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Bioengineering

बायोमेडिकल इंजीनियरिंग के लिए केरातिन आधारित nanofiber के संश्लेषण

Published: February 7, 2016 doi: 10.3791/53381
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Chemical, Biological and Bioengineering, North Carolina A&T State University, 2NSF ERC for Revolutionizing Metallic Biomaterials, North Carolina A&T State University

Summary

Electrospun nanofibers एक उच्च सतह क्षेत्र अनुपात, उत्कृष्ट यांत्रिक अखंडता वजन, और सेल के विकास और प्रसार का समर्थन किया है। ये nanofibers जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। यहाँ हम केरातिन / PCL nanofibers बनाना, electrospinning तकनीक का उपयोग कर, और ऊतक इंजीनियरिंग में संभव अनुप्रयोगों के लिए फाइबर की विशेषताएँ।

Abstract

Electrospinning, अपनी बहुमुखी प्रतिभा और विभिन्न क्षेत्रों में अनुप्रयोगों के लिए क्षमता के कारण, अक्सर nanofibers निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है। इन झरझरा nanofibers का उत्पादन उनके अद्वितीय physiochemical गुणों के कारण महान ब्याज की है। यहाँ हम पाली (ε-caprolactone) युक्त केरातिन (पीसीएल) nanofibers (यानी, PCL / केरातिन समग्र फाइबर) के निर्माण पर प्रकाश डालेंगे। जल घुलनशील केरातिन पहले मानव बाल से निकाला और विभिन्न अनुपात में पीसीएल के साथ मिलाया गया था। पीसीएल / केरातिन के मिश्रित समाधान के लिए एक प्रयोगशाला की स्थापना का उपयोग कर डिजाइन किया गया electrospinning nanofibrous झिल्ली में तब्दील हो गया था। फाइबर आकृति विज्ञान और प्राप्त nanofiber के यांत्रिक गुणों मनाया और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और तन्य परीक्षक का उपयोग करके मापा गया था। इसके अलावा, nanofiber की degradability और रासायनिक गुणों FTIR द्वारा अध्ययन किया गया। SEM छवियों विभिन्न रचनाओं के PCL / केरातिन फाइबर के लिए वर्दी सतह आकृति विज्ञान दिखाया। ये PCL / keratin फाइबर भी इस तरह के यंग मापांक और विफलता के बिंदु के रूप में उत्कृष्ट यांत्रिक गुणों से पता चला है। Fibroblast कोशिकाओं देते हैं और इस प्रकार पैदा करना अच्छा सेल व्यवहार्यता साबित करने में सक्षम थे। ऊपर चर्चा की विशेषताओं के आधार पर, हम दृढ़ता से बहस कर सकते हैं कि प्राकृतिक और सिंथेटिक पॉलिमर के मिश्रित nanofibers समग्र सामग्री है कि विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का एक उत्कृष्ट विकास का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

Introduction

Electrospinning बहुलक nanofibers प्राप्त करने का एक प्रचलित पद्धति के रूप में मान्यता प्राप्त है। फाइबर एक nanoscale पर उत्पादन किया जा सकता है और फाइबर गुण अनुकूलन कर रहे हैं 1। इन घटनाओं और Electrospun nanofibers की विशेषताओं बायोमेडिकल इंजीनियरिंग में अपने आवेदन के लिए विशेष रूप से दिलचस्प हो गया है विशेष रूप से ऊतक इंजीनियरिंग में। Electrospun nanofibers बाह्य मैट्रिक्स के लिए समानता के अधिकारी है और इस तरह कोशिका आसंजन, प्रवास और प्रसार को बढ़ावा देने के 2। बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) को यह समानता के कारण, Electrospun फाइबर घाव ड्रेसिंग, दवा वितरण में सहायता करने के लिए सामग्री के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस तरह के जिगर, हड्डी, दिल, और मांसपेशियों के ऊतकों के लिए 3 के रूप में इंजीनियरिंग।

सिंथेटिक और प्राकृतिक मूल के विभिन्न पॉलिमर की एक किस्म के विभिन्न बायोमेडिकल इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए 4 Electrospun तंतुओं को बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हाल ही में वहाँ में बढ़ रहा हैसिंथेटिक और प्राकृतिक पॉलिमर 4 सम्मिश्रण द्वारा समग्र nanofibers के विकास में ब्याज। इन रचनाओं में अंतिम उत्पादों को आम तौर पर यांत्रिक, जबकि भी प्राकृतिक बहुलक से जैविक संकेतों और संपत्तियों को गोद लेने के सिंथेटिक बहुलक के साथ जुड़े शक्ति वारिस।

इस प्रयोग में, PCL और केरातिन प्रस्तुत कर रहे हैं के रूप में सिंथेटिक और प्राकृतिक पॉलिमर एक समग्र nanofiber के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। केरातिन एक प्राकृतिक बहुलक है कि बाल, ऊन और नाखूनों में पाया जाता है। यह कई अमीनो एसिड के अवशेष शामिल हैं; उल्लेखनीय ब्याज की सिस्टीन 4,5 है। आदर्श रूप में एक स्वाभाविक रूप से बहुलक, biorenewable biocompatible और biodegradable होगा। जबकि यह भी biomaterials यह 6 में शामिल किया गया है करने के लिए सेल प्रसार और लगाव बढ़ाने केरातिन इन विशेषताओं के सभी तीन के पास।

पॉलिकैप्रोलैक्टोन (पीसीएल) एक resorbable, सिंथेटिक बहुलक है कि में महत्वपूर्ण हैऊतक इंजीनियरिंग 4। इस बहुलक पहले इसकी संरचनात्मक और यांत्रिक स्थिरता के लिए प्रशंसा की गई है, हालांकि, यह सेल समानता का अभाव है और एक लंबी गिरावट की दर दर्शाती है। पीसीएल के हाइड्रोफोबिक प्रकृति की संभावना सेल समानता 7 की कमी के लिए जिम्मेदार है। हालांकि, PCL अन्य पॉलिमर के साथ अत्यधिक विलेयशील किया जा रहा द्वारा अपनी सीमाओं के लिए बनाता है। एक PCL / केरातिन समग्र पीसीएल के यांत्रिक गुणों का प्रदर्शन और केरातिन के जैविक गुणों को शामिल, यह विभिन्न जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए एक आदर्श विकल्प बनाने चाहिए।

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Protocol

सभी प्रोटोकॉल अनुसंधान के अनुपालन और नैतिकता के उत्तरी केरोलिना एक एंड टी स्टेट यूनिवर्सिटी के कार्यालय के दिशा निर्देशों का पालन करती है।

1. केरातिन निकालना 4 के लिए रासायनिक तैयारी

  1. एक धूआं हुड के तहत 2% wt / खंड peracetic एसिड समाधान (पीए) के 1000 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, विआयनीकृत (डीआई) पानी की 980 मिलीलीटर के लिए peracetic एसिड के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. 100 मिमी Tris आधार समाधान (टीबीएस) के 1000 मिलीलीटर की तैयारी करने के लिए, डि पानी के 1000 मिलीलीटर के लिए Tris आधार के 12.2 ग्राम जोड़ें और हलचल जब तक पूरी तरह से भंग कर दिया।
  3. डि पानी की 30 मिलीलीटर में केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड की 4 मिलीलीटर गिरने से एक धूआं हुड में पतला हाइड्रोक्लोरिक एसिड के घोल (दास) तैयार करें।
  4. मानव बाल की कतरनों कि रासायनिक उपचार नहीं किया गया है या बदल के लगभग 20 ग्राम की खरीद। बाल किसी भी हद हो सकता है।
  5. बालों को अच्छी तरह धो लें, हाथ से, गर्म पानी और साबुन के साथ। अंतिम कुल्ला के लिए विआयनीकृत (डीआई) पानी का प्रयोग करें।
  6. एक 80 डिग्री सेल्सियस ओ में दो 600 मिलीलीटर बीकर में बाल और जगह डाल1 घंटे के लिए उपक्रम।
  7. बीकर के नीचे से तरल निकास और ओवन में वापस जगह जब तक बाल पूरी तरह से सूखा है।
  8. फूट डालो 600 मिलीलीटर बीकर के बीच समान रूप से बालों सूखे, प्रत्येक बीकर में बालों की 10 ग्राम रखकर। बाल अधिक से अधिक 500 मिलीलीटर को भरने के लिए अनुमति न दें।
  9. प्रत्येक बालों के सभी को कवर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है बीकर में पीए की 500 मिलीलीटर डालो। parafilm और 12 घंटे के लिए दुकान के साथ बीकर कवर।

2. केरातिन निकालें समाधान की तैयारी

  1. पीए एक 500 माइक्रोन चलनी का उपयोग करने से बाल अलग करें। एक अलग कंटेनर में अपशिष्ट पीए लीजिए। डि पानी के साथ अच्छी तरह से बाल कुल्ला किसी भी बचे हुए पीए हटा दें।
  2. एक 500 मिलीलीटर फ्लास्क में rinsed बाल रखें। कुप्पी में टीबीएस के 400 मिलीलीटर डालो, यकीन है कि बाल कवर किया जाता है बना रही है। एक मिलाते हुए स्नान 38 डिग्री सेल्सियस, 1 घंटे के लिए 65 rpm के लिए सेट में रखें कुप्पी।
  3. 1 घंटे के बाद,, स्नान झटकों से हटाने और तरल डालना (KES) केरातिन निकासी के समाधान के लगभग 400 मिलीलीटर, मैंएक 1000 मिलीलीटर बीकर Nto।
  4. यह सुनिश्चित करना है कि बालों को कवर किया और 1 घंटे के लिए मिलाते हुए स्नान में वापस जगह है, जो बालों से युक्त कुप्पी में डि पानी की 400 मिलीलीटर डालो। झटकों से स्नान कुप्पी निकालें और पहले से एकत्र KES के साथ 1000 मिलीलीटर बीकर में केन्याई की शेष 400 मिलीलीटर डालना। बाल की जरूरत नहीं रह जाता है और कुप्पी से बाहर फेंक दिया जा सकता है और त्याग निकटतम कचरा गोदाम में।

3. केरातिन निकालें समाधान की एकाग्रता

  1. आसुत जल के साथ शीर्ष पंक्ति को rotodistiller स्नान भरें और 90 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है। 200 rpm के लिए रोटेशन की गति सेट करें। शीतलक चिलर-पंप पर बारी और -10 डिग्री सेल्सियस के लिए निर्धारित किया है।
  2. एक पीएच मीटर का उपयोग KES के पीएच की निगरानी के लिए, एक पिपेट का उपयोग धीरे-धीरे एक पीएच 7.0 तक पहुँचने तक केन्याई करने के लिए 1 मिमी दास जोड़ने के लिए। धीरे-धीरे हिलाओ के रूप में समाधान जोड़ा जाता है।
  3. के बारे में पूरी तिमाही तक 500 मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में निष्प्रभावी केन्याई डालो। निर्माता के अनुसार शराब खींचनेवाला भागो1.25 घंटे के लिए प्रोटोकॉल।
    1. केन्याई के सभी जब तक दोहराएँ कदम 3.3 आसुत किया गया है। सुनिश्चित करें कि कुप्पी कसकर जुड़ा हुआ है।

4. केरातिन निकालें समाधान की डायलिसिस

  1. केन्याई समाधान 12 अलग 14 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में समान रूप से डालो। 10 मिनट के लिए 1050 XG पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
  2. एक साफ बीकर में centrifuged केन्याई डालो, एकत्र मलबे से दूर डालना सुनिश्चित कर रही है। दोहराएँ जब तक केन्याई के सभी centrifuged किया गया है।
  3. भरें एक 2000 मिलीलीटर डि पानी के साथ स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर।
  4. 24 इंच के लिए डायलिसिस ट्यूबिंग सेल्यूलोज झिल्ली कट, और ट्यूबिंग के एक छोर क्लिप यह बंद आयोजित करने का।
  5. डि पानी के सिलेंडर में ट्यूब की लंबाई डुबकी इसे और अधिक लचीला और खोलने के लिए आसान बनाने के लिए।
  6. डायलिसिस ट्यूबिंग सेल्यूलोज झिल्ली के गैर काटा अंत खोलें और धीरे-धीरे ट्यूबिंग में centrifuged केन्याई समाधान के 60 मिलीलीटर डालना। ट्यूबिंग के इस अंत बंद करने के लिए एक और क्लिप का प्रयोग करें।
  7. di रखोडि पानी के 2,000 मिलीलीटर सिलेंडर में alysis ट्यूब और 24 घंटे के लिए बैठने के लिए अनुमति देते हैं। हर 3 से 4 घंटा के सिलेंडर में डि पानी बदलें।
  8. 24 घंटा अवधि के बाद, छाया हुआ जार में dialyzed केन्याई समाधान खाली है, 24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में शीर्ष पर अंतरिक्ष और जगह छोड़ने के लिए सुनिश्चित किया जा रहा है।

5. केरातिन निकालें समाधान के Lyophilization

  1. -86 डिग्री सेल्सियस के लिए lyophilizer सेट करें।
  2. फ्रीजर से जमे हुए केन्याई युक्त जार निकालें, जार के बंद टोपियां ले, और उन्हें फ्रीज ड्रायर ampoules में जगह है। ampoules पर जवानों की जगह और 0.133 मिलीबार की एक वैक्यूम दबाव बनाने के लिए घुंडी बारी है। , लगभग 48 घंटे के लिए नमूने Lyophilize तक नमी के सभी चला गया है।

6. Electrospinning समाधान की तैयारी (10% wt केरातिन समाधान)

  1. lyophilizer से केरातिन पाउडर निकालें और यह वजन।
  2. केरातिन पाउडर के लिए डि पानी मे एक 10% वजन / वजन बनाने के लिएकेरातिन समाधान।

7. 10% WT पीसीएल समाधान की तैयारी

  1. और trifluoroethanol (TFE) - PCL (90 केडीए ε-caprolactone बहुलक, MN 70) प्राप्त करते हैं। सरगर्मी हे / एन द्वारा TFE में वजन पीसीएल द्वारा एक 10% को तैयार है और एक सजातीय मिश्रण प्राप्त करते हैं।

8. केरातिन / PCL समाधान की तैयारी

  1. 10% wt पीसीएल समाधान पहले से तैयार है और 10% wt केरातिन समाधान प्राप्त करते हैं। पीसीएल समाधान बूंद आदेश 10 मिलीलीटर PCL / 90:10, 80:20, 70:30 के केरातिन समाधान है, और 60:40 के अनुपात में बनाने के लिए बुद्धिमान में केरातिन जोड़ें।
  2. electrospinning पहले PCL / केरातिन समाधान का एक सजातीय मिश्रण प्राप्त करने के लिए एक vortexer का प्रयोग करें।

9. Electrospun पीसीएल का उत्पादन / केरातिन फाइबर

  1. एक 10 मिलीलीटर डिस्पोजेबल एक 0.5 मिमी व्यास प्लास्टिक ट्यूब के साथ लगे सिरिंज में पीसीएल / केरातिन समाधान के लगभग 8 मिलीलीटर रखें। एक सिरिंज पंप प्रवाह की दर जहां 2.5 मिलीलीटर / घंटा होना तय है में सिरिंज रखें।
  2. नमूना चलाने से पहले लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कलेक्टर ड्रम। सुनिश्चित करें कि एल्यूमीनियम पन्नी दोनों छोर पर लेबलिंग टेप लगाने से स्थिर है।
    नोट: फाइबर एल्यूमीनियम पन्नी पर बनेगी (2 चित्र देखें), आरटी पर फाइबर कवर पन्नी की दुकान।

10 PCL / केरातिन Nanofibers की यांत्रिक विश्लेषण

  1. 60 मिमी में 8 मिमी से नमूना कट। डिजिटल माइक्रोमीटर का उपयोग करके मोटाई रिकॉर्ड करने के लिए सुनिश्चित करें। प्रत्येक रचना के लिए तैयार है, पांच नमूने का उपयोग करें।
  2. तन्यता परीक्षक में 60 x 8 मिमी नमूना संलग्न। नमूना संलग्न करने के लिए एक कस्टम डिजाइन नमूना धारक का प्रयोग करें। नमूना धारकों के बीच नमूना है जो एक सूचकांक कार्ड से डबल का उपयोग किया जाता सैंडविचपक्षीय टेप। 10 मिमी / मिनट की एक विस्थापन दर के साथ 10 एन लोड सेल को लागू करें।
    नोट: नमूना धारक 38 मिमी से 50 मिमी की एक आंतरिक खिड़की के साथ 40 मिमी से 62 मिमी होने के लिए डिजाइन किया गया था।
  3. रिकार्ड विस्तार और सॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल के अनुसार सॉफ्टवेयर के माध्यम से लोड मूल्यों।
  4. नमूने का परीक्षण के क्षेत्र द्वारा बल को विभाजित करके तनाव की गणना। अगले, प्रारंभिक लंबाई से लंबाई में परिवर्तन को विभाजित करके तनाव की गणना।
  5. एक्स अक्ष में तनाव मूल्य इसी के लिए y अक्ष में तनाव साजिश रचने के द्वारा तनाव तनाव की अवस्था उत्पन्न करता है।
  6. रेखीय क्षेत्र जहां ढलान लोच के मापांक के बराबर से यंग मापांक गणना। 0.2% तनाव में ऑफसेट ले रही है और रेखीय क्षेत्र की अवस्था के लिए एक समानांतर रेखा खींचने से तनाव तनाव साजिश से तन्यता ताकत का निर्धारण करते हैं।
  7. पहले से विश्लेषण सॉफ्टवेयर 8 का उपयोग विचरण का एक तरह से विश्लेषण का उपयोग कर तीन प्रतियों में प्राप्त यांत्रिक डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं। पी मूल्यों <0.05 हमसांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना रहे हैं।

11. भूतल आकृति विज्ञान और संरचनात्मक लक्षण वर्णन

  1. 15 केवी की वोल्टेज और 5 μA की वर्तमान में तेजी Electrospun फाइबर की आकृति विज्ञान निरीक्षण करने के मानकों के साथ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) का प्रयोग करें।
    1. SEM के साथ इमेजिंग के लिए पहले, फाइबर का एक 2 सेमी 2 खंड में कटौती और तांबे टेप का उपयोग कर एक SEM मंच को देते हैं। एक सोने की परत लगभग 11 एनएम मोटी बनाने के लिए 1 मिनट और 30 सेकंड के लिए 15 मा पर धूम coater और सोने के साथ कोट के अंदर चरण रखें। SEM के कक्ष में नमूना लोड। फाइबर नमूनों का निरीक्षण करें।
  2. फूरियर का उपयोग अवरक्त स्पेक्ट्रोस्कोपी (FTIR) को बदलने PCL और केरातिन के बीच रासायनिक संबंध को चिह्नित करने के लिए। Electrospun nanofiber झिल्ली के 2 सेमी 2 खंड एक चुंबकीय धारक में रखें और परीक्षण से पहले शुष्क हवा के साथ प्रणाली शुद्ध करना। 200 स्कैन के लिए स्पेक्ट्रा प्राप्त और स्टेशन का उपयोग कर स्पेक्ट्रा विश्लेषणसॉफ्टवेयर प्रोटोकॉल के अनुसार ndard सॉफ्टवेयर।
  3. मानक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्पेक्ट्रम विश्लेषण करते हैं और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार nanofiber में से प्रत्येक के अनुपात के triplicates का उपयोग करें।

12. सेल फाइबर बातचीत का अध्ययन

  1. 16 मिमी 2 नमूने में फाइबर कट। एक biocompatible, सिलिकॉन आधारित गोंद का प्रयोग एक 12 मिमी व्यास के साथ coverslips करने के लिए प्रत्येक नमूना ठीक करने के लिए।
  2. कवर पर्ची के पीछे करने के लिए फाइबर नमूना के एक छोर गोंद, coverslip के आसपास नमूना लपेट, तो कवर पर्ची के पीछे करने के लिए नमूना के मुक्त अंत गोंद के रूप में अच्छी तरह से, केवल पर्ची के साथ कवर के ऊपर छोड़ने फाइबर नमूना।
  3. 24 अच्छी तरह से थाली में फाइबर नमूने रखें। 1 घंटे के लिए 80% इथेनॉल में डुबो कर नमूने जीवाणुरहित।
  4. डि पानी का उपयोग कर नमूने इथेनॉल से कुल्ला। फिर, पिपेट नमूने पर बेसल मध्यम 2 मिलीलीटर, पूरे नमूना कवर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। 5 मिनट के बाद के माध्यम से निकालें।
  5. fibroblast 3 का प्रयोग करेंT3 कोशिकाओं फाइबर नमूने बीज के लिए। एंटीबायोटिक दवाओं और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) तो साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में कोशिकाओं को निलंबित लगभग 62,000 कोशिकाओं DMEM के 1 मिलीलीटर प्रति / 2 सेमी देखते हैं कि।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से थाली सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक फाइबर नमूना लगभग 62,000 कोशिकाओं / 2 सेमी के साथ कवर किया जाता है में 3T3 सेल युक्त DMEM समाधान के 1 मिलीलीटर गिरा। 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा और 5% सीओ 2 के लिए अच्छी तरह प्लेटें सेते हैं। नोट: उपयोग 5% सीओ 2 क्योंकि उस स्तर आम तौर पर दिन के लिए शारीरिक सीमा में सेल मीडिया के पीएच बनाए रख सकते हैं।

Nanofiber मैट्रिक्स 13. गिरावट

  1. कट वर्ग लगभग 30 मिमी x 30 मिमी में पीसीएल / केरातिन nanofiber झिल्ली सूख गया।
  2. एक 10 मिनट ऊष्मायन अवधि के लिए 80% शराब के साथ 900 मिमी 2 नमूने जीवाणुरहित और डि पानी से अच्छी तरह धो लें। पीबीएस, पीएच 7.5 से 15 मिलीलीटर नमूने सेते 37 डिग्री सेल्सियस पर। buf बदलेंहर 3 दिन fer।
  3. निर्दिष्ट अंतराल पर समाधान के बाहर झिल्ली लो, 1 सप्ताह और 7 सप्ताह, और डि पानी से कुल्ला।
  4. झिल्ली नमूने फ्रीज ड्रायर ampoules में रखें। ampoules पर जवानों की जगह और एक निर्वात पैदा करने के लिए घुंडी बारी है। 24 घंटे के लिए Lyophilize, जब तक पूरी तरह से सूखे।
  5. एक SEM चरण तांबे टेप का उपयोग करने के लिए सूखे नमूना देते हैं। 1 मिनट और 30 सेकंड के लिए 15 मा पर धूम coater और सोने के साथ कोट के अंदर चरण रखें।
  6. SEM के कक्ष में नमूना लोड। 1.5 केवी और 5 μA वर्तमान की एक त्वरक वोल्टेज पर फाइबर के नमूनों का निरीक्षण करें।

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Representative Results

फाइबर आकारिकी
फाइबर की SEM छवियों सभी फाइबर रचनाओं के लिए प्राप्त किया गया। 3 आंकड़ा देखें। फाइबर छवि की पुष्टि की है कि फाइबर बेतरतीब ढंग से उन्मुख होते हैं।

यांत्रिक परीक्षण
यंत्रवत् मजबूत फाइबर आम तौर पर विभिन्न ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं। इन तंतुओं कुछ तनाव और पर्यावरण की स्थिति 9 के तहत पर्याप्त शक्ति और लचीलापन बनाए रखने चाहिए। आम तौर पर, scaffolds लक्ष्य ऊतक के करीब किसी भी तनाव प्रभाव से बचने के लिए परिरक्षण moduli है और vivo में के दौरान और / या इन विट्रो सेल के विकास को 10 में पर्याप्त शक्ति बनाए रखने के लिए वांछित हैं। तन्यता परीक्षक यंग मापांक और फाइबर की ताकत को तोड़ने को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। युवा मापांक (एमपीए) के पीसीएल / 100 के अनुपात में केरातिन: 00, 90:10, 80:20, 70:30 और wके रूप में 10 ± 2, 8 ± 1, 5 ± 1.5, और 4.5 ± 1.6 क्रमश: 4 हो पाया। इसी तरह, ताकत को तोड़ने (एमपीए) के पीसीएल / 100 के अनुपात में केरातिन: 00, 90:10, 80:20, 70:30 और 3 ± 1.2, 2 ± 0.5, 1 ± 0.2 और 1 ± 0.3 होना पाया गया क्रमश: 4 टेबल के रूप में देखा 1। चित्रा 4 दिखाता बनाम PCL.keratin अनुपातों यंग मापांक की भिन्नता की चित्रमय प्रवृत्ति। आगे तोड़कर बढ़ाव दर को समझने में एड्स ग्राफ में ट्रेंडलाइन।

स्ट्रक्चरल और रूपात्मक विशेषता
चित्रा 5 में, PCL / केरातिन समग्र nanofibers के लिए FTIR संप्रेषण स्पेक्ट्रा 2,950 सेमी -1, 1050 सेमी -1, और 1,240 सेमी -1 सीएच 2 की विषम खींच कंपन, सीओ और COC समूहों, क्रमशः के कारण बैंड पर दिखा। 1,720 पर सेमी -1 Tha कार्बोनिल अवशोषण शिखरटी पीसीएल के लक्षण भी दिखाई दे रहा है 4,11 है। पर अवशोषण बैंड (3286 सेमी -1), (3,056 - 3075 सेमी -1), (1600 - 1700 सेमी -1), (1,480 - 1,580 सेमी -1) और (1,220 - 1,300 सेमी -1) केरातिन का संकेत कर रहे हैं प्रोटीन। बैंड एमाइड ए, बी, मैं, द्वितीय, और तृतीय, क्रमशः के रूप में चिह्नित किया गया है।

बैंड और समग्र चोटियों में वृद्धि हुई केरातिन सांद्रता के साथ FTIR स्पेक्ट्रा परिवर्तन में मौजूद। उनकी उपस्थिति उपस्थिति और केरातिन चेन के संरचनात्मक रचना को इंगित करता है, तथापि, चोटियों और बैंड के बीच बातचीत में कुछ कठिनाई का कारण था। उदाहरण के लिए, 1600 में एमाइड मैं बैंड वर्तमान - 1700 सेमी -1 आम तौर पर केरातिन अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हालांकि, बैंड थोड़ा पीसीएल चोटी से विकृत है। सौभाग्य से, एमाइड द्वितीय बैंड केरातिन उपस्थिति, केरातिन श्रृंखला रचना, और PCL और बीच संबंध बातचीत साबित करने के लिए पर्याप्त होगाकेरातिन कार्य समूहों।

सेल-फाइबर इंटरेक्शन
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग सेल फाइबर बातचीत का अध्ययन किया गया था। चित्रा 6 3T3 fibroblast कोशिकाओं है कि 24 घंटे के लिए nanofiber नमूनों पर सुसंस्कृत थे के SEM छवियों से पता चलता। nanofiber नमूने के लिए कोशिकाओं के आसंजन दिखाई दे रहा है और पता चलता है कि सेल filopodia nanofibers के संरेखण का पालन करते हैं, जब वे व्यास में समान हैं। Almar ब्लू (एबी) परख फाइबर में 3T3 कोशिकाओं की व्यवहार्यता यों करने के लिए किया गया था। एबी रासायनिक resazurin है। इस गैर फ्लोरोसेंट रंजक जीवित कोशिकाओं में प्रवेश करती है, mitochondrial रिडक्टेजों resorrufin करने के लिए जो गुलाबी और फ्लोरोसेंट है resazurin कम कर देता है। वहाँ PCL / केरातिन के विभिन्न अनुपात की विषाक्तता के स्तर में महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

आकृति 1 < br /> चित्रा 1. केरातिन निष्कर्षण प्रक्रिया के चित्र (ए) मानव बाल निकासी से पहले साफ। (बी) केरातिन निकासी के बाद बाल; (सी) केरातिन निकालने समाधान; (डी) Lyophilized केरातिन पाउडर। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
Electrospun फाइबर की चित्रा 2. डिजिटल कैमरा चित्र। एल्यूमीनियम पन्नी पर एकत्र अलग अनुपात के साथ सीएल / केरातिन का संश्लेषित फाइबर के रूप में की छवियाँ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3. SEM PCL / केरातिन Nanofibers की छवियाँ। (एसी) nanofibers PCL / 70:30, 80:20, 90:10 और क्रमश: केरातिन अनुपात के साथ समाधान से काता की छवियों। insets प्रत्येक इसी SEM छवि के उच्च बढ़ाई छवियों को दिखाने के। SEM छवियों (डीएफ) और (सैनिक) क्रमश: 1- और 7 सप्ताह गिरावट परीक्षणों के बाद फाइबर छवियों (एसी) में दिखाया गया है प्रतिनिधित्व करते हैं। Insets में बड़े पैमाने बार 500 एनएम (छवि सी में पैमाने पर पट्टी देखें) का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. बनाम PCL / केरातिन अनुपात मापांक का ग्राफ़। यूँ बनाम केरातिन एकाग्रता की एक ग्राफजी मापांक यंग मापांक की भिन्नता की चित्रमय प्रवृत्ति से पता चलता। समझ तोड़ने बढ़ाव दर में ट्रेंडलाइन एड्स। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. FTIR पीसीएल अलग अनुपात के साथ / केरातिन Nanofibers की स्पेक्ट्रा। केरातिन स्पेक्ट्रम के लिए पीसीएल के संबंधों की पुष्टि करता है। प्रमुख शिखर 1,722 सेमी पर मापा -1 पीसीएल अवशोषण बैंड के मानक बुनियादी माप के साथ सहमत हैं और सभी स्पेक्ट्रा में दिख रहा है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6 SEM छवियों 3T3 fibroblast कोशिकाओं की आकृति विज्ञान दिखा पीसीएल पर वरीयता प्राप्त / केरातिन nanofiber झिल्ली। छवियाँ ए, बी और सी के साथ क्रमश: 90/10 के अनुपात, 80/20 साथ PCL / केरातिन प्रतिनिधित्व करते हैं, और 70/30,। छवियाँ (ए '), (ख) और (ग') उच्च आवर्धन (बी) (ए) की छवियों, और (सी), क्रमशः रहे हैं। चित्र पर गहरा क्षेत्रों प्रत्येक fibroblast के शीर्ष पर और nanofiber स्थलाकृति भर जुड़ी कोशिकाओं के स्थान का संकेत मिलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपात यंग मापांक (एमपीए) शक्ति तोड़कर (एमपीए)
100/0 10 ± 2 3 ± 1.2
90/10 8 ± 1 2 ± 0.5
80/20 5 ± 1.5 1 ± 0.2
70/30 4.5 ± 1.6 1 ± 0.3

तालिका 1 पीसीएल के यांत्रिक गुण / केरातिन तंतुओं

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Discussion

मानव बाल से केरातिन की निकासी को सफलतापूर्वक हासिल की थी। peracetic एसिड मानव बाल पर एक ऑक्सीकरण एजेंट के रूप में काम किया है, की अनुमति केरातिन Tris आधार से निकाला जाता था। केरातिन पाउडर के उत्पादन तथ्य यह है कि यह केवल अनुसंधान प्रयोजनों के लिए किया था की वजह से छोटे पैमाने पर किया गया था। यह प्रक्रिया पहले से ही बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उद्योग में स्थापित किया गया है। छोटे पैमाने पर केरातिन निकालने के उद्देश्य के संदूषण, बैच परिवर्तनशीलता, और लागत प्रभावशीलता को नियंत्रित करने के लिए था।

केरातिन निष्कर्षण इस प्रक्रिया के सीमित कदम है। केरातिन पाउडर की उपज बहुत कम है, 0.7 - 2%। मानव बाल की 20 ग्राम झुकेंगे 0.14-0.4 जी केरातिन। Electrospun फाइबर के उत्पादन में एक और महत्वपूर्ण कदम एक समाधान electrospinning के लिए उपयुक्त है कि तैयार कर रहा है। केरातिन आसानी से डि पानी में छितरी हुई थी, लेकिन electrospinning पर, केरातिन / पानी के घोल फाइबर गठन में परिणाम नहीं था। आवश्यक मीटर प्रदान करने के लिएolecular बातचीत nanofibers एक copolymer बनाने के लिए समाधान के लिए पेश किया गया था। पीसीएल TFE में भंग, हाइड्रोजन संबंध के माध्यम से केरातिन के साथ और अधिक दृढ़ता से बातचीत करने में सक्षम था। TFE अपनी वैद्युतीयऋणात्मकता और अम्लीय व्यवहार की वजह से copolymer परिसरों की स्थिरता के लिए काफी हद तक जिम्मेदार था।

पीसीएल समाधान के साथ केरातिन समाधान मिश्रण है कि तथ्य यह है कि पीसीएल हाइड्रोफोबिक हो जाता है, जबकि केरातिन हाइड्रोफिलिक हो जाता है की वजह से नई चुनौतियां पेश की। हम केरातिन के अनुपात में वृद्धि हुई है के रूप में यह सजातीय मिश्रण प्राप्त करने के लिए मुश्किल था। यह समस्या केरातिन समाधान बूंद पीसीएल समाधान करने के लिए बुद्धिमान जोड़ने, और 30 मिनट के लिए स्वयं इसे vortexing द्वारा हल किया गया था।

SEM छवियों उत्कृष्ट सतह आकृति विज्ञान है कि सेल के विकास और प्रसार के लिए आदर्श है दिखाते हैं। तुलनात्मक FTIR परिणाम Electrospun फाइबर में PCL और केरातिन के बीच अच्छे miscibility प्रदर्शित करता है। यह आणविक हाइड्रोजन ख की वजह से हो सकता हैपीसीएल और केरातिन के बीच onding। एक और पहलू है जो गति के साथ Electrospun फाइबर मिश्रण में पीसीएल एकत्रीकरण को रोकने जमना है। संरचनात्मक और यांत्रिक अखंडता PCL और केरातिन के बीच आणविक बातचीत द्वारा निरंतर है, पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए सामग्री उपयुक्त बना। ये Electrospun फाइबर युवा moduli देशी ऊतक की है कि बंद पाए गए। यंत्रवत् मजबूत फाइबर कोशिका आसंजन और प्रसार का समर्थन करने में सक्षम है। पीसीएल / केरातिन nanofibers अच्छा एकरूपता, संरचनात्मक अखंडता, उपयुक्त यांत्रिक गुणों, और सेलुलर अनुकूलता का प्रदर्शन किया। 100 के अनुपात में यंग मापांक (एमपीए) PCL / केरातिन के लिए: 00, 90:10, 80:20, 70:30 और 10 ± 2, 8 ± 1, 5 ± 1.5, और 4.5 ± 1.6, क्रमशः होना पाया गया । moduli में कमी आई के रूप में केरातिन के अनुपात में वृद्धि हुई जोड़ा। कोशिका आसंजन और पीसीएल / केरातिन तंतुओं पर प्रसार पुष्टि की है कि फाइबर विषाक्त नहीं कर रहे हैं और कोशिकाओं के विकास के लिए समर्थन प्रदान करते हैं।nanofibers साथ filopodia विकास fibroblasts और पीसीएल / केरातिन फाइबर के बीच बातचीत के अनुकूल इंगित करता है।

Electrospinning तकनीक को सफलतापूर्वक PCL / केरातिन आधारित nanofibers के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस तकनीक को अन्य मौजूदा तरीकों के विपरीत, विश्वसनीय और लागत प्रभावी साबित हो गया है और संभावित बड़े पैमाने पर nanofiber उत्पादन में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस अध्ययन से, हम निष्कर्ष है कि पीसीएल / केरातिन आधारित समग्र nanofibrous scaffolds संभावित जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए नकल प्राकृतिक ईसीएम के लिए इस्तेमाल किया जाना है।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

लेखक समर्थन के वित्तपोषण के लिए क्रांति धातुई biomaterials के लिए इंजीनियरिंग रिसर्च सेंटर (ईआरसी-0,812,348) और नैनो अंडर शिक्षा (ईईसी 1,242,139) के माध्यम से राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Hair  Obtained from Local Barber Shop in Greensboro
Peracetic acid Sigma Aldrich
PCL (e-caprolactone polymer) Sigma Aldrich 502-44-3 Mn 70-90 kDa
Trifluoroethanol (TFE) Sigma Aldrich 75-89-8
Tris Base (TrizmaTM Base Powder) Sigma Aldrich >99.9% crystalline
Hydrochloric Acid Fischer Scientific A144C-212 Lot 093601 Waltham, MA
Kwik-Sil World Precision Instruments Sarasota, FL
Cellulose membrane Sigma Aldrich 12 - 14 kDa molecular cut off
optical microscope Olympus BX51M BX51M Japan
scanning electron microscope Hitachi SU8000 SU8000 Japan
Table-Top Shimadzu machine North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series AGS-X Series  Columbia, MD
Fourier transform infrared spectroscopy Bruker Tensor 2 Instrument  Billerica, MA
Microcal Origin software Northampton, MA
X-ray diffraction (XRD) Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer Madison, WI
Fibroblast 3T3  cell American Tissue Type Culture Collection Manassas, VA
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM Invitrogen Grand Island, NY
Spectra max Gemini XPS microplate reader Molecular Devices Sunnyvale, CA
Student- Newman-Keuls post hoc test SigmaPlot 12 software

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 108 Electrospining Nanofibers केरातिन पॉलिकैप्रोलैक्टोन बायोमेडिकल Biocompatible
बायोमेडिकल इंजीनियरिंग के लिए केरातिन आधारित nanofiber के संश्लेषण
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Thompson, Z. S., Rijal, N. P.,… More

Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. J. Vis. Exp. (108), e53381, doi:10.3791/53381 (2016).

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