Abstract
Aldersrelatert macula degenerasjon (AMD) er en ledende årsak til synshemming i den industrialiserte verden. Sykdommen manifesterer seg ved ødeleggelse av sentrum av netthinnen, kalt makula, noe som resulterer i tap av sentral visjon. Tidlig AMD er preget av tilstedeværelsen av små, gulaktige lesjoner kalt soft drusen som kan utvikle seg til sent AMD som geografisk atrofi (tørr AMD) eller neovaskularisering (våt AMD). Selv om de kliniske endringer er godt beskrevet, og forståelsen av genetiske påvirkninger på overdragelse AMD risiko blir stadig mer detaljert, ett område mangler store fremskritt er en forståelse av de biokjemiske konsekvensene av genetisk risiko. Dette er delvis på grunn av vanskeligheter med å forstå biokjemi av Bruch membran, en meget tynn ekstracellulær matriks som virker som et biologisk filter av materiale fra blodtilførsel og et stillas på hvilken retinalt pigmentepitel (RPE) cellemonolaget befinner seg. Drusen form innen Bruch membran og deres tilstedeværelse forstyrrer næringstilførselen til RPE cellene. Bare ved å undersøke proteinsammensetningen Bruch membran, og faktisk hvordan andre proteiner samhandle med det, kan forskere håper å løse de biokjemiske mekanismene som ligger til grunn drusen dannelse, utvikling av AMD og påfølgende synstap. Dette papiret detaljer metoder for anrikning enten hel Bruch membran, eller bare fra makula-regionen, slik at den kan brukes til nedstrøms biokjemisk analyse, og gir eksempler på hvordan dette er allerede endring forståelsen av Bruch membran biokjemi.
Introduction
Bruken av post mortem menneskelige øyet vev i oftalmisk forskning er en uvurderlig ressurs for forståelsen av øyesykdom patogenesen. Analyse av menneskelige giver øyne har gitt viktige bidrag til kresne mekanismene som ligger til grunn aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), som er den ledende årsak til blindhet i den vestlige verden en. Globalt står AMD for ca 8,7% av all blindhet og med en stadig aldrende befolkning, er det spådd å påvirke 196 millioner mennesker innen 2020 2. AMD resulterer i tap av sentral visjon og har en betydelig innflytelse på pasientens selvstendighet og livskvalitet 3. Tidlig AMD er preget av dannelsen av drusen og det kan utvikle seg til geografisk atrofi (noen ganger referert til som "tørr" AMD), eller koroidal neovaskularisering (også referert til som neovaskulært eller "våt" AMD). Mens anti-VEGF injeksjoner kan stabilisere eller forbedre visjon i neovaskulært AMD det jeger ikke helbredende, og i dag finnes det ingen behandling for geografisk atrofi.
Mens visse genetiske varianter er blitt vist å modifisere AMD risiko 4 - 8, er mindre kjent om hvordan disse variantene påvirker makula på en biokjemisk nivå. Et viktig område i AMD patogenesen er Bruch membran. Drusen skjema innen denne strukturen og ulike studier har gitt holdepunkter for komplementaktivering i og rundt Bruch membran i AMD 9. Bruch membran er et ark av ekstracellulær matriks som skiller retinalt pigmentepitel (RPE) celler fra årehinnen og er omtrent 4 um tykke. Bruch membran går over i den choriocapillaris, et lag av årehinnen som inneholder fenestrert kapillærene og eksternt i forhold til dette er lagene som inneholder større blodkar 10 (figur 1A).
Bruch membran er en pentilaminar ark av ekstracellulær matriks (ECM), og denne metoden gir informasjon om hvordan å isolere Bruch membran, sammen med ECM av de underliggende choriocapillaris (heretter kalt anriket Bruch membran), som er stort sett decellularized og fri for røde blodceller. Beriket Bruch membran ble deretter brukt for vestlige blotting og histologi eksperimenter. Videre er metoden for å anrike Bruch membran utelukkende fra makula-regionen til øyet er beskrevet, noe som vil være av spesiell interesse for dem å undersøke de biokjemiske aspekter av AMD.
Protocol
Menneskelige øye vev samtykket for forskningsformål ble oppnådd fra Manchester Royal Hospital Eye Eye Bank etter fjerning av hornhinnen for transplantasjon. Bruken av menneskelig vev for forskning var i samsvar med Human Tissue Act (2004) retningslinjer, og med Universitetet forskningsetiske komité godkjenning (referanse 11 305).
1. Anriking av Whole Bruch membran
- Rengjør arbeidsområdet rundt og under dissekere mikroskop med 1% desinfeksjonsmiddel (v / v) og tørk ned med 70% (v / v) etanol.
- Sørg for at følgende er for hånden: en ny engang skalpell, to sterile celleskraper (som vanligvis brukes i vevskultur) og tre par pinsett (oppført her som A, B og C, se liste materialer).
- Plasser øyeeplet inn i en engangs petriskål, beholder lokket for senere bruk. Ved hjelp av en ny engangs skalpell, fjerne eventuelt resterende synsnerven, som kan interferere med å skape en flat mount av vevet. Deretter gjør fire snitt i samme avstand fra hverandre for å lage fire kvadranter, hvis du fortsetter å del 3 (anriking av macula Bruch membran) ikke skjære gjennom makula regionen.
- Sørg for at snittene strekker seg gjennom hele dybden av øyevevet - fra den innerste nevro retina (NSR), gjennom årehinnen og sclera (hvite i øyet). Fortsett snittet hele veien rundt øyet fra grensen til øyemusling på synsnerven. Dette vil gi eyecup å bli flatet ut (se figur 1B).
- Holder en kvadrant av utflatet øyemusling bruker pinsetten A (for å hindre årehinnen avløsning), bruker du den store pinsetten B til grep glasslegemet og underliggende NSR og trekke dette vevet unna retinal pigment epitel (RPE) starter i periferien, beveger seg mot sentrum av den åpnede øyemusling og deretter til den motsatte side. Vanligvis, men ikke alltid både glasslegemet og NSR løsne som én. Bruk scalpel å skjære noen rest NSR forankret på den optiske platen.
- Igjen, mens det holder en kvadrant av vev på plass ved hjelp av pinsetten A, bruker sterile celleskrape til å forsiktig løsne RPE monolaget fra hele den indre overflate av eyecup. Disse cellene lett løsner og kan sees som mørke brune pigmenterte klumper. Skyll med PBS å forsiktig vaske bort forflyttet RPE celler fra eyecup.
- Deretter bruker pinsetten A til forsiktig skrelle av overliggende mørk rød vev (som omfatter både Bruch membran og årehinnen) fra alle 4 øyen kvadranter. Plasser skåret vevet inn i en ren tallerken.
- Bruke den flate kanten av en celle skrape for å holde utskåret vev på plass, bruker andre skrape for å forsiktig skrape vevet. Snu vev og gjenta, fjerne så mye overflødig materiale som mulig. Etter hvert vil en gjennomskinnelig membran forbli: Dette er grovt beriket Bruch membran. Bruken av disseksjonsmikroskop ved et minimum av 20X forstørrelseavgjørende i å hjelpe fjerning av årehinnen og anriking av Bruch membran.
- Ved hjelp av en Pasteur pipette, kort skyll Bruch membran med ultrarent vann for å fjerne rester av årehinnen og blod før du legger membranen inn i en 1,5 ml mikro tube.
- Suspender det anrikede Bruch membran i ca. 1 ml ultrarent vann, og vortex raskt (ca. 15 sekunder) for å bidra til å lysere eventuelt forurensende cellemateriale (se figur 2). Sentrifuger prøven ved 500 xg i 30 sekunder for å pelletere membranen og aspireres av supernatanten.
Merk: De resterende beriket Bruch membran er nå klar for oppløsning (som beskrevet i punkt 2 nedenfor) eller lagring ved -80 ° C for senere bruk.
2. Oppløsning av Whole Beriket Bruch membran og Western Blot Analysis
- Utdrag protein fra anriket Bruch membran ved neddypping av vevet i 500 pl 8 M urea i 6 timer ved romtemperatur i 1,5 ml mikrosentrifugerør (figur 3A).
- Sentrifuger solubiliserte prøver ved 10 000 xg i 10 min til pellet eventuelle gjenværende ekstracellulære saken. Fjern supernatanten og overføre den til 3500 Da MWCO dialysemembran, deretter plassere prøven i en L PBS til dialyse i 16 timer ved 4 ° C.
- For hver prøve, tilsett 40 ul protein isolasjonsperler, og rotere sample / kuleblanding (20 rpm på en roterende mikser) ved RT i 30 min.
- Sentrifuger prøvene ved 10 000 xg i 5 minutter for å pelletere perlene. Fjern supernatant og oppløseliggjøre protein bundet til perlene i 30 pl 2x prøvelastebuffer (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) glycerol, 0,01% bromfenolblått, 3% β-merkaptoetanol).
- Inkuber prøvene ved 100 ° C i 10 min, og deretter sentrifuger ved 10 000 xg i 5 minutter for å pelletere gjenværende perler.
- Installering av supernatanten som inneholder de frigjorte proteinene på et pre-støpt SDSside gradient gel (se liste materialer) for proteinseparasjon.
- Visual adskilte proteinbånd ved hjelp av en vanlig farging protokollen, f.eks coomassieblått.
- I korte trekk, tilsett 20 ml av den strålende blå flekk (0,1% brilliant blue (w / v), 50% metanol, 10% iseddiksyre, 40% vann) til gelen, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur med forsiktig omrøring .
- Kast fargeløsning og vask gelen farget med avionisert vann inntil bakgrunnsfarging er tilstrekkelig redusert til å tillate farget proteinbånd visualisering.
- Alternativt separeres overføring proteinbånd til nitrocellulose for Western-analyse, som beskrevet nedenfor.
- Overføring separerte proteinbånd på nitrocellulose-membran ved 80 mA i 2,5 timer ved bruk av semidry overføringsapparat i overføringsbuffer (25 mM Tris, 192 mM glycin, 10% [v / v] metanol).
- Blokkere membranen i 10 ml PBS, 10% (w / v) melk og 0,02% (w / v) BSA i 16 timer ved 4 ° C før the tilsetning av de ønskede primære antistoffer til protein deteksjon.
Merk: Som et eksempel her, viser figur 3C representerer et immunoblot av Bruch solubilisert membran fra tre separate givere probet for en regulator av komplementkaskaden, faktor H-lignende protein 1 (FHL-1).
3. Anriking av Macula Bruch membran
- Følg trinn 1,1 - 1,3, som beskrevet tidligere.
- Mens NSR er fortsatt på plass, finner den gule foveal fargingen som representerer den sentrale makula region (se Figur 4). Ved hjelp av en steril 6 mm biopsi punch, legg den over foveal regionen og fast klippe i å makula.
- Holde biopsi slag på plass, må et separat snitt med en skalpell fra kanten av eyecup til kanten av biopsi slag blad, og deretter ved hjelp av pinsetten B, skrelle bort rundt øyet materialet for å oppnå et rent biopsi.
- Ved hjelp av pinsett C, fjern6 mm skive av vev fra punch og sted på ren petriskål lokket. Sett petriskål lokket og macula slag under dissekere mikroskop.
- Fjern den tynne NSR-plate (sjekk for gul foveal farging å antyde nøyaktigheten av biopsi). Bruk en steril celle skrape til å forsiktig fjerne RPE cellene.
- Fest macula platen via sclera hjelp av tips av pinsetten A, og sakte skrelle av årehinnen og Bruch membran kompleks bruker pinsetten C. Igjen, bruke mobil skrape til å fjerne uønsket årehinnen og blod saken fra Bruch membran.
- Plasser macula Bruch membran i en 1,5 ml mikro rør og suspendere i 1 ml ultrarent vann. Vortex kort (ca. 15 sek) for å hjelpe lysere eventuelt forurensende cellemateriale. Sentrifuger prøven ved 500 xg i 30 sekunder for å pelletere membranen og aspireres av supernatanten.
Merk: beriket Bruch membran isolert fra makula kan nå brukes for proteomikk enalysis hjelp av brukerens foretrukne fordøyelsen protokoller.
Representative Results
Protokollen er beskrevet ovenfor for å produsere anriket Bruch resultater membran i isolering av Bruch membran, ECM av choriocapillaris og fjerner det meste av celler / cellerester inkludert alle de RPE (figur 2). Vaskingen av det anrikede Bruch membran i vann er et viktig steg i lysering av eventuelle gjenværende koroidal celler. Trykket som utøves under opphugging av årehinnen ser ut til å komprimere noen av de få gjenværende cellekjerner inn i regionen definert som Bruch membran (figur 2B).
Solubiliseringen av anriket Bruch membran tillater nedstrøms analyse av proteininnhold. Separasjonen av proteinbånd fra solubilisert anriket Bruch membran ved anvendelse av en 4 - 12% gradient SDS-PAGE gel, mens ikke er nyttig i seg selv for å identifisere proteininnhold, gjør demonstrere evnen av denne teknikken for å redusere forurensende blodproteiner som are ikke-spesifikt bundet (figur 3B). I denne forbindelse, en bemerkelsesverdig fraværende fra proteinet gelen løp er en betydelig band av humant serum albumin (~ 66 kDa) som ellers kan gjøre påfølgende Western blotting vanskeligere å tolke: histologisk analyse av anriket Bruch membran vist i figur bærere 2 også dette. Faktisk, som en del av arbeidet som er beskrevet tidligere 11, Bruch solubilisert membran fra en serie av individuelle donorer ble undersøkt for et antall proteiner ved anvendelse av spesifikke antistoffer via Western blotting (figur 3C). I det tilfelle som er vist her, et antistoff (betegnet OX23) 12 rettet mot et 155 kDa regulator av medfødt immunitet, kalt komplement faktor H (FH), ble benyttet og viste nærvær av en lavere molekylvekt band Bruch prøvene membran fra tre separate givere (Figur 3C). Denne senere viste seg å være faktor H-lignende protein 1 (FHL-1), Et 49 kDa protein relatert til FH, og som følge av en skjøt variant av det samme gen 13. FHL-en ser ut til å være den viktigste supplement regulator stede i Bruch membran 11.
Figur 1. Disseksjon av det menneskelige øyet og berikelse av Bruch membran. (A) Bruch membran er en ekstracellulær matrix barriere. Choroid inneholder et lag av fenestrert kapillærer som kontinuerlig går over i Bruch membran (kalt choriocapillaris), og disse separere resten av årehinnen (inneholdende store blodkar) fra retinal pigment epitel (RPE) celle monolag, som fysiologisk støtter fotoreseptorcellene av nevro retina (NSR). (B) Fire snitt i den menneskelige øyemusling er gjort slik at den kan åpnes for å opprette en flat mount. Deglasslegemet kan fjernes ved bruk av pinsett. NSR kan løsne sammen med glass men kan også fjernes med pinsett. En celleskraper brukes til å fjerne RPE-cellelaget fra Bruch membran mens den fortsatt er forankret til årehinnen og sclera. Den Bruch membran / choroid kompleks kan skrelles bort fra sklera, og ved hjelp av en ny celle skraper, kan den ytre choroid fjernes. En siste vask i ultrarent vann lyserer eventuelle gjenværende cellemateriale. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Histologi av Bruch membran og årehinnen. H & E farget seksjoner før (A) og etter (B) skrape bort de ytre koroidal strukturer fra Bruch membran og vasking i ultrarene water å generere beriket Bruch membran. Skala barer representerer 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. oppløseliggjøring av Beriket Bruch membran for proteininnhold analyse. (A) Protein kan ekstraheres fra anrikede Bruch membran ved inkubering i 8 M urea i 6 timer ved romtemperatur, før den dialyseres mot PBS. For Western-analyse, kan proteiner fra hele Bruch membran dialysat bli isolert ved hjelp av protein isolasjonsperler og eluert ved koking med Laemmli-reduserende prøvelastebuffer. (B) En representativ Coomassie blå farget SDS-PAGE-gel som viser både ren og fortynnet oppløst Bruch membran (BM) under anvendelse av fremgangsmåten d. escribed i (A) (C) En representant western blot av solubilised Bruch membran fra 3 individuelle givere (søyle 1 - 3). undersøkt for faktor H-lignende protein 1 (FHL-1) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Isolering av Beriket Bruch membran fra makula. Makula region av netthinnen er en 5 mm område som lett kan identifiseres av den gule fargen av den overliggende fovea, og sin nærhet til tilstøtende papillen. Bruke fovea som en guide, plassere en 6 mm biopsipunch på flatskjerm montert menneskelige øyet å skjære et 6 mm makula vevsblokk. Fjern liggende NSR og skrape av RPE celler fra skåret makula. De resterende Bruch membran / årehinnen kompleks kan detn skrelles bort fra sclera og grundig skraping for å fjerne årehinnen, lyse resterende cellemateriale ved neddykking i ultrarent vann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her beskriver vi berikelse av Bruch membran for videre analyse slik at påfølgende analyser inkludert western blotting 11, massespektrometri og diffusjonsegenskaper av Bruch membran benytte modifisert Ussing kamre 11,14. Kritiske trinn omfatter a) grundig skraping og vasking av den indre overflaten av øyet for å fjerne alle RPE-celler b) gjentatt og forsiktig skraping av den underliggende årehinnen uten at Bruch er å desintegrere og c) vasking av det utskårede Bruch er i ultrarent vann å sikre lyse av gjenværende celler. Videre, hvis det anrikede Bruch membran er en som brukes for proteomikk analyse, er protein utvinning av urea behandling den mest effektive i å bryte ned denne elastiske vev i forhold til andre metoder som mekanisk homogenisering. Histologi av anriket Bruch membran indikerer ECM av choriocapillaris er ikke fjernet. Dette er for å være exventes som det ytre laget av den pentilaminar Bruch membran er dannet av choriocapillaris endoteliale celle basalmembraner. Faktisk kan det være fordelaktig at ECM av choriocapillaris forblir som skjer endringer i denne i AMD herunder avsetning av terminale komplement kompleks / membranangrepskompleks (MAC) 15. Det bør bemerkes at for detaljert Histologisk analyse av Bruch membran, dets struktur ville være bedre bevart hvis seksjonert i nærvær av sclera, årehinnen og Bruch membran. Faktisk er den histologi presentert i figur 2 kun er ment å vise graden av anriking som følge av den teknikk som er beskrevet i dette manuskriptet.
Anriking av macula Bruch s krever forsiktig disseksjon av øyemusling, som sikrer at NSR og spesielt fovea ikke er skadet; ellers identifikasjon og derved isolering av makula er ikke mulig. Integriteten til tissue er også viktig i denne prosessen og det anbefales derfor at prøvene i henhold til 48 timer post mortem tid benyttes. Graden av anrikning er nødvendig varierer mellom giverne og kan påvirkes av donor alder, post-mortem tid, og tilstedeværelsen av noen øye patologi. Bruken av begrepet anriket er tilsiktet til å erkjenne en begrensning av teknikken, idet dette er at "rensning" eller "isolering" av Bruch membran ved hjelp av denne metode er ganske enkelt ikke mulig. Ja, gitt at ECM av choriocapillaris fusjonerer inn Bruch membran det fullstendig atskillelse er ikke gjennomførbart.
Forstå biokjemiske endringer i de respektive okulære vev er avgjørende for å forstå øyesykdom progresjon. Denne unike anriking av Bruch membran forenkler denne forståelsen; pågående studier undersøker proteomet av anriket macula Bruch membran ved hjelp av massespektrometri på ulike stadier av AMDog i prøver som stammer fra individer med ulike genotyper å bedre forståelsen av den molekylære patologi AMD. Allerede den teknikken beskrevet her har blitt brukt for å kunne identifisere FHL-en som den dominerende supplement regulator i Bruch membran 11 og videre studier på anriket Bruch membran vil trolig resultere i flere ny innsikt i den molekylære patologi AMD.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Isaac Zambrano og ansatte ved Manchester Eye Hospital Eye Bank om levering av menneskelig donor øyevevet, og Mr. Pete Walker ved Fakultet for biovitenskap Histologi anlegg for H & E farget bilder. Spesiell takk går til Mr. Roger Meadows for hans hjelp med mikroskopi. SJC er en mottaker av en Medical Research Council (MRC) Karriereutvikling Fellowship (MR / K024418 / 1) og forfatterne også erkjenne andre nyere forskning finansiering fra MRC (G0900538 og K004441), Fight for Sight (1866) og The Macula Society.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Auxillary objective 0.5X | GT-Vision Ltd | 3638 | Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount |
| Biopsy Punch 6 mm | Oncall Medical Supplies | SCH-33-36 | 6mm Biopsy Punches |
| Bovine serum albumin | Sigma - Aldrich | A3059 | |
| Bromophenol Blue | Sigma - Aldrich | B0126 | |
| Cell scrapers | Sarstedt | 83.183 | For membrane enrichment |
| CyroPure Cyrovials | Sarstedt | 72.38 | |
| Disposable Scalpels | Fisher Scientific | 12387999 | Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels. |
| Dual Gooseneck LED spot lights on 30 cm arms | GT-Vision Ltd | 0153 | Flexible light source essential for dissection and imaging |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma - Aldrich | D8537 | Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment. |
| (A) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4280 | (A) Fine (100 mm) and straight |
| (B) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4272 | (B) Broad and blunt (150 mm). Useful for lifting large portions of sample |
| (C) Forceps | Scientific Laboratory Supplies | INS4323 | (C) Straight fine points |
| Glycerol | Sigma - Aldrich | G1345 | |
| Glycine | Sigma - Aldrich | B0126 | |
| GXCAM 5 digital colour camera & GT-Vision software | GT-Vision Ltd | 1122 | |
| Methanol | Sigma - Aldrich | M/4000/17 | |
| Nitrocellulose membrane | Life Technologies | NP0007 | |
| NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels | Life Technologies | NP0322BOX | |
| Petri dish | Sterilin | 101VR20 | 90 mm, used as a dish for samples |
| Protein isolation beads (Strataclean resin) | Agilent | 400714-61 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7X - 45X) | GT-Vision Ltd | 5595 | Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T3253 |
References
- Coleman, H. R., Chan, C. -C., Ferris, F. L., Chew, E. Y.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Coleman, A. L., et al. Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures. Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).
- Hageman, G. S., et al. A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).
- Klein, R. J., et al. Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 385-389 (2005).
- Haines, J. L., et al. Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 419-421 (2005).
- Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration. Science. 308 (5720), 421-424 (2005).
- Fritsche, L. G., et al. Seven new loci associated with age-related macular degeneration. Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).
- Clark, S., Bishop, P. Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration. J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).
- Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. The dynamic nature of Bruch’s membrane. Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).
- Clark, S. J., et al. Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch’s membrane: implications for age-related macular degeneration. J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).
- Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H). Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).
- Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. The complete amino acid sequence of human complement factor H. Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).
- Moore, D. J., Clover, G. M. The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch’s membrane. Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).
- McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. Age-related macular degeneration and the role of the complement system. Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).
