Summary
Elektrospunna nanofibrer har en hög ytarea i förhållande till vikten, utmärkt mekanisk integritet, och stödja celltillväxt och proliferation. Dessa Nanofiber har ett brett utbud av biomedicinska tillämpningar. Här fabricera vi keratin / PCL Nanofiber med hjälp av elektrospinning teknik och karakterisera fibrer för möjliga tillämpningar inom tissue engineering.
Abstract
Electro, på grund av dess mångsidighet och möjligheter för tillämpningar inom olika områden, används ofta för att tillverka nanofibrer. Produktionen av dessa porösa Nanofiber är av stort intresse på grund av deras unika fysikalisk-kemiska egenskaper. Här har vi närmare in på tillverkning av keratin som innehåller poly (ε-kaprolakton) (PCL) nanofibrer (dvs PCL / keratin komposit fiber). Vattenlösliga keratin extraherades först av människohår och blandas med PCL i olika förhållanden. Den blandade lösningen av PCL / keratin förvandlades till nanofibrous membran med hjälp av ett laboratorium utformad elektrospinning inrättas. Fiber morfologi och mekaniska egenskaperna hos den erhållna nanofiber observerades och mättes med användning av svepelektronmikroskopi och dragprovare. Dessutom var nedbrytbarhet och kemiska egenskaperna hos den nanofiber studeras med FTIR. SEM bilder visade enhetlig yta morfologi för PCL / keratinfibrer med olika sammansättningar. Dessa PCL / keratin fibrer uppvisade också utmärkta mekaniska egenskaper såsom Youngs modul och misslyckande punkt. Fibroblastceller kunde fästa och föröka sig som styrker god cellviabilitet. Baserat på de egenskaper som diskuterats ovan, kan vi starkt hävda att de blandade Nanofiber av naturliga och syntetiska polymerer kan representera en utmärkt utveckling av kompositmaterial som kan användas för olika biomedicinska tillämpningar.
Introduction
Electro redovisas som en förhärskande metod för att uppnå polymernanofibrer. Fibrerna kan framställas på en nanoskala och de fiber egenskaper är anpassade 1. Denna utveckling och egenskaperna hos elektrospunna Nanofiber har varit särskilt intressant för sina tillämpningar inom medicinsk teknik, särskilt i vävnadsteknik. De elektrospunna Nanofiber har likheter med den extracellulära matrisen och därmed främja celladhesion, migrering och proliferation två. På grund av denna likhet till den extracellulära matrisen (ECM), kan elektrospunna fibrer användas som material för att hjälpa till sårförband, läkemedelstillförsel, och för tekniska vävnader såsom lever, ben, hjärta och muskel 3.
En mängd olika polymerer av syntetiskt och naturligt ursprung har använts för att skapa elektrospunna fibrer för olika biomedicinska tekniska tillämpningar 4. Nyligen har ökat itresse i utvecklingen av kompositnanofibrer genom blandning av syntetiska och naturliga polymerer 4. I dessa kompositioner de slutliga produkterna ärver vanligtvis den mekaniska hållfastheten associerade med den syntetiska polymeren samtidigt anta biologiska signaler och egenskaper från den naturliga polymeren.
I detta experiment, PCL och keratin presenteras som de syntetiska och naturliga polymerer som skall användas för syntesen av en kompositnanofiber. Keratin är en naturlig polymer som finns i hår, ull och naglar. Det innehåller många aminosyrarester; av noterbar intresse är cystein 4,5. Helst ett naturligt förekommande polymer skulle vara biorenewable, biokompatibel och biologiskt nedbrytbar. Keratin besitter alla tre av dessa egenskaper samtidigt öka celltillväxt och fastsättning biomaterial har införlivats i sex.
Polykaprolakton (PCL) är ett resorberbart, syntetisk polymer som är betydande ivävnadsteknik 4. Denna polymer har tidigare hyllats för dess strukturella och mekanisk stabilitet, men saknar det cell affinitet och uppvisar en lång nedbrytningshastighet. Den hydrofoba naturen hos PCL är sannolikt ansvarig för bristen på cellaffinitet 7. Men gör PCL upp för sina begränsningar genom att vara mycket blandbar med andra polymerer. En PCL / keratin komposit bör visa de mekaniska egenskaperna hos PCL och införliva de biologiska egenskaperna av keratin, vilket gör det till ett idealiskt val för olika biomedicinska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokoll följer riktlinjer State University Office of Research Compliance och etik North Carolina A & T.
1. Kemisk Förberedelse för Keratin Extraction 4
- För att framställa 1000 ml 2% vikt / volym perättiksyralösning (PAS), under en huv tillsätt 20 ml av perättiksyra till 980 ml Avjoniserat (DI) vatten.
- För att framställa 1000 ml 100 mM Tris baslösning (TBS), tillsätt 12,2 g Tris-bas till 1000 ml Dl-vatten och rör om tills helt upplöst.
- Förbereda utspädd saltsyralösning (DHAS) i ett dragskåp genom att hälla 4 ml koncentrerad klorvätesyra i 30 ml DI-vatten.
- Upphandla ca 20 g människohår urklipp som inte har behandlats kemiskt eller ändras. Hår kan vara vilken längd som helst.
- Tvätta håret ordentligt för hand, med varmt vatten och tvål. Använda avjoniserat (DI) vatten för slutsköljningen.
- Sätt upp håret i två 600 ml bägare och placera i en 80 ° C oven under 1 timme.
- Dränera vätskan från botten av bägaren och placera tillbaka i ugn tills håret ligger helt torrt.
- Divide torkat hår jämnt mellan 600 ml bägare, placera 10 g av hår i varje bägare. Låt inte håret att fylla mer än 500 ml.
- Häll 500 ml av PAS i varje bägare var noga med att täcka hela håret. Täck bägarna med parafilm och butik för 12 timmar.
2. Beredning av Keratin extraktlösning
- Separera håret från PAS med hjälp av en 500 | im sikt. Samla in avfalls PAS i en separat behållare. Skölj håret noggrant med avjoniserat vatten för att avlägsna eventuella överblivna PAS.
- Placera sköljdes håret i en 500 ml kolv. Häll 400 ml TBS i kolven, och se till att håret är täckt. Ställe kolv i ett skakbad inställt på 38 ° C, 65 rpm under 1 h.
- Efter en timme, ta bort från skakbad och häll vätskan, cirka 400 ml keratin extraktionslösning (KES), into en 1000 ml bägare.
- Häll 400 ml av DI-vatten in i kolven innehållande den hår säkerställer att håret är täckt och placera tillbaka i skakbad under 1 timme. Ta kolven ur skakbadet och häll resterande 400 ml av KES till 1000 ml bägare med tidigare insamlade KES. behövs inte längre håret och kan dumpas ut ur kolven och kastas i den närmaste papperskorgen kärlet.
3. Koncentration av Keratin extraktlösning
- Fyll rotodistiller bad till den översta raden med destillerat vatten och inställd på 90 ° C. Inställd rotationshastighet till 200 varv per minut. Slå på kylvätskan kylaggregatet-pump och inställd på -10 ° C.
- Med användning av en pH-mätare för att övervaka pH i KES, använd en pipett för att långsamt tillsätt 1 mM DHAS till KES tills den når ett pH-värde 7,0. Rör om långsamt som lösningen sättes.
- Häll neutraliserade KES i 500 ml rundbottnad kolv tills cirka fjärdedel. Kör destillat enligt tillverkarensprotokollet för 1,25 h.
- Upprepa steg 3,3 tills alla KES destillation har destillerats. Det viktigt att kolven är ansluten ordentligt.
4. Dialys av keratin extraktlösning
- Häll KES lösning lika i 12 separata 14 ml koniska rör. Centrifugera rören vid 1050 xg under 10 min.
- Häll centrifug KES i en ren bägare och se till att hälla bort från den insamlade skräp. Upprepa tills allt KES har centrifugerats.
- Fyll en 2000 ml graderad cylinder med DI-vatten.
- Skära dialysrör cellulosamembran till 24 inches, och klämma en ände av slangen för att hålla det stängt.
- Doppa längden av röret i cylindern på DI-vatten för att göra det mer flexibelt och lättare att öppna.
- Öppna den icke-klippta änden av dialysslangen cellulosamembran och häll långsamt 60 ml centrifug KES lösning i slangen. Använd en annan klämma för att stänga denna ände av slangen.
- Sätt diALYS röret i 2000 ml cylinder med DI vatten och låt stå under 24 timmar. Ändra DI-vatten i cylindern var 3 till 4 timmar.
- Efter 24 timmarsperiod, tömma dialys KES lösningen i förslutna burkar, att se till att lämna utrymme upptill och plats i frysen vid -20 ° C under 24 timmar.
5. Lyofilisering av Keratin extraktlösning
- Ställ frystorkning till -86 ° C.
- Ta bort burkarna innehåller fryst KES från frysen, ta locken bort av burkar, och placera dem i frystork ampuller. Placera tätningarna på ampullerna och vrid ratten för att skapa ett undertryck av 0,133 mbar. Lyofilisera proverna under ca 48 h, tills allt av fukten är borta.
6. Framställning av Electro Solutions (10 vikt% Keratin Solution)
- Avlägsna Keratin Powder från lyofilisatorn och väga den.
- Lägga DI vatten till Keratin pulver för att skapa en 10% vikt / viktKeratin lösning.
7. Beredning med 10% vikt PCL Lösning
- Erhålla PCL (ε-kaprolakton polymer, Mn 70 till 90 kDa) och trifluoretanol (TFE). Bered en 10 vikt-% PCL i TFE genom omrörning O / N och erhålla en homogen blandning.
8. Framställning av keratin / PCL Lösning
- Erhålla PCL lösning 10 vikt% som tidigare framställts och 10 vikt% keratin lösning. Lägg keratin i PCL lösning droppvis för att skapa 10 ml PCL / keratin lösningar av 90:10, 80:20, 70:30 och 60:40 nyckeltal.
- Använd en virvel att erhålla en homogen blandning av PCL / Keratin lösning innan elektrospinning.
9. Produktion av Elektrospunnen PCL / keratin fiber
- Placera ca 8 ml av PCL / keratin lösning i en 10 ml engångsspruta utrustad med en 0,5 mm diameter plaströr. Placera sprutan i en sprutpump, där flödeshastigheten sätts till att vara 2,5 ml / h.
- Linda uppsamlingstrumma med aluminiumfolie innan du kör provet. Se till att aluminiumfolien är stabil genom att tillämpa den märkband på vardera änden.
Obs: Fibrerna bildas på aluminiumfolien (se figur 2), lagra fiber täckt folien vid RT.
10. Mekanisk Analys av PCL / Keratin Nanofiber
- Skär provet i 60 mm x 8 mm. Se till att registrera tjockleken genom att använda digitala mikrometer. För varje komposition framställd, använda fem prover.
- Fästa provet 60 x 8 mm i dragtestapparaten. Använd en specialdesignad provhållare för att fästa provet. Sandwich provet mellan provhållare som är tillverkad av ett indexkort med hjälp av dubbel-tejp. Applicera 10 N belastningscell med en förflyttningshastighet av 10 mm / min.
Obs! Provhållare var avsedd att vara 62 mm x 40 mm med en inre fönster 50 mm x 38 mm. - Spela förlängning och belastningsvärden genom programvara enligt programvaruprotokoll.
- Beräkna stress genom att dividera kraften efter område av provet testas. Nästa, beräkna stam genom att dividera förändringen i längd med den ursprungliga längden.
- Generera spännings-deformationskurva genom att plotta stress i y-axeln för motsvarande stam värde i x-axeln den.
- Beräkna Youngs modul från det linjära området där lutningen är lika med elasticitetsmodul. Bestämma draghållfasthet från stress stam tomt genom att 0,2% förskjutning i stam och dra en parallell linje med den linjära regionen kurvan.
- Utför statistisk analys av de mekaniska data som erhållits i tre exemplar som tidigare med hjälp av envägs variansanalys med hjälp av analysprogramvara 8. P-värden <0,05 vire ansågs statistiskt signifikant.
11. ytmorfologin och struktur Characterization
- Använda svepelektronmikroskop (SEM) med parametrar för accelererande spänning av 15 kV och ström av 5 | iA för att observera morfologin hos elektrospunna fibrer.
- Före avbildning med SEM, skär ett 2 cm 2 sektion av fibern och bifoga det till en SEM scenen med hjälp av kopparband. Placera scenen inuti sputter beläggaren och kappa med guld vid 15 mA under 1 minut och 30 sekunder för att skapa ett guldskikt cirka 11 nm tjockt. Ladda provet i kammaren i SEM. Beakta fiberprover.
- Använd FTIR (FTIR) för att karakterisera den kemiska bindningen mellan PCL och keratin. Placera 2 cm 2 sektion av electrospun nanofiber membran i en magnetisk hållare och rensa systemet med torr luft före testning. Erhålla spektra för 200 skannar och analysera spektra med hjälp av standard programvara enligt programvaruprotokoll.
- Utföra spektrumanalys med hjälp av standardprogramvara och använda tre exemplar av varje förhållande av nanofiber enligt tillverkarens protokoll.
12. Studie av Cell-fiberinteraktion
- Skära fibrerna till 16 mm 2 prover. Använda en biokompatibel, silikonbaserat lim för att fixera varje prov för att täckglas med en 12 mm diameter.
- Limma en ände av fiberprovet till baksidan av locket glida, vira provet runt täckglas och sedan limma den fria änden av provet till baksidan av locket glida liksom, lämnar toppen av glid täckt med endast fiberprovet.
- Placera fiberprover i en 24-brunnars platta. Sterilisera prover genom nedsänkning i 80% etanol under 1 timme.
- Skölj etanolen från prover med avjoniserat vatten. Sedan pipett 2 ml basmedium på prov och se till att täcka hela provet. Ta bort mediet efter fem minuter.
- Användning fibroblast 3T3-celler att ympa fiberprover. Suspendera cellerna i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) som kompletterats med antibiotika och 10% fetalt bovint serum (FBS) så att finns det cirka 62000 celler / cm 2 per 1 ml DMEM.
- Släpp 1 ml av 3T3-cellinnehållande DMEM-lösning i varje brunnsplatta säkerställa att varje fiberprov är täckt av cirka 62000 celler / cm 2. Inkubera brunnsplattor under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2. Notera: Använd 5% CO2 eftersom den nivån kan vanligtvis upprätthålla pH i cellmediet i fysiologisk intervall i flera dagar.
13. Nedbrytning av nanofibrer Matrix
- Klipp torkad PCL / keratin nanofiber membran i kvadrat ungefär 30 mm x 30 mm.
- Sterilisera 900 mm 2 prover med 80% alkohol för en 10 minuters inkubationstid och tvätta noga med avjoniserat vatten. Inkubera proverna i 15 ml PBS, pH 7,5, vid 37 ° C. Ersätt buffer var 3 dagar.
- Ta membranen ur lösningen vid bestämda tidpunkter, en vecka och 7 veckor, och skölj med avjoniserat vatten.
- Placera membranprov in i frystork ampuller. Placera tätningarna på ampullerna och vrid ratten för att skapa ett vakuum. Lyofilisera för 24 timmar, tills helt torr.
- Fäst torkade provet till ett SEM scenen med hjälp av kopparband. Placera scenen inuti sputter beläggaren och kappa med guld vid 15 mA under 1 minut och 30 sek.
- Ladda provet i kammaren i SEM. Observera fiberprover vid en accelererande spänning av 1,5 kV och 5 pA ström.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
fiber Morfologi
SEM-bilder av fibrerna erhölls för alla fiberkompositionerna. Se figur 3. Fiber bild bekräftar att fibrerna är slumpmässigt orienterade.
mekanisk provning
Mekaniskt starka fibrer allmänhet krävs för olika vävnadstekniska tillämpningar. Dessa fibrer bör behålla tillräcklig styrka och flexibilitet under vissa stress och miljöförhållanden 9. I allmänhet ställningar önskvärt att ha moduler som ligger nära den hos målvävnaden undvika någon stress avskärmningseffekter och för att bibehålla tillräcklig hållfasthet under in vivo och / eller i cell vitro tillväxt 10. Tensile Tester användes för att mäta elasticitetsmodulen och brotthållfastheten hos fibern. Ung modul (MPa) av PCL / keratin vid förhållanden av 100: 00, 90:10, 80:20, och 70:30 wsom visade sig vara 10 ± 2, 8 ± 1, 5 ± 1,5, och 4,5 ± 1,6, respektive 4. På liknande sätt, brotthållfasthet (MPa) av PCL / keratin vid förhållanden av 100: 00, 90:10, 80:20, och 70:30 befanns vara 3 ± 1,2, 2 ± 0,5, 1 ± 0,2, och 1 ± 0,3 respektive 4, såsom visas i tabell 1, fig. 4 visar den grafiska trenden med variation av elasticitetsmodul versus PCL.keratin kvoter. Trendlinjen i diagrammet stöd i ytterligare förstå brottöjningen hastigheten.
Strukturella och morfologisk karakterisering
I figur 5, FTIR transmittans-spektra för PCL / keratin kompositNanoFiber visar band vid 2.950 cm-1, 1050 cm-1, och 1,240 cm-1 på grund av asymmetriska stretching vibrationer av CH2, CO och COC grupper, respektive. Karbonylgruppen absorptionstopp vid 1720 cm -1 that är kännetecknande för PCL är också synlig 4,11. Absorptionsband vid (3.286 cm-1), (3,056 - 3075 cm-1), (1.600 - 1.700 cm-1), (1,480 - 1580 cm-1), och (1,220 - 1300 cm-1) är tecken på keratin proteiner. Banden har betecknas som amid A, B, I, II, och III, respektive.
Banden och toppar närvarande i FTIR spektra förändring med den ökade keratin koncentrationer i komposit. Deras utseende indikerar närvaron och den strukturella konformationen av keratin kedjor emellertid växelverkan mellan topparna och band gjorde orsaka vissa svårigheter. Till exempel, amid I-band närvarande vid 1.600 - är 1700 cm -1 typiskt används för att studera keratin är emellertid bandet är något vanställd genom PCL topp. Lyckligtvis kommer amiden II bandet tillräckligt för att bevisa keratin närvaro, keratin kedja konformation, och bindningsinteraktioner mellan PCL ochkeratin funktionella grupper.
Cell-Fiber Interaktion
Med användning av svepelektronmikroskopi interaktion den cell fibern studerades. Figur 6 visar de SEM-bilder av de 3T3 fibroblastceller som odlades på de nanofiber prover för 24 h. Vidhäftningen av cellerna till nanofiber proverna är synlig och visar att cell filopodia tenderar att följa den inriktning av nanofibrer när de är lika i diameter. Almar Blue (AB-test) utfördes för att kvantifiera viabiliteten hos 3T3-celler i fibrerna. AB är den kemiska resazurin. Denna icke-fluorescerande färgämne kommer in i levande celler, mitokondriella reduktaser minskar resazurin till resorrufin som är rosa och fluorescerande. Det fanns inte signifikant skillnad i toxicitetsnivåer olika förhållanden av PCL / keratin.
< br /> Figur 1. Bilder på Keratin Extraction Process (A) Rensad människohår före extraktion. (B) Hår efter keratin extraktion; (C) Keratin extraktlösningen; (D) Frystorkat keratin pulver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Digitalkamera Bilder av elektrospunna Fibers. Bilder från syntetiserade fibrer av CL / keratin i olika förhållanden som samlats på aluminiumfolie. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
e 3 "src =" / filer / ftp_upload / 53381 / 53381fig3.jpg "/>
Figur 3. SEM-bilder av PCL / keratin Nanofiber. AC () bilder av Nanofiber spunna från lösningar med PCL / keratin förhållandena 70:30, 80:20 och 90:10 respektive. Inläggningar visar högre förstoring för varje motsvarande SEM-bild. SEM-bilder (DF) och (GI) representerar de fibrer som anges i bilderna (AC) efter 1- och 7-veckorsnedbrytningstester, respektive. Skalstrecket i inläggningar representerar 500 nm (se skala bar i bild C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Diagram av Modulus kontra PCL / Keratin nyckeltal. Ett diagram av keratin koncentration kontra Young modul visar diagram med variation av Youngs modul. Trendlinjen stöd i förståelse brottöjning hastighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. FTIR-spektra för PCL / keratin Nanofiber med olika förhållanden. Spektrumet bekräftar bindningen av PCL till keratin. Huvudtoppen mätt vid 1,722 cm -1 instämmer med vanliga grundläggande mätningar av PCL absorptionsbandet och är synlig i alla spektra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6. SEM bilder som visar morfologi av 3T3 fibroblastceller Seedade på PCL / keratin nanofibrer membran. Bilder A, B och C representerar PCL / keratin med förhållanden av 90/10, 80/20 och 70/30, respektive. Bilder (A '), (B'), och (C ') är högre förstoring av (A), (B), och (C), respektive. De mörkare områdena på bilderna ange läget för varje fibroblastceller fästa ovanpå och hela nanofiber topografi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| förhållanden | Youngs modul (MPa) | Brottgräns (MPa) |
| 100/0 | 10 ± 2 | 3 ± 1,2 |
| 90/10 | 8 ± 1 | 2 ± 0,5 |
| 80/20 | 5 ± 1,5 | 1 ± 0,2 |
| 70/30 | 4,5 ± 1,6 | 1 ± 0,3 |
Tabell 1. Mekaniska egenskaper hos PCL / keratinfibrer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Utvinning av keratin av människohår uppnåddes framgångsrikt. Perättiksyran agerade som ett oxidationsmedel på människohår, vilket gör att keratin som skall extraheras av Tris Base. Produktionen av keratin pulver var liten skala beroende på det faktum att det bara var gjort för forskningsändamål. Detta förfarande har redan fastställts inom industrin för storskalig produktion. Syftet att utvinna den småskaliga keratin var att kontrollera föroreningar, batch variation och kostnadseffektivitet.
Keratin extraktion är det begränsande steget i denna procedur. Utbytet av keratin pulver är mycket låg, 0,7-2%. 20g av människohår gav 0,14 till 0,4 g keratin. Ett annat kritiskt steg i att producera de elektrospunna fibrerna är att formulera en lösning som är lämplig för elektrospinning. Keratin kunde enkelt dispergerades i avjoniserat vatten, emellertid vid elektrospinning, keratin / vattenlösningen resulterade inte i fiberbildning. Att ge den nödvändiga molecular interaktioner för att skapa nanofibrer en sampolymer introducerades till lösningen. PCL löst i TFE, kunde interagera starkare med keratin genom vätebindning. TFE var till stor del ansvarig för stabiliteten av sampolymeren komplex på grund av dess elektronegativitet och sura beteende.
Blanda den keratin lösningen med PCL presenterade lösningen nya utmaningar på grund av det faktum att PCL är känt för att vara hydrofobt medan keratin är känt för att vara hydrofil. När vi ökade förhållandet av keratin det var svårt att erhålla den homogena blandningen. Det här problemet löstes genom tillsats av keratin lösning droppvis till PCL lösning och vortexa det manuellt under 30 minuter.
SEM-bilder visar utmärkt ytmorfologin som är idealisk för celltillväxt och proliferation. Jämförelse FTIR resultat visar god blandbarhet mellan PCL och keratin i elektrospunna fibrerna. Detta kan bero på interväte Bonding mellan PCL och keratin. En annan faktor är den hastighet med vilken elektrospunna fibrer stelna förhindra PCL aggregation i blandningen. Den strukturella och mekaniska integritet upprätthålls av de molekylära interaktioner mellan PCL och keratin, vilket gör materialet lämpligt för regenerativ medicin applikationer. Dessa elektrospunna fibrer befanns ha unga moduler stänga den för det nativa vävnaden. Mekaniskt stark fiber kan stödja celladhesion och proliferation. PCL / keratin nanofibrer uppvisade god enhetlighet, strukturella integritet, lämpliga mekaniska egenskaper och cellulära kompatibilitet. Youngs modul (MPa) för PCL / keratin vid förhållanden av 100: 00, 90:10, 80:20, och 70:30 visade sig vara 10 ± 2, 8 ± 1, 5 ± 1,5, och 4,5 ± 1,6, respektive . De moduli minskade som förhållandet av keratin sattes ökade. Celladhesion och proliferation på PCL / keratinfibrer bekräftar att fibrerna inte är toxiska och ge stöd för celltillväxt.Den filopodia tillväxt längs Nanofiber indikerar positivt samspel mellan fibroblaster och PCL / keratin fibrer.
Elektrospinning tekniken framgångsrikt använts för att syntetisera de PCL / Keratin baserade nanofibrer. Denna teknik, till skillnad från andra befintliga metoder har visat sig vara tillförlitliga och kostnadseffektiva och kan potentiellt användas i storskalig nanofibrer produktion. Från denna studie, drar vi slutsatsen att PCL / Keratin baserade komposit nanofibrous ställningar har potential att användas för biomedicinska tillämpningar och härma naturliga ECM för vävnadstekniska tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka National Science Foundation genom Engineering Research Center för att revolutionera Metallic biomaterial (ERC-0.812.348) och nanoteknik Grundutbildning (EEG 1.242.139) för att finansiera stöd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Hair | Obtained from Local Barber Shop in Greensboro | ||
| Peracetic acid | Sigma Aldrich | ||
| PCL (e-caprolactone polymer) | Sigma Aldrich | 502-44-3 | Mn 70-90 kDa |
| Trifluoroethanol (TFE) | Sigma Aldrich | 75-89-8 | |
| Tris Base (TrizmaTM Base Powder) | Sigma Aldrich | >99.9% crystalline | |
| Hydrochloric Acid | Fischer Scientific | A144C-212 Lot 093601 | Waltham, MA |
| Kwik-Sil | World Precision Instruments | Sarasota, FL | |
| Cellulose membrane | Sigma Aldrich | 12 - 14 kDa molecular cut off | |
| optical microscope | Olympus BX51M | BX51M | Japan |
| scanning electron microscope | Hitachi SU8000 | SU8000 | Japan |
| Table-Top Shimadzu machine | North America Analytical and Measuring Instruments AGS-X series | AGS-X Series | Columbia, MD |
| Fourier transform infrared spectroscopy | Bruker Tensor 2 Instrument | Billerica, MA | |
| Microcal Origin software | Northampton, MA | ||
| X-ray diffraction (XRD) | Bruker AXS D8 Advance X-ray Diffractometer | Madison, WI | |
| Fibroblast 3T3 cell | American Tissue Type Culture Collection | Manassas, VA | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM | Invitrogen | Grand Island, NY | |
| Spectra max Gemini XPS microplate reader | Molecular Devices | Sunnyvale, CA | |
| Student- Newman-Keuls post hoc test | SigmaPlot 12 software |
References
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. J Biomed Mater Res. 60, 613-621 (2002).
- Liu, W., Thomopoulos, S., Xia, Y. Electrospun nanofibers for regenerative medicine. Adv Healthc Mater. 1, 10-25 (2012).
- Edwards, A., Jarvis, D., Hopkins, T., Pixley, S., Bhattarai, N. Poly(-caprolactone)/keratin-based composite nanofibers for biomedical applications. J Biomed Mater Res B. 103, 21-30 (2015).
- Dowling, L. M., Crewther, W. G., Parry, D. A. Secondary structure of component 8c-1 of alpha-keratin. An analysis of the amino acid sequence. Biochem J. 236, 705-712 (1986).
- Yamauchi, K., Maniwa, M., Mori, T. Cultivation of fibroblast cells on keratin-coated substrata. J Biomat Sci-Polymer. 9, 259-270 (1998).
- Shea, L. D., Wang, D., Franceschi, R. T., Mooney, D. J. Engineered Bone Development from a Pre-Osteoblast Cell Line on Three-Dimensional Scaffolds. Tissue E. 6, 605-617 (2000).
- Fortin, M. -J.
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Yang, S., Leong, K. F., Du, Z., Chua, C. K. The design of scaffolds for use in tissue engineering. Part I. Traditional factors. Tissue E. 7, 679-689 (2001).
- Bhattarai, N., et al. Natural-Synthetic Polyblend Nanofibers for Biomedical Applications. Adv Mater. 21, 2792-2797 (2009).
