Summary
Durante mosca de fruta lutas, os padrões comportamentais observados, luta dinâmica e aprendizagem e memória associada são influenciadas pelas condições experimentais. O protocolo aqui apresentado descreve um novo procedimento que elimina totalmente a manipulação de moscas durante as experiências. Isso melhora a dinâmica de luta e permite a formação de efeitos fortes "loser".
Abstract
Comportamento agressivo em Drosophila melanogaster é composto pela expressão sequencial de padrões comportamentais estereotipados (para análise de ver 1). Este comportamento complexo é influenciada por fatores genéticos, hormonais e ambientais. Como em muitos organismos, experiência de combate anterior influencia a estratégia de combate de moscas eo resultado dos concursos posteriores: perder uma luta aumenta a probabilidade de perder concursos posteriores, revelando efeitos "loser" que provavelmente envolvem a aprendizagem ea memória 2-4. A aprendizagem e memória que acompanha a expressão de comportamentos sociais complexos, como agressão, é sensível à manipulação dos animais 5,6-teste pré. Muitos procedimentos experimentais são utilizados em laboratórios diferentes para estudar a agressão 7-9, no entanto, não é utilizada rotineiramente protocolo que exclui manuseamento de moscas está actualmente disponível. Aqui, nós relatamos um novo aparelho de comportamento que elimina a manipulação de moscas, usando instead suas respostas negativas geotactic inatas para mover os animais para dentro ou para fora das câmaras de luta. Neste protocolo, pequenas arenas de luta circulares contendo uma xícara de alimentos são divididos em duas partes iguais por uma barra plástica removível antes da introdução de moscas. Moscas entrar nos aposentos de seus frascos de isolamento casa através de portas de correr de câmara e geotaxis. Após a remoção dos controles deslizantes de plástico, as moscas são livres para interagir. Após períodos de tempo específicos, as moscas são separados novamente por controles deslizantes para a experimentação subsequente. Tudo isso é feito facilmente, sem manipulação de moscas individuais. Este aparelho oferece uma nova abordagem para estudar a agressão ea aprendizagem e memória associada, incluindo a formação de efeitos de "loser" na mosca lutas. Além disso, este novo aparelho comportamental de uso geral pode ser empregada para estudar outros comportamentos sociais de moscas e deve, em geral, ser de interesse para a investigação de alterações relacionadas com a experiência em processos comportamentais fundamentais.
Introduction
Agressão em sistemas animais está fortemente associada com a aquisição e exploração de recursos como comida, território e companheiros. Dado o importante papel que este desempenha na aptidão dos indivíduos, não é de estranhar que a agressão evoluiu em todo o reino animal. Como um traço adaptativo que beneficia diretamente os indivíduos, uma componente de aprendizagem e memória forte está associada com a agressão. Na competição por posição social, combate experiência anterior influencia o resultado dos concursos posteriores. Em geral, experiência prévia de derrotas aumenta, e ganhando experiência diminui, a probabilidade de perder concursos posteriores (chamado de "perdedor" e efeitos "vencedor"). Efeitos "loser" foram observados em uma ampla gama de espécies, e alguns relatos sugerem que estes podem durar vários dias enquanto os efeitos "vencedor" costumam ser de menor duração 2,10,11.
O primeiro relato de comportamento agressivoem moscas da fruta (D. ampelophila) era por Sturtevant em 1915 em um artigo em causa com reconhecimento de sexo e seleção de sexo 12. Meio século depois, os exames mais completos de fruta masculina voar agressão foram feitas, que descreveu a maioria dos padrões comportamentais observados durante mosca de fruta lutas. Estes experimentos foram realizados na sua maioria em pequenos grupos de moscas macho e fêmea observadas ao longo 13-15 horas. Recentemente, com a adição de ferramentas genéticas poderosas, diádicas setups única luta sexo e tempos mais curtos de observação, D. melanogaster tem emergido como um sistema modelo para o estudo importante da biologia da agressão 1,16. Análise de brigas entre mesmos pares do sexo de moscas machos e fêmeas demonstrou que a agressão envolve padrões comportamentais estereotipados que a transição de um para o outro de uma forma estatisticamente confiáveis 1,17. Alguns dos padrões comportamentais observados são específicos de cada sexo, enquanto outros são observados em lutas em ambos os sexos. Lutas masculinas ir para níveis de intensidade mais elevadas do que as lutas femininas e resultar na formação de relações de dominância com claras "vencedores" e "perdedores". Actualmente, muitos laboratórios começaram a investigar a bioquímica 18, neural 7,19-21, e genéticos 22 bases de agressão. Infelizmente, uma meta-análise de estudos para obter insights sobre a dinâmica de luta e a formação e manutenção de relações de dominância é problemático devido ao uso de uma multiplicidade de procedimentos experimentais em laboratórios diferentes. Essencialmente, todas as técnicas descritas na literatura envolvem o manuseamento e manipulação de moscas para introduzi-los em arenas 19,23,24 e durante a experiência comportamental 3,4 para transferir as moscas fora de arenas. Aspiração suave é a forma mais comum de manipular moscas 3,4,23-25, mas frios ou de CO 2 anestesia também são usadas 9,26, apesar de previous estudos já relataram que esses procedimentos têm efeitos deletérios sobre o comportamento da mosca 27,28. Um período de pelo menos 24 horas depois é recomendado a utilização de anestésicos para minimizar os seus efeitos sobre o comportamento 29,30.
Moscas aprender com a experiência de luta anterior e modificar seu uso padrão de comportamento em situações novas, sugerindo que o aprendizado ea memória acompanhar e são conseqüências de encontros agonísticos. Nesse sentido, voar lutas se assemelham a situações de aprendizagem condicionamento operante em que voa aprender que uma estratégia funcionou e, em seguida, usá-lo mais e mais frequentemente durante os encontros subsequentes. Moscas mudar suas estratégias de combate depois de relações de dominância foram estabelecidas durante as lutas, com os vencedores se lançando mais e mais e perdedores cada vez menos. Depois de um período de separação, perdedores anteriores mostram um comportamento muito mais submissa e são altamente propensos a perder 2ª luta quando emparelhado com fl naïves ou vencedores anteriores 3,4. No entanto, a ausência de um procedimento experimental que exclui manipulação de moscas fez estudos detalhados de efeitos "loser" difíceis. Em um recente estudo, foram comparados dois procedimentos experimentais rotineiramente utilizados em laboratórios (aspiração e-anestesia frio) para introduzir moscas em câmaras de comportamento ao novo procedimento que elimina o manuseio. Os resultados mostraram que a anestesia-fria tinha muito maiores efeitos negativos sobre a agressão do que a aspiração, mas mesmo aspiração reduziu o nível de agressividade por moscas. Aspiração, no entanto, causar efeitos altamente significativos no aprendizado e na memória que acompanham agressão. Seguindo o protocolo idêntico com dois procedimentos experimentais (aspiração e nenhum tratamento), um robusto "vencido" efeito apenas foi observado quando o tratamento das moscas foi eliminado a partir do procedimento experimental 5,6.
Idealmente, os estudos de Drosophila agressão em labolabora- deve incluir situações ambientais que voa normalmente encontram em estado selvagem (competição por recursos, território para defender e espaço para escapar). Além disso, as condições experimentais devem ser optimizadas para induzir de forma confiável, observar e interpretar o comportamento em análise (tentar minimizar o manuseio animal, limitar o uso de CO 2 como anestésico, e padronizar os procedimentos experimentais). Na tentativa de resolver a maior parte ou todos estes problemas, foi elaborado um novo aparelho comportamental que elimina a manipulação de moscas antes, durante e depois introduzi-los em estádios comportamentais. Com estes aparelhos, moscas usar seus geotaxis negativos inatas para ser transferida e transferido para dentro e para fora das câmaras de luta. Ao eliminar a manipulação de moscas, o protocolo tem como objetivos: (a) reduzir a variabilidade comportamental entre os indivíduos; (b) diminuir o tempo necessário para as moscas para interagir e gerar relações de dominância claras (machos); e (c) induz de forma confiável o suficiente forte behavioral mudanças para permitir a formação de efeitos de "loser".
Este protocolo descreve um novo aparelho experimental e um procedimento passo a passo para analisar a agressão e permitem a formação de um "vencido" efeito forte em D. melanogaster. Espera-se que este aparelho de comportamento pode ser facilmente adaptado para o estudo de outros comportamentos sociais exibidos por moscas da fruta.
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Protocol
Nota: O seguinte é uma descrição passo-a-passo do protocolo experimental que usamos para permitir desencadear confiável de agressão entre pares de moscas de fruta masculinas (D. melanogaster). Este processo induz a formação de um efeito de "vencido". Usando este protocolo, um efeito de curto prazo "vencedor" também tem sido relatado recentemente 5,6. A Figura 1 mostra a linha do tempo dos experimentos comportamentais.
Figura 1. Cronograma de agressão experimento. No dia 1, em estágio final de pupas macho (quando asas tornam-se negros) são isolados em frascos de isolamento preparados na hora. No dia 5 depois de emergir como adultos, quatro dias de idade moscas macho são anestesiadas com CO 2 e pintados com cores diferentes para fins de identificação. No dia 7, copos alimentos e câmaras de luta sãopreparado para configurar os experimentos comportamentais. Dois machos adultos 6-7 dia de idade são carregados para dentro das câmaras e são capazes de interagir. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Dia 1: Isolamento Social de pupas
- Aumentar e manter estoques de voar em um 12 horas de luz / 12 h ciclo escuro incubadora de ambiente controlado a 25 ° C e 50% de umidade relativa.
- Prepare frascos de isolamento: alimento calor fly fresco até derreter. Com uma pipeta Pasteur, transferir aproximadamente 1,5 ml de alimento mosca derretido em tubos de ensaio de vidro vazias de solteiro (1,6 x 10 cm). Permitir que a comida para solidificar.
- Isolar pupas: Com um pincel fino, remova cuidadosamente a fase final de macho pupa (quando as asas se tornar preto) do frasco de estoque e colocá-lo ao lado de um alimento que contém tubo de ensaio preparados na hora. Fechar frascos de isolamento com algodão (Figura 2).
Figura 2. isolamento social. Uma fase final de pupa macho é colocado no lado em um frasco de isolamento recentemente preparada. Frascos de isolamento contendo pupa são colocados na luz de 12 h / 12 h escuro incubadora a 25 ° C e 50% de umidade relativa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Dia 5: Pintando as moscas para fins de identificação individuais
- Execute esta etapa no dia 5 com 4 moscas macho um dia de idade e dois dias antes dos experimentos comportamentais para minimizar o efeito negativo do CO 2 anestesia.
- Anestesiar mosca com CO 2. Com uma multa palito, coloque um pequeno ponto de tinta acrílica sobre o tórax. Evite colocar tinta sobre a cabeça, asas, abdômen ou as pernas (Figura 3).
- Deixe a tinta secar por cerca de 10 segundos, e transferir suavemente voa de volta para seus frascos de isolamento originais.
- Retorno frascos de isolamento para a 12 horas de luz / 12 horas escuro incubadora a 25 ° C e 50% de humidade relativa.
Figura 3. A identificação individual. Após anestesia com uma mosca de CO 2, uma pequena gota de tinta acrílica é aplicado sobre o tórax. Para fins de identificação individual, cores diferentes são utilizados (branco e azul aqui). Veja a discussão abaixo sobre o uso de CO 2 neste passo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figuré.
3. Dia 7: Preparação do Aparelho
- Prepare Cups Food:
- Aquecer o alimento fly fresco até que derreta.
- Usando uma pipeta de Pasteur, transferir aproximadamente 0,8 ml de alimentos para a tampa de um frasco de tampa de enroscar (1,5 cm de diâmetro, 1 cm de altura) e deixa-se arrefecer. Evitar bolhas de ar.
- Fazer colar fresco fermento, misturando fermento seco com algumas gotas de água. Quando espessura, aplicar uma pequena gota de pasta de levedura para o centro da superfície do copo do alimento com um palito (Figura 4).
Figura 4. Preparar o copo do alimento. Uma xícara comida é preparada com alimentos fly fresco. Depois que os solidifica de alimentos, um ponto de levedura pasta é colocada no centro da superfície do copo do alimento. Por favor clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.
- Prepare Câmaras de combate individuais:
- Lave bem as câmaras de aparelhos e de combate indivíduo com água antes do uso cada vez. Seque com papel toalha antes de usar.
- Coloque um copo do alimento no centro de cada uma das câmaras de combate e fixar no lugar com uma gota de massa de vidraceiro.
- Cobrir câmaras de combate com a tampa aparelho (Figura 5).
- Colocar o aparelho em um ambiente de humidade elevada (60%) a 25 ° C.
- Coloque uma fonte de luz por cima do aparelho para iluminar as câmaras de combate e definir uma câmara de vídeo para registar a partir de cima.
Figura 5. Preparação da câmara de combate individual. O copo de comida preparada na hora com um ponto de levedura pasta sobre a superfície é fixada em lavado fi indivíduobrigando câmaras. Chambers estão fechados com a tampa de duas peças que permite a inserção de um divisor de plástico opaco em câmaras de combate individuais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Dia 7: Experimento Comportamental
- Execute os experimentos comportamentais com 6-7 dias de idade moscas macho.
- Insira divisórias de plástico em cada câmara lutando.
- Remover o tampão de algodão a partir do tubo de isolamento e posicionar o tubo abaixo de um orifício aberto no lado do aparelho.
- Deixe a mosca entra na câmara de luta por geotaxis negativos, geralmente dentro de poucos segundos.
- Fechar a parede de deslizamento após a mosca deixou o tubo e entrou na câmara.
- Repetir o procedimento para a introdução do segundo mosca na câmara de luta do outro lado do aparelho.
- Coloque o aparelho de volta na videotapi iluminadoposição ng.
- Iniciar a gravação vídeo e remover o divisor de plástico para permitir que as moscas para interagir.
- Para experiências Agressão:
- Nesses experimentos, ficha luta por pelo menos 20 minutos para assegurar a formação de fortes relações de dominância.
- Após o tempo desejado, pare de gravação de vídeo.
- Remover moscas das câmaras de combate, invertendo o procedimento descrito acima.
- Lave o aparelho comportamental com detergente neutro e água após cada uso e lavagem.
- Para "loser" Experiências Efeito:
Nota: Nestas experiências, as primeiras lutas são considerados como a fase de condicionamento e segundo lutas como a fase de teste. O período de descanso entre as lutas podem diferir, mas 10 min permite formação de um "loser" forte efeito.- Seguir o processo descrito acima, para realizar uma primeira luta.
- Passo crítico: Para induzir a formação de um "loser" mentalidade, eNsure que as primeiras lutas são, pelo menos, 20 min longo, a fim de estabelecer fortes relações de dominância. Após 20 min, re-inserir o divisor de plástico em câmaras de luta para separar as moscas.
- Depois de um período de 10 minutos de descanso, remova cuidadosamente o divisor de plástico para permitir que as moscas para interagir para segundas lutas.
- No fim da segunda 20 min luta, parar a gravação vídeo.
- Remover moscas das câmaras comportamentais como acima.
- Mais uma vez, limpe bem o aparelho comportamental.
- Para experiências Agressão:
5. Análise Comportamental
- Transferindo Filmes
- Conecte câmeras para o computador.
- Converter moscas .MTS para .mov moscas e se juntar clipes de filmes juntos, usando a conversão de vídeo e software a opção "juntar clipes selecionados".
- Observar e analisar cada filme com software leitor de vídeo.
- Pontuação Comportamento
Nota: este pode ser feito manualmente ou nósing software comportamental programa de análise, se disponível. A ilustração abaixo descreve uma possível análise manual para um efeito de "loser".- Marcar o tempo do primeiro encontro entre as moscas no copo do alimento (encontros são interações entre pares de moscas que duram pelo menos 2 segundos) eo tempo de aparecimento da primeira estocada (um padrão comportamental em que uma mosca sobe no topo da sua patas traseiras e encaixe para baixo e tenta agarrar o adversário). Em seguida, marcar a latência a estocada (o intervalo entre o primeiro encontro ea primeira estocada).
- Contar o número total de encontros e estocadas durante uma luta.
Nota: Se desejar, também é possível marcar outros padrões comportamentais, como ameaça asa, boxe, esgrima, retirada ou o número de encontros antes da primeira estocada, por exemplo. - Marcar o tempo de estabelecimento da dominância (tempo entre o primeiro encontro eo momento em que uma mosca retiros por três vezes consecutivas fora da popa copo do alimentoer receber lunges). Nota que voar é o vencedor e que o perdedor da luta.
- Calculando um efeito de "perdedor"
- Divida o número de lutas em que os perdedores anteriores perdem lutas 2 nd (Losers que perdem: LL) pelo número total de lutas, e multiplique por 100. O percentual obtido representa o efeito "loser":
[(# Voa LL) / (# luta total)] x 100 - Use um teste do qui-quadrado para comparar se o efeito de "loser" é estatisticamente diferente do valor esperado de 50%.
- Divida o número de lutas em que os perdedores anteriores perdem lutas 2 nd (Losers que perdem: LL) pelo número total de lutas, e multiplique por 100. O percentual obtido representa o efeito "loser":
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Representative Results
Esta secção apresenta o desenho da câmara comportamental e a análise de um conjunto típico de experiências comportamentais seguindo o protocolo descrito acima medindo a agressão e a formação de um efeito de "vencido". Também estão ilustradas as amostras de outros comportamentos que podem ser medidos usando este aparelho.
A Figura 6 mostra uma representação esquemática do novo aparelho. O aparelho é composto de três poços cilíndricos (dimensão: 22,86 mm de diâmetro, em 17 mm de altura) que são as câmaras de combate. A capa de duas peças fecha as câmaras de combate na parte superior e permite a inserção de um divisor de plástico opaco fina que divide as câmaras em duas partes iguais. Em cada lado do aparelho, paredes deslizantes com três furos (15,88 mm de diâmetro) permitir o carregamento de moscas para as câmaras de combate por geotaxis negativos directamente dos seus frascos de isolamento. Depois de moscas entrar nas câmaras de combate, as paredes deslizantes são de usod para fechar os lados das câmaras de todos. Neste ponto, as duas moscas estão dentro das arenas de luta, mas não pode interagir devido às divisórias. Ao remover estes, as moscas são livres para interagir e os padrões comportamentais posteriores pode ser observado e registrado.
Experimentos Agressão: 38 lutas entre pares de tipo selvagem machos CS foram realizados. Diferentes parâmetros comportamentais foram marcados enquanto moscas foram em copos de alimentos e as dinâmicas de lutas foram analisados (Tabela 1). Foram observados uma média de 24 encontros (breves encontros entre moscas), 54 lunges (um indicador de maior intensidade combates) durante um período de tempo de 20 min, com a primeira estocada normalmente entregue durante o 2º encontro. Em média, o encontro st 1, o 1º estocada eo tempo para estabelecer o domínio foram vistos 2, 4 e 8 minutos após o início da gravação. Na maioria dos casos, os últimos 12 min de lutas consistem de sequências repetitivas de alta intensidade ENCOUnters com animais subordinados se aproximando, sendo atacado e recuando, reforçando a posição dominante ou submisso estatuto de cada animal.
Experiências de efeito "loser": Para procurar a formação de um efeito de "loser", 21 1ª lutas de 20 min de duração foram realizadas entre pares de tipo selvagem machos CS. O divisor de câmara de deslizamento, em seguida, foi inserido para separar as moscas. Após 10 min, foram realizadas 2 nd 20 mínimo de lutas entre (a) perdedores e vencedores anteriores familiares ou (b) perdedores e vencedores anteriores desconhecidas e estes foram analisados como acima (Figura 7). Em ambas as condições, 20 perdedores anteriores perderam suas lutas 2 nd (95,5%), o que demonstra um robusto "loser" efeito. Os resultados de luta foram comparados com o valor esperado de 50-50 com uma análise do qui-quadrado de duas caudas e um "perdedor" efeito altamente significativo foi encontrado. Outras mudanças comportamentais foram observadas na perda de indivíduosentre o 1 º e 2 º luta que acompanha a formação do "loser" efeito 5.
Outros comportamentos do que a agressão pode ser estudado no aparelho: para ilustrar, de corte e de locomoção experimentos foram realizados (T capaz 2). Para o namoro, as moscas macho e fêmea foram carregados por geotaxis negativos para as câmaras de comportamento, os separadores foram removidos e padrões de comportamento de acasalamento foram marcados. 34 experimentos foram realizados e foram analisadas as latências para tribunal (tempo entre o primeiro encontro eo primeiro comportamento de corte = 7 seg) e copulam (tempo entre o primeiro encontro e cópula = 4 min). Apenas 2 machos não teve sucesso em copular durante o tempo de 15 min de observação. O Índice Vigor Courtship (a fração do tempo que os homens passou a cortejar fêmeas durante um período de 15 min após o primeiro corte padrão comportamental) foi apontado em 75% (Tabela 2). Para a locomoção tanto pecadoGLE voa ou grupo de 10 moscas foram introduzidos em câmaras e o número total de cruzamentos de linha média durante 5 min foram contadas. Moscas individuais cruzam a linha média da câmara de, em média, 73 vezes durante 5 min, enquanto que as moscas em grupos individuais cruzam a linha média, em média, 45 vezes / 5 min (Tabela 2). Este decréscimo observado quando as moscas são em grupos pode ser explicada pela reduzida espaço disponível por mosca e no momento em que passam a interagir um com o outro em vez de explorar o território.
Figura 6. Representação esquemática da câmara comportamental. (A) Vista lateral do aparelho. O novo aparelho é composto por três partes distintas: (a) um bloco de plástico contendo três indivíduos que lutam câmaras; (b) duas paredes deslizantes com três furos (15,88 mm de diâmetro) em cada; e (c) a tampa de duas peças no topo. (B) Topvista do aparelho. As dimensões do bloco de plástico (um) são 36,83 mm por mm 123.19. Cada câmara de combate indivíduo tem um diâmetro de 22,86 mm e uma altura de 17 mm. Orifícios no lado que permitem o carregamento das moscas têm um diâmetro de 15,88 milímetros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. A formação de um robusto "loser" efeito. A "loser" efeito significativo (percentagem de perdedores que perder 2ª luta é observado quando perdedores anteriores foram pareados (a) com os vencedores familiares (n = 21, p *** <0,0001) ou (b) com os vencedores desconhecidas para seus 2 nd lutas (n = 21, *** p <0,0001) (perder: 95,5%, Win:. 4,5%, No empates) Plfacilitar clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Parâmetros comportamentais | Unidade | Tempo (seg) | n |
| Encontros | 24 ± 2 | 38 | |
| Lunges | 54 ± 6 | 38 | |
| Número de encontros antes da primeira estocada | 2 ± 0,3 | 38 | |
| Hora do primeiro encontro | 145 ± 20 | 38 | |
| Hora da primeira estocada | 229 ± 26 | 38 | |
| Tempo de posição dominante | 475 ± 56 | 34 | |
| Latência a estocada | 87 ± 20 | 38 | |
| Latência de dominância | 342 ± 51 | 34 |
Tabela 1:. Dinâmica das interações agonísticas entre pares de moscas macho Os valores médios ± SEM são calculados para cada parâmetro marcado como indicadores de agressividade. O número total de encontros e estocadas, eo númerode encontros antes da primeira estocada foram marcados. Momentos do primeiro encontro, primeira estocada e domínio, e as latências estocada e dominância são apresentados na sec ± SEM (n> 34).
| Parâmetros comportamentais | Tempo (seg) | Unidade | (%) | n |
| Comportamento de corte | ||||
| Latência a tribunal | 7 ± 3 | 34 | ||
| Latência de copular | 273 ± 62 </ td> | 32 | ||
| Courtship Índice Vigor | 75 ± 0,05 | 34 | ||
| Locomoção | ||||
| Cruzes de linha média total (única mosca) | 73 ± 4 | 48 | ||
| Total de cruzes de linha média (grupo de moscas) | 45 ± 3 | 20 |
Tabela 2:. Análise do comportamento de corte e locomoção Os valores médios ± SEM são calculados para as latências para o tribunal e copular (em segundos). Um índice de namoro vigor(em% do tempo gasto cortejando após primeira exposição do corte) foi marcado depois de machos e fêmeas foram colocadas em câmaras de comportamento por geotaxis negativos (n> 32). A locomoção, quando as moscas individuais ou grupos de 10 moscas foram carregados para dentro das câmaras, foi marcado por contagem do número total de cruzamentos de linha média durante 5 min (n = 48 e 20).
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Discussion
A era moderna da usando Drosophila com seus métodos genéticos poderosos como um organismo modelo para o estudo da agressão começou há cerca de uma dúzia de anos atrás, com a introdução de novas arenas experimentais em que o comportamento de combate de confiança poderia ser obtido com pares individuais de moscas 1,7, 8,17,19. Essas arenas incluídos recursos desejados (um copo de alimentos, companheiros potenciais) e um espaço para perdedor voa a recuar para. Quando os resultados obtidos com estas arenas foram adicionados ao conhecimento prévio sobre o comportamento luta mosca da fruta, Drosophila melanogaster foi firmemente estabelecida como um sistema modelo altamente desejável pela análise de um comportamento complexo como agressão e é usado em muitos laboratórios. Os resultados obtidos revelaram que somados: (a) voa exibem agressão na competição por recursos alimentares, o acesso a companheiros ou para defesa do território 14,15; (b) lutas são compostas de uma série sequencial de padrões de comportamento estereotipada 1; (c)moscas macho e fêmea lutar na mesmos pares do sexo (alguns padrões são específicos do sexo masculino, alguns são do sexo feminino específico e alguns são compartilhados por ambos os sexos) 17; (d) apenas lutas masculinas ir para os níveis de alta intensidade e resultar na formação de relações hierárquicas com clara «vencedor» e «perdedor» voa 17; (e) um único gene infrutífero, da hierarquia de determinação do sexo, determina se a luta como moscas machos ou fêmeas e 16 (f) várias substâncias hormonais incluindo aminas e peptídios influenciar a agressividade em moscas de fruta 7,8,19,20.
Aqui, uma nova abordagem é descrita para o estudo da fruta agressão em que a manipulação de moscas é eliminado durante as experiências voar. Isto oferece uma melhoria significativa no protocolo experimental tal como todas as medições comportamentais são melhoradas 5,6, nova informação relativa ao comportamento tem sido adquirida e a aprendizagem e a memória, que acompanhamosca macho lutas é muito melhorada. Para ilustrar, apenas dois estudos anteriores relataram a formação de efeitos "vencido" neste 3,4 sistema modelo. Em ambos, foram utilizadas câmaras maiores do que as descritas neste protocolo, as moscas foram transferidos para dentro e fora de arenas de luta por aspiração, e os tempos de luta mais longos e tempos de intervalo entre as lutas eram necessárias para gerar efeitos claros "loser". Nosso estudo recente demonstrou que a eliminação de manipulação do protocolo experimental, relações claras de dominância entre pares de D. melanogaster moscas macho são observadas após apenas 20 minutos de interação. Este período de tempo é suficiente para induzir alterações significativas nas estratégias de combate em ambas as moscas durante 1ª lutas e observar de forma confiável a formação de efeitos fortes "perdedor" em 2 nd lutas. Além disso, pela primeira vez, claro curto-prazo "vencedor" efeitos foram também observados durante 2 ndluta 5,6.
Para o sucesso usando este protocolo, alguns pontos críticos precisam ser observados. Para induzir e observar padrões de comportamento agressivo robustos recomendamos o uso 6-7 moscas macho um dia de idade que foram mantidas em isolamento social uma vez que a fase de pupa tarde. Em geral, a disponibilidade de recursos que voa estão dispostos a competir mais (alimentos, companheiros) é altamente desejável, a fim de obter o comportamento de combate forte e estabelecimento de relações de dominância. Durante este protocolo, as moscas são pintados após a anestesia utilizando CO 2, e que podem ser motivo de preocupação como nosso estudo publicado recentemente mostrando que anestesiar moscas interfere seriamente com o comportamento subsequente 5. Maneiras possíveis para evitar a anestesia pode ser para não pintar os animais se não é importante para manter o controle de indivíduos. Se a pintura é necessário, no entanto, a anestesia deve ser usado 48 horas antes de os animais são utilizados em experiências, ou abordagens alternativas para identificarindivíduos também pode ser utilizado 31. Para induzir "loser" forte e efeitos "vencedor", é crucial que as moscas estabelecer e manter uma relação de dominação durante primeiras lutas. No protocolo aqui apresentado, usando o tipo selvagem CS tensão a 25 ° C, 20 min de interação é suficiente para gerar claros "vencedores" e "perdedores" e observar mudanças nas estratégias de luta de ambos os indivíduos. Em experiências realizadas a temperaturas diferentes de 25 ° C ou com outros genótipos do que CS, no entanto, o tempo médio para o estabelecimento de uma relação de dominância robusto pode ser diferente. Por conseguinte, o período de combate deve ser ajustada através da realização de conjuntos de experiências preliminares. Finalmente, como pares de moscas são separados após suas primeiras lutas pode ser importante na preservação da memória de resultados de luta. Provavelmente, é importante para reduzir o movimento do aparelho e para ser suave durante a introdução do divisor de plástico em ordempara minimizar a perturbação dos animais.
O design do aparelho ea tampa de duas peças permitindo a separação das câmaras comportamentais em dois compartimentos iguais, se torna mais fácil para separar as duas moscas após as primeiras lutas e introduzir novos adversários na 2ª lutas. Além disso, como mostrado na Tabela 2, com pequenos ajustamentos do protocolo experimental, o mesmo equipamento pode ser utilizado para estudar corte, locomoção, ou mesmo a maioria das condutas da mosca de fruta no que deveria ser condições menos traumatizante para os animais experimentais. Possíveis novas melhorias no procedimento poderia ser a de introduzir alguma forma de controle termostático para dentro do aparelho (elemento piezoelétrico ou uma bobina de fazer circular o fluido de temperatura controlada) para permitir a fácil utilização de reagentes sensíveis à temperatura (ts1 shibire, canal dTRPA1).
Em resumo, temos desenvolvido um novo aparelho que oferece uma nova estratégia para o estudo da agressão iN moscas da fruta em que a manipulação de moscas antes, durante e após as experiências foi eliminado. Todas as medidas comportamentais são melhoradas com a nova aparelho, quando em comparação com vários outros modos comuns de manuseamento de moscas. Talvez um comentário mais geral de fazer é que, essencialmente, todos os experimentos comportamentais em ambientes de laboratório envolvem experimentadores pegar ou de outras formas, cuidar dos animais. Apesar dos esforços para ser gentil neste manuseio, este é susceptível de ser estressante para os animais. Ele pode ser útil para o desenvolvimento de métodos para eliminar esta manipulação sempre que possível, para que os animais possam ser observados sob um pouco mais condições normais.
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Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por doações do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (GM099883 e GM074675) para EAK Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Agradecemos ao povo da nossa oficina mecânica na Harvard Medical School para a concepção do aparelho comportamental (contacto: http://mikesmachine.com).
Contribuições Autor: ST, BC projetou o aparelho comportamental. ST concebida e optimizada do protocolo experimental. ST e BC realizadas e analisadas as experiências. ST, EAK e BC escreveu o jornal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drosophila melanogaster pupa | Bloomington Stock Center | ||
| Standard fly food | Fabricated in-house. | ||
| Behavioral chambers | Mike machine | Fabricated in-house. Directly contact the compagny for more informations. | |
| Borosilicate glass vials | VWR International | 47729-576 | 16 x 10 mm |
| Cotton | Fisherbrand | 22-456-881 | Any brand can be used |
| Pasteur pipettes | VWR International | 53300-567 | |
| Paintbrush | Blick Art Material | 06157-7030 | Round , Size 3/0 |
| Toothpick | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Acrylic paint (blue/white) | Blick Art Material | 01637-5172/01637-1022 | Any brand can be used |
| Dry active yeast | Sigma | YSC2-500G | |
| Srew cap tube | VWR International | 10011-394 | 15 mm diameter, 10 mm height |
| Eppendorf | VWR International | 22363212 | |
| Tape | N/A | N/A | Any brand can be used |
| Plastic slices | Electron Microscopy Sciences | 70329-40 | 22 x 40 x 0.25 mm Thickness |
| Light source (bulb) | VWR International | 500003-418 | Any brand can be used |
| Timer | VWR International | 62344-641 | Any brand can be used |
| Incubator | Percival | Directly contact the constructor for more informations. | |
| Carbon Dioxide Dry (CO2) | Medical-Technical Gases, Inc | 14H31 | |
| Binocular | Nikon | SMZ-745 | Any brand can be used |
| Camera (SONY Handycam HDR-CX330) | B&H | SOHDRCX330B | Any brand can be used |
| Computer | With a minimum of 1.4 Ghz Processor, running Microsoft Windows or Machintosh HD | ||
| ClipWrap | Download online | Any importing software can be used | |
| QuickTime Player | Download online | Any reading software can be used | |
| GraphPad Software | Online | Any statistical software can be used |
References
- Chen, S., Lee, A. Y., Bowens, N. M., Huber, R., Kravitz, E. A. Fighting fruit flies: a model system for the study of aggression. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5664-5668 (2002).
- Hsu, Y., Earley, R. L., Wolf, L. L. Modulation of aggressive behaviour by fighting experience: mechanisms and contest outcomes. Biol Rev Camb Philos Soc. 81, 33-74 (2006).
- Yurkovic, A., Wang, O., Basu, A. C., Kravitz, E. A. Learning and memory associated with aggression in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17519-17524 (2006).
- Penn, J. K., Zito, M. F., Kravitz, E. A. A single social defeat reduces aggression in a highly aggressive strain of Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12682-12686 (2010).
- Trannoy, S., Chowdhury, B., Kravitz, E. A. Handling alters aggression and 'loser' effect formation in Drosophila melanogaster. Learn Mem. 22, 64-68 (2015).
- Trannoy, S., Kravitz, E. A. Learning and memory during aggression in Drosophila: handling affects aggression and the formation of a ''loser'' effect. Journal of Nature and Science. 1 (3), e56 (2015).
- Alekseyenko, O. V., Chan, Y. B., Li, R., Kravitz, E. A. Single dopaminergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 6151-6156 (2013).
- Dierick, H. A., Greenspan, R. J. Serotonin and neuropeptide F have opposite modulatory effects on fly aggression. Nat Genet. 39, 678-682 (2007).
- Williams, M. J., et al. Regulation of aggression by obesity-linked genes TfAP-2 and Twz through octopamine signaling in Drosophila. Genetics. 196, 349-362 (2014).
- Chase, I. D., Bartolomeo, C., Dugatkin, L. A. Aggressive interactions and inter-contest interval: how long do winners keep winning? Anim. Behav. 48, 393-400 (1994).
- Goessmann, C., Hemelrijk, C., Huber, R. The formation and maintenance of crayfish hierarchies: behavioral and self-structuring properties. Behav Ecol Sociobiol. 48, 418-428 (2000).
- Sturtevant, A. H. Experiments on sex recognition and the problem of sexual selection in Drosophila. J Animal Behav. 5, 351-366 (1915).
- Jacobs, M. E. Influence of light on mating of Drosophila melanogaster. Ecology. 41, 182-188 (1960).
- Dow, M. A., von Schilcher, F. Aggression and mating success in Drosophila melanogaster. Nature. 254, 511-512 (1975).
- Hoffmann, A. A laboratory study of male territoriality in the sibling species Drosophila melanogaster and D. simulans. Anim. Behav. 35, 807-818 (1987).
- Vrontou, E., Nilsen, S. P., Demir, E., Kravitz, E. A., Dickson, B. J. fruitless regulates aggression and dominance in Drosophila. Nat Neurosci. 9, 1469-1471 (2006).
- Nilsen, S. P., Chan, Y. B., Huber, R., Kravitz, E. A. Gender-selective patterns of aggressive behavior in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12342-12347 (2004).
- Fernandez, M. P., Kravitz, E. A. Aggression and courtship in Drosophila: pheromonal communication and sex recognition. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 199, 1065-1076 (2013).
- Alekseyenko, O. V., et al. Single serotonergic neurons that modulate aggression in Drosophila. Current biology : CB. 24, 2700-2707 (2014).
- Asahina, K., et al. Tachykinin-expressing neurons control male-specific aggressive arousal in Drosophila. Cell. 156, 221-235 (2014).
- Andrews, J. C., et al. Octopamine neuromodulation regulates Gr32a-linked aggression and courtship pathways in Drosophila males. PLoS genetics. 10, e1004356 (2014).
- Zwarts, L., et al. Complex genetic architecture of Drosophila aggressive behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17070-17075 (2011).
- Dierick, H. A. A method for quantifying aggression in male Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 2, 2712-2718 (2007).
- Wang, L., et al. Hierarchical chemosensory regulation of male-male social interactions in Drosophila. Nat Neurosci. 14, 757-762 (2011).
- Davis, S. M., Thomas, A. L., Nomie, K. J., Huang, L., Dierick, H. A. Tailless and Atrophin control Drosophila aggression by regulating neuropeptide signalling in the pars intercerebralis. Nat Commun. 5, 3177 (2014).
- Yuan, Q., Song, Y., Yang, C. H., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Female contact modulates male aggression via a sexually dimorphic GABAergic circuit in Drosophila. Nat Neurosci. 17, 81-88 (2014).
- Perron, J. M., Huot, L., Corrivault, G. W., Chawla, S. S. Effects of carbon dioxide anaesthesia on Drosophila melanogaster. J Insect Physiol. 18, 1869-1874 (1972).
- Joachim, D., Curtsinger, J. W. Genotype and anesthetic determine mate choice in Drosophila melanogaster. Behav Genet. 20, 73-79 (1990).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. J Insect Physiol. 46, 439-442 (2000).
- Greenspan, R. J. Fly Pushing: The theory and Practice of Drosophila Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. (1997).
- Cabral, L. G., Foley, B. R., Nuzhdin, S. V. Does sex trade with violence among genotypes in Drosophila melanogaster? PLoS One. 3 (4), e1986 (2008).
