראטין הוא פולימר טבעי שנמצא שיער, צמר ומסמרים. יש בו הרבה שאריות חומצת אמינו; עניין ראוי לציון הוא ציסטאין 4,5. באופן אידיאלי פולימר טבעי יהיה biorenewable, ביולוגי מתכלה. קראטין הוא בעל כל שלושת המאפיינים הללו תוך שיפור תא התפשטות מצורף אל biomaterials זה כבר שולבו ב 6.
Polycaprolactone (PCL) הוא פולימר resorbable, סינתטי שהיא משמעותיתהנדסת 4 רקמות. פולימר זה כבר שבח בעבר את היציבות מבנית המכאנית שלה, לעומת זאת, היא חסרה זיקת תא מניבה שיעור שפלה ממושכת. האופי ההידרופובי של PCL אחראי סביר על חוסר תא זיקה 7. עם זאת, PCL מפצה על מגבלותיו ידי להיות בליל מאוד עם פולימרים אחרים. צירוף PCL / קרטין צריך להדגים את התכונות המכאניות של PCL ולשלב את התכונות הביולוגיות של קרטין, מה שהופך אותו לבחירה אידיאלית עבור יישומים ביו שונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקול אחרי קווים מנחים של A צפון קרוליינה & T סטייט משרד מחקר התאימות והאתיקה.
1. הכנת מזון לחומרי קראטין הפקת 4
- כדי להכין 1,000 מ"ל של 2% wt / כרך פתרון חומצה peracetic (PAS), תחת במנדף להוסיף 20 מ"ל של חומצה peracetic כדי 980 מ"ל של Deionized (DI) מים.
- כדי להכין 1,000 מ"ל של 100 פתרון בסיס מ"מ טריס (TBS), להוסיף 12.2 גרם של טריס בסיס 1,000 מ"ל מים DI ומערבבים עד שהיא נמסה לחלוטין.
- כן פתרון חומצה הידרוכלורית מדולל (DHAS) במנדף ידי שפיכת 4 מיליליטר של חומצה הידרוכלורית מרוכזת לתוך 30 מ"ל מי DI.
- לרכוש כ 20 גרם של קטעי שיער אדם שלא טופלו או שינו כימיים. שיער יכול להיות בכל אורך.
- שטפו את השיער ביסודיות, ביד, עם מים חמים וסבון. השתמש ללא יונים (DI) מים עבור השטיפה הסופית.
- שים את השיער לשני 600 מ"ל כוסות ומכניסים o 80 ºCven עבור שעה 1.
- מסננים את הנוזל מתחתית הכוס ומניחים ומחזירים לתנור עד שיער יבש לחלוטין.
- פרד יבשי שיער באופן שווה בין 600 מיליליטר הכוסות, הצבת 10 גרם של השיער לתוך כל כוס. אל תאפשר את השיער כדי למלא יותר מ -500 מ"ל.
- יוצקים 500 מ"ל של PAS לתוך כל כוס והקפד לכסות את כל השיער. מכסה את הכוסות עם parafilm ולאחסן למשך 12 שעות.
2. הכנת פתרון חלץ קראטין
- הפרד את השיער מן PAS באמצעות מסננת 500 מיקרומטר. אסוף את PAS פסולת במיכל נפרד. יש לשטוף את השיער היטב במים DI להסיר כל PAS שאריות.
- מניחים את השיער שטפה בבקבוק 500 מ"ל. יוצקים 400 מ"ל של TBS לתוך הבקבוק, ולוודא כי השיער מכוסה. בקבוק מקום באמבט רועד המוגדר 38 ºC, 65 סל"ד במשך שעה 1.
- אחרי שעה 1, להסיר מן רעד אמבטיה ויוצקים את הנוזל, כ 400 מ"ל של תמיסת מיצוי קרטין (KES), אניn כדי מבחנה 1,000 מ"ל.
- יוצקים 400 מ"ל מים DI לתוך הבקבוק המכיל את השיער על מנת להבטיח כי השיער מכוסה ומניחים לאחור באמבטיה רעד במשך שעה 1. הסר את הבקבוק מהאמבטיה הרועדת ויוצק את 400 מיליליטר הנותר של KES לתוך כוס 1,000 מיליליטר עם KES גבה. השיער אינו נחוץ עוד וניתן זרקה מתוך הבקבוק וזנוח ב למיכל האשפה הקרוב.
3. ריכוז של פתרון חלץ קראטין
- מלאו אמבטיה rotodistiller לשורה העליונה עם מים מזוקקים ולהגדיר עד 90 ºC. סיבוב גדר מהיר 200 סל"ד. הפעל ילר-משאבת קירור ומוגדר -10 ºC.
- באמצעות מד pH לפקח על pH של KES, להשתמש פיפטה להוסיף באיטיות 1 מ"מ DHAS אל KES עד להגעה pH 7.0. מערבבים לאט כפתרון מתווסף.
- יוצקים את KES לנטרל לתוך הבקבוק 500 מ"ל מסביב לתחתית עד כרבע מלא. הפעל את המזקק פי יצרןפרוטוקול עבור 1.25 שעות.
- חזור על שלב 3.3 עד שכל KES כבר מזוקק. ודא כי את הבקבוק מחובר בחוזקה.
4. דיאליזה של פתרון חלץ קראטין
- יוצקים פתרון KES שווה ל -12 צינורות חרוטי 14 מ"ל נפרד. צנטריפוגה צינורות ב 1,050 XG במשך 10 דקות.
- יוצק את KES centrifuged לתוך מבחנה נקיה, מוודא לשפוך מן הפסולת שנאספה. חזור על הפעולה עד כל KES כבר centrifuged.
- ממלאי 2,000 מיליליטר סיים גליל עם מים די.
- חותכי קרום תאי צינורות דיאליזה עד 24 אינץ ', קליפ קצה אחד של צינור להחזיק אותו בחוזקה.
- טובל את האורך של צינור בצילינדר של מים די כדי להפוך אותו ליותר גמיש קל יותר לפתוח.
- פתח את הקצה שאינו גזומה של קרום התאי צינורות דיאליזה ולאט לאט לשפוך 60 מיליליטר של תמיסת KES centrifuged לתוך צינורות. השתמש קליפ אחר להיסגר בסוף זה של הצינור.
- שים את diצינור alysis בצילינדר 2,000 מ"ל מים DI ולאפשר לשבת במשך 24 שעות. להחליף את המים DI בצילינדר בכל שעה 3 עד 4.
- לאחר תקופה של 24 שעות, רוקן את הפתרון KES dialyzed לצנצנות כתרים, להיות בטוח להשאיר מקום בחלק העליון ומניחים במקפיא ב -20 ° C למשך 24 שעות.
5. Lyophilization של פתרון חלץ קראטין
- הגדר את lyophilizer כדי -86 ºC.
- הסר את צנצנות ובהן קפוא KES מהמקפיא, לקחת את הפקקים של צנצנות, ולהכניס אותם לתוך אמפולות מייבש ההקפאה. מניחים את החותמות על אמפולות סובבו את הכפתור יוצר לחץ ואקום של 0.133 mbar. Lyophilize דגימות במשך כ -48 שעות, עד שכל הלחות נעלם.
6. הכנת פתרונות Electrospinning (10% WT פתרון קראטין)
- הסר את אבקת קראטין מן lyophilizer ולשקול אותו.
- מוסיפים מים DI אל אבקת קראטין ליצור משקל 10% משקל /פתרון קראטין.
7. הכנת פתרון 10% wt PCL
- השג PCL (פולימר ε-caprolactone, Mn 70 - 90 KDA), ו trifluoroethanol (TFE). כן 10% לפי משקל PCL ב TFE ידי ערבוב O / N ולקבל תערובת הומוגנית.
הכנת 8. פתרון קראטין / PCL
- השג את הפתרון PCL 10% WT הכין בעבר ו -10% WT פתרון קרטין. להוסיף קרטין לתוך ירידת פתרון PCL חכם על מנת ליצור 10 מיליליטר PCL / פתרונות קרטין של 90:10, 80:20, 70:30, ו 60:40 יחסים.
- השתמש vortexer כדי לקבל תערובת הומוגנית של פתרון PCL / קראטין לפני electrospinning.
הפקת 9. electrospun PCL / סיבי קרטין
- מניח כ -8 מיליליטר של פתרון PCL / קראטין מזרק 10 מיליליטר פנוי מצויד עם צינור פלסטיק בקוטר 0.5 מ"מ. יש להכניס את המזרק ב משאבת מזרק שבו קצב הזרימה מוגדר להיות 2.5 מ"ל / שעה.
- עוטפים את תוף אספן ברדיד אלומיניום לפני הפעלת המדגם. ודא כי רדיד האלומיניום הוא יציב על ידי יישום סרט התיוג על קצוות.
הערה: הסיבים יהוו על נייר האלומיניום (ראה איור 2), לאחסן את הרדיד מכוסה סיבים ב RT.
10. ניתוח מכני של PCL / nanofibers קראטין
- חותכים את מדגם לתוך 60 מ"מ 8 מ"מ. הקפד לרשום את העובי באמצעות מיקרומטר דיגיטלי. עבור כל רכב המוכן, השתמש חמש דגימות.
- צרף את 60 x 8 מ"מ מדגם הבוחן המתיח. השתמש בעל דגימה אישי מעוצב לצרף המדגם. סנדוויץ מדגם בין מחזיקי דגימה אשר עשוי כרטיס אינדקס באמצעות לחיצה כפולהקלטת צדדית. החל התא 10 N עומס עם שיעור עקירה של 10 מ"מ / דקה.
הערה: בעל הדגימה נועד להיות 62 מ"מ על 40 מ"מ עם חלון פנימי של 50 מ"מ על 38 מ"מ. - רחבת שיא וערכים טעינה באמצעות תוכנה על פי פרוטוקול תוכנה.
- חישוב מתח על ידי חלוקת הכח לפי תחומי מדגם הבדיקה. לאחר מכן, לחשב זן ידי חלוקת השינוי באורך ידי אורך ראשוני.
- צור את עקומת המתח מתח ידי התוויית מתח ציר y עבור מקביל ערך מתח ציר x.
- חשב את מודול יאנג מאזור ליניארי שבו שיפוע שווה ל מודולוס האלסטיות. לקבוע חוזק מתיחת מהחלקה המתח מתח על ידי לקיחת 0.2% לקזז לכאביה ציור קו מקביל בעקום באזור ליניארי.
- בצע ניתוח הסטטיסטי של הנתונים המכאניים שהושגו בשלושה עותקים באמצעות בעבר ניתוח חד סטרי שונה באמצעות ניתוח תוכנה 8. ערכי p <0.05 לנומחדש נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.
11. משטח אפיון המורפולוגיה מבני
- השתמשו במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם הפרמטרים של מאיץ מתח של 15 קילו וולט וזרם של 5 מיקרו-אמפר כדי לבחון את המורפולוגיה של סיבים electrospun.
- לפני הדמיה עם SEM, לחתוך קטע 2 2 ס"מ של סיבים וצרף אותו שלב SEM באמצעות קלטת נחושת. מניחים את הבמה בתוך coater גמגום ואת המעיל עם זהב ב 15 mA דקות 1 ו -30 שניות כדי ליצור שכבת זהב כ 11 ננומטר עבה. טענת מדגם לתוך התא של SEM. שימו לב דגימות סיבים.
- השתמש ספקטרוסקופיית פורייה (FTIR) לאפיין את הקשר הכימי בין PCL ו קרטין. מניחים את סעיף 2 ס"מ 2 של קרום nanofiber electrospun בבעל מגנטי ולטהר את המערכת עם אוויר יבש לפני הבדיקה. השג ספקטרום עבור 200 סריקות ולנתח את הספקטרום באמצעות STAתוכנת ndard פי פרוטוקול תוכנה.
- ביצוע ניתוח ספקטרום באמצעות תוכנה סטנדרטית ולהשתמש triplicates של כל יחס של nanofiber פי פרוטוקול של היצרן.
לימוד 12. של אינטראקציה תא-סיבים
- חותכים סיביים לתוך 16 מ"מ 2 דוגמאות. השתמש דבק ביולוגי, סיליקון מבוסס לתקן כל דגימה כדי coverslips בקוטר 12 מ"מ.
- מדביקי קצה אחד של מדגם הסיבים לחלק אחורי של להחליק את המכסה, לעטוף את המדגם ברחבי coverslip, ואז מדביק את הקצה החופשי של מדגם לחלק אחורי של להחליק את המכסה, כמו גם, ומשאיר את העליונים של פליטת מכוסה רק מדגם סיבים.
- מניחים את דגימות סיבים בצלחת 24 גם. לעקר את הדגימות על ידי טבילה באתנול 80% במשך שעה 1.
- שוטפים את אתנול מן דגימות באמצעות מים די. ואז, פיפטה 2 מ"ל של מדיום הבסיס על דגימות, והקפד לכסות המדגם. הסר בינוני לאחר 5 דקות.
- השתמש פיברובלסטים 3תאי T3 לזרוע את דגימות סיבים. להשעות את התאים במדיום של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) השלימו עם אנטיביוטיקה ו -10% בסרום שור העובר (FBS), כך ישנם כ 62,000 תאים / 2 ס"מ לכל 1 מ"ל של DMEM.
- זרוק 1 מ"ל של הפתרון 3T3 התא המכיל DMEM לתוך כל צלחת היטב להבטיח כי כל דגימה סיבים מכוסה כ 62,000 תאים / 2 ס"מ. דגירה היטב צלחות עבור 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הערה: השתמש 5% CO 2 כי רמת שבדרך כלל יכול לשמור על pH של התקשורת תא בטווח הפיזיולוגי במשך ימים.
ביזוי 13. של מטריקס nanofiber
- Cut יבשים PCL / ממברנות nanofiber קרטין לתוך הכיכר כ 30 מ"מ x 30 מ"מ.
- לעקר את 900 מ"מ 2 דוגמאות עם אלכוהול 80% עבור תקופת דגירה 10 דקות ולשטוף היטב במים DI. דגירה דגימות ב 15 מ"ל של PBS, pH 7.5, ב 37 ºC. החזר את bufFER כל 3 ימים.
- קח את ממברנות מתוך הפתרון בפרקי זמן מוגדרים, 1 שבוע 7 שבועות, ולשטוף עם מים די.
- מניחים את דגימות הממברנה לתוך אמפולות מייבש ההקפאה. מניחים את החותמות על אמפולות סובבו את הכפתור כדי ליצור ואקום. Lyophilize למשך 24 שעות, עד שהחומר מתייבש לגמרי.
- צרף המדגם המיובש זה לשלב SEM באמצעות קלטת נחושת. מניחים את הבמה בתוך coater גמגום ואת המעיל עם זהב ב 15 mA דקות 1 ו -30 שניות.
- טענת מדגם לתוך התא של SEM. שימו לב דגימות סיבים לעבר מתח מאיץ של 1.5 קילו וולט ו -5 הנוכחי מיקרו-אמפר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מורפולוגיה סיבים
תמונות SEM של הסיבים התקבלו עבור כל קומפוזיציות הסיבים. ראה איור 3. תמונת סיבים מאשרת כי סיבים מכוונים באופן אקראי.
בדיקות מכאניות
סיבים חזקים מבחינה מכאנית נדרשים בדרך כלל עבור יישומי הנדסת רקמות שונות. סיבים אלו צריכים לשמור על חוזק וגמישות מספיק תחת לחץ מסוים ותנאים סביבתיים 9. באופן כללי, פיגומים הם רצויים לקיים moduli קרוב לזה של רקמת היעד כדי למנוע מתח מסוכך אפקטים כדי לשמור על חוזק מספיק במהלך in vivo ו / או צמיחת תאים במבחנת 10. מתיחה Tester שימש למדידת מודולוס של יאנג וכוח שבירת הסיבים. מודולוס יאנג (MPA) של PCL / קרטין על יחסים של 100: 00, 90:10, 80:20, ו 70:30 wכפי שנמצאו להיות 10 ± 2, 8 ± 1, 5 ± 1.5, ו -4.5 ± 1.6, בהתאמה 4. בדומה לכך, כוח לשבור (MPA) של PCL / קרטין על יחסים של 100: 00, 90:10, 80:20, ו 70:30 נמצאו 3 ± 1.2, 2 ± 0.5, 1 ± 0.2, ו 1 ± 0.3 4 בהתאמה כפי שניתן לראות בטבלה 1. איור 4 מציג את המגמה גרפי של וריאציה של מודול יאנג לעומת יחסי PCL.keratin. המגמה של עזרי הגרף בהבנה עוד יותר את שיעור ההתארכות השביר.
אפיון מבני מורפולוגי
באיור 5, ספקטרום העברה FTIR עבור nanofibers מרוכבים PCL / קרטין להראות הלהקות 2,950 -1 ס"מ, 1,050 -1 ס"מ, ו 1,240 -1 ס"מ עקב תנודות מתיחה סימטרית של CH 2, CO וקבוצות COC, בהתאמה. שיא קליטת קרבוניל ב 1720 סנטימטר -1 that אופיינית PCL הוא גם 4,11 גלוי. להקות הקליטה (3,286 -1 ס"מ), (3,056 - 3,075 -1 ס"מ), (1,600 - 1,700 -1 ס"מ), (1,480 - 1,580 -1 ס"מ), ו- (1,220 - 1,300 -1 ס"מ) מעידים על קרטין חלבונים. הלהקות כבר מסומנות כ- A אמיד, B, I, II ו- III, בהתאמה.
הלהקות ופסגות נוכח שינוי ספקטרה FTIR עם ריכוזי קרטין גדל ב מורכבת. המראה שלהם מעיד על קיומו והמבנה מבני של שרשרות קרטין, לעומת זאת, את יחסי הגומלין בין הפסגות והלהקות לא לגרום קושי מסוים. לדוגמא, בהווה הלהקה שאני האמיד ב- 1,600 - 1,700 -1 סנטימטר משמש בדרך כלל כדי ללמוד קרטין, לעומת זאת, הלהקה הושחתה במעט על ידי שיא PCL. למרבה המזל, הלהקה האמידה II תספיק להוכיח נוכחות קרטין, קונפורמציה שרשרת קרטין, ואינטראקציות מליטות בין PCL וקבוצות קרטין פונקציונליות.
אינטראקציה תא-סיבים
באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סורק את האינטראקציה תא-סיבים נחקרה. איור 6 מציג את SEM תמונות של תאים פיברובלסטים 3T3 שהיו בתרבית על דגימות nanofiber למשך 24 שעות. ההדבקה של התאים על דגימות nanofiber גלויה ומראה כי filopodia התא נוטה ללכת בעקבות היישור של nanofibers כאשר הם דומים קוטר. Almar הכחול (AB) assay בוצעה על מנת לכמת את הכדאיות של 3T3 תאי הסיבים. AB הוא כימי resazurin. צבע ללא ניאון זו תציב את התאים החיים, המיטוכונדריה reductases מפחית resazurin כדי resorrufin שהוא ורוד ניאון. לא היה הבדל משמעותי ברמות הרעילות של יחסים שונים של PCL / קרטין.
< br /> באיור 1. תמונות של תהליך החילוץ קראטין (א) נוקה שיער אדם לפני החילוץ.; (ב) שיער לאחר מיצוי קרטין; (C) פתרון תמצית קראטין; (ד) אבקת קראטין Lyophilized. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מצלמת איור 2. תמונות הדיגיטליות של electrospun סיבים. תמונות של סיבים מסונתזים של CL / קרטין עם יחסים שונים שנאספו על רדיד אלומיניום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
דואר 3 "src =" / files / ftp_upload / 53,381 / 53381fig3.jpg "/>
תמונות איור 3. SEM של nanofibers PCL / קרטין. (AC) תמונות של nanofibers סובב מפתרונות עם PCL / יחסי קרטין של 70:30, 80:20, ו 90:10 בהתאמה. את ריבועי להראות תמונות בהגדלה גבוהה של כל תמונה SEM המקביל. תמונות SEM (DF) (GI) מייצגים את הסיבי שמוצג בתמונות (AC) לאחר 1 ו -7 שבועות בדיקות שפלות, בהתאמה. הבר מידה את ריבועי מייצג 500 ננומטר (ראה סרגל קנה מידה ב- C תמונה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. גרף של מודולוס לעומת יחסי PCL / קראטין. גרף של ריכוז קרטין לעומת Younמודולוס של g מראה את המגמה הגרפית של וריאציה של מודולוס של יאנג. עזרי קו המגמה בקצב התארכות לשבור הבנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. FTIR ספקטרה של PCL / nanofibers קרטין עם יחסים שונים. הספקטרום מאשרת את מליטה של PCL כדי קרטין. השיא הגדול הנמדד 1,722 -1 סנטימטרים מסכים עם מדידות בסיסיות רמת להקת קליטת PCL והיא גלויה כל הספקטרום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. תמונות SEM מציג במורפולוגיה של 3T3 תאים פיברובלסטים זרע על PCL / קרטין nanofiber ממברנה. תמונות A, B ו- C לייצג את קרטין PCL / עם יחס של 90/10, 80/20, 70/30 ו, בהתאמה. תמונות (א '), (ב'), ו (ג ') הן תמונות בהגדלה גבוהה יותר של (א), (ב) ו- (ג), בהתאמה. את האזורים הכהים על התמונות לציין את המיקום של כל תאים פיברובלסטים המצורפת על גבי וברחבי הטופוגרפיה nanofiber. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| יחסים | מודולוס של יאנג (MPA) | כוח חוזק (MPA) |
| 100/0 | 10 ± 2 | 3 ± 1.2 |
| 90/10 | 8 ± 1 | 2 ± 0.5 |
| 80/20 | 5 ± 1.5 | 1 ± 0.2 |
| 70/30 | 4.5 ± 1.6 | 1 ± 0.3 |
לוח 1. תכונות מכניות של PCL / סיבים קראטין
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפקת קרטין מ שערת אדם הושגה בהצלחה. החומצה peracetic פעל כסוכן חמצון על שיער אדם, המאפשר קרטין להיעקר ידי טריס הבסיס. הפקת אבקת קראטין היה בקנה מידה קטן בשל העובדה שהדבר נעשה רק למטרות מחקר. הליך זה כבר הוקמה בשנת בתעשייה עבור ייצור בקנה מידה גדול. מטרת חילוץ קרטין בקנה המידה הקטנה הייתה לשלוט זיהום, השתנות יצוו, וחסכנות.
מיצוי קרטין הוא צעד ההגבלה של הליך זה. התשואה של אבקת קראטין היא נמוכה מאוד, 0.7 - 2%. 20g של שיער אדם הניב 0.14 - קרטין 0.4 גרם. עוד שלב קריטי בייצור סיבי electrospun מגבש פתרון מתאים electrospinning. קראטין פוזר בקלות במים DI, אולם לפי electrospinning, פתרון קרטין / מים לא לגרום להיווצרות סיבים. כדי לספק את מ 'ההכרחיאינטראקציות olecular ליצור nanofibers קופולימר הוצגו הפתרון. PCL מומס TFE, היה מסוגל לקיים אינטראקציה חזקה יותר עם קרטין דרך מליטה מימן. TFE היה אחראי במידה רבה ליציבות של מתחמי קופולימר בגלל אלקטרושליליות שלה וההתנהגות חומצי.
ערבוב הפתרון קרטין עם הפתרון PCL אתגרים חדשים בשל העובדה כי ידוע PCL להידרופוביים בעוד קרטין ידוע להיות הידרופילי. ככל שאנו הגדלנו את היחס של קרטין זה היה קשה להשיג את התערובת הומוגנית. בעיה זו נפתרה על ידי הוספת ירידת פתרון קרטין חכמה פתרון PCL, ו vortexing אותו באופן ידני למשך 30 דקות.
SEM תמונות להראות מורפולוגיה משטח מצוינת כי הוא אידיאלי עבור גדילת תא תפוצה. תוצאות FTIR ההשוואתיות להפגין miscibility טוב בין PCL ו קרטין בסיבי electrospun. זה יכול להיות בגלל b מימן מולקולארייםonding בין PCL ו קרטין. גורם נוסף הוא המהירות שבה סיבי electrospun לחזק למנוע צבירה PCL בתערובת. שלמויות מבניים מכאניות שתיגרמנה האינטראקציות מולקולריות בין PCL ו קרטין, מה שהופך את החומר המתאים ליישומי רפואה רגנרטיבית. סיבי electrospun אלה נמצאו כבעלי moduli הצעיר לסגור לזה של רקמות ילידים. מבחינה מכאנית סיבים חזקים הוא מסוגל לתמוך הידבקות תא ושגשוגם. Nanofibers PCL / קרטין הציג אחידות טובה, שלמות מבנית, תכונות מכאניות מתאימות, ותאימות הסלולר. מודול יאנג (MPA) עבור PCL / קרטין על היחסים של 100: 00, 90:10, 80:20, ו 70:30 נמצא 10 ± 2, 8 ± 1, 5 ± 1.5, ו -4.5 ± 1.6, בהתאמה . Moduli ירד כיחס קרטין הוסיף מוגבר. הידבקות ובחלוקה של תאים על סיבי PCL / קרטין מאשרות כי סיבים אינם רעילה ולספק תמיכה לצמיחת תאים.הגידול filopodia לאורך nanofibers מצביע אינטראקציה חיובית בין פיברובלסטים ואת סיבי PCL / קרטין.
טכניקת Electrospinning שמשה בהצלחה לסנתז את PCL / nanofibers המבוסס קרטין. טכניקה זו, בניגוד לשיטות הקיימות, הוכיחה להיות אמין וחסכוני ואף עלולים לשמש בייצור nanofiber בקנה מידה גדול. ממחקר זה, אנו מגיעים למסקנה כי PCL / קראטין מבוסס פיגומים nanofibrous מרוכבים יש פוטנציאל לשמש עבור יישומים ביו ו ECM טבעי לחקות עבור יישומים הנדסת רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות הקרן הלאומית למדע דרך מרכז מחקר הנדסי Biomaterials מהפכה מתכתיים (ERC-0,812,348) וחינוך לתואר ראשון ננוטכנולוגיה (EEC 1,242,139) בבקשה שישתתף במימון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Hair | Obtained from Local Barber Shop in Greensboro | ||
| Peracetic acid | Sigma Aldrich | ||
| PCL (e-caprolactone polymer) | Sigma Aldrich | 502-44-3 | Mn 70-90 kDa |
| Trifluoroethanol (TFE) | Sigma Aldrich | 75-89-8 | |
| Tris Base (TrizmaTM Base Powder) | Sigma Aldrich | >99.9% crystalline | |
| Hydrochloric Acid | Fischer Scientific | A144C-212 Lot 093601 | Waltham, MA |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | Sarasota, FL | |
| Cellulose membrane | Sigma Aldrich | 12 - 14 kDa molecular cut off | |
| optical microscope | Olympus BX51M | BX51M | Japan |
| scanning electron microscope | Hitachi SU8000 | SU8000 | Japan |
| Table-Top Shimadzu machine | North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series | AGS-X Series | Columbia, MD |
| Fourier transform infrared spectroscopy | Bruker Tensor 2 Instrument | Billerica, MA | |
| Microcal Origin software | Northampton, MA | ||
| X-ray diffraction (XRD) | Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer | Madison, WI | |
| Fibroblast 3T3 cell | American Tissue Type Culture Collection | Manassas, VA | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM | Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Spectra max Gemini XPS microplate reader | Molecular Devices | Sunnyvale, CA | |
| Student- Newman-Keuls post hoc test | SigmaPlot 12 software |
References
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).
- Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications. J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).
- Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence. Biochem J. 236, 705-712 (1986).
- Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata. J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).
- Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds. Tissue E. 6, 605-617 (2000).
- Fortin, M. -J.
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue E. 7, 679-689 (2001).
- Bhattarai, N., et al. Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications. Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).
