Abstract
Fagocitosi è un processo fondamentale attraverso il quale le cellule immunitarie innate fagocitare batteri, cellule apoptotiche o altre particelle estranee al fine di uccidere o neutralizzare il materiale ingerito, o di presentarlo come antigeni e di avviare le risposte immunitarie adattive. Il pH di fagosomi è un parametro critico regolazione fissione o fusione con endomembrane e l'attivazione degli enzimi proteolitici, eventi che permettono al vacuolo fagocitosi di maturare in un organello degradativa. Inoltre, è richiesto di traslocazione H + per la produzione di elevati livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono essenziali per l'uccisione efficiente e segnalazione ad altri tessuti dell'ospite. Molti patogeni intracellulari sovvertono uccisione fagocitico limitando phagosomal acidificazione, sottolineando l'importanza del pH in phagosome biologia. Qui si descrive un metodo per misurare raziometrica phagosomal pH nei neutrofili con fluoresceina isotiocianato (FITC) -labeled zymosan come phagocytic targETS e live-cell imaging. Il saggio si basa sulle proprietà di fluorescenza di FITC, che si spegne da pH acido quando eccitato a 490 nm ma non quando eccitato a 440 nm, permettendo la quantificazione di un rapporto pH-dipendente, piuttosto che di fluorescenza assoluta, di un singolo colorante. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'esecuzione in loco di calibrazione tintura e la conversione del rapporto di valori reali di pH. Single-dye metodi raziometriche sono generalmente considerati superiori a singola lunghezza d'onda o protocolli pseudo-raziometrico dual-dye, in quanto sono meno sensibili alle perturbazioni, come lo sbiancamento, concentrarsi modifiche, variazioni laser, e l'etichettatura irregolare, che distorcono il segnale misurato. Questo metodo può essere facilmente modificato per misurare il pH in altri tipi di cellule fagocitiche e zymosan può essere sostituita da qualsiasi altra particella contenente ammina, da perline inerti ai microrganismi viventi. Infine, questo metodo può essere adattato a fare uso di altre sonde fluorescenti sensibili a diversi intervalli di pH o altri phagosomattività al, rendendolo un protocollo generale per l'imaging funzionale di fagosomi.
Protocol
Etica Dichiarazione: Tutte le manipolazioni sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le linee guida del Comitato delle Università di Ginevra Animal Research.
1. Preparazione di obiettivi fagocitiche
- Aggiungere 20 mg di zimosan essiccata a 10 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS). Vortex e calore in un bagno di acqua bollente per 10 min. Raffreddare e centrifugare a 2000 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante, risospendere in 1 ml di PBS e ultrasuoni per 10 minuti in un bagno sonicatore acqua. Trasferire 500 microlitri di due provette da 1,5 ml. Centrifugare a 11.000 g per 5 min.
- Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di PBS. Il zymosan bollito può essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C.
- Lavare zymosan due volte in 500 microlitri preparate 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 come sopra (punto 1.2).
- Risospendere in 490 microlitri dopo il lavaggio finale. Aggiungere 10 ml di 10 mg / ml FITC sciolto in dimetil sulfoxide (DMSO), vortice, coprire con un foglio, e incubare con agitazione per 4 ore a temperatura ambiente.
- Per rimuovere il colorante, lavare come in precedenza (punto 1.2), prima con 0,5 ml di DMSO + 150 l di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 300 ml di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 450 l di PBS, poi PBS da solo.
- Conte zymosan utilizzando un emocitometro. Aggiungere 1 ml di zymosan a 500 microlitri di PBS, vortex, quindi aggiungere 10 microlitri al bordo della camera dell'emocitometro, dove incontra il coprioggetto posto sopra la griglia centrale. Montare il emocitometro su un microscopio in campo chiaro equipaggiato con un obiettivo 20X.
- Focus su nell'angolo in alto a sinistra contenente 16 piazze e contare tutte le particelle zymosan in questo settore con un contatore riscontro mano. Ripetere con l'angolo in basso a destra. Calcolare la concentrazione zymosan utilizzando la seguente equazione: concentrazione Zymosan = Count / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Zymosan etichettati, possono essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C.
- Opsonize l'etichetta wi zymosanTh A anticorpo anti-coniglio di zymosan a diluizione 1: 100. Vortex e incubare per 1 ora in un bagno d'acqua a 37 ° C. Lavare con 500 microlitri di PBS come sopra (punto 1.2).
Nota: Sonicazione è altamente raccomandato, in particolare dopo opsonizzazione, come zymosan tende a formare grumi che possono rendere l'analisi più difficile in seguito. Opsonizzazione con il 65% v / v di ratto o siero umano può essere utilizzato in alternativa. - Conte zymosan utilizzando un emocitometro come descritto nei passaggi 1,7-1,8, e portare a 100 x 10 6 particelle / ml. Opsonizzazione con altri stimolatori fagocitosi, come complemento o no opsonizzazione, può essere effettuata in alternativa.
2. Live Video Microscopia
- Isolare neutrofili principale del mouse come descritto in dettaglio altrove 38.
- In alternativa, utilizzare qualsiasi tipo di cellula fagocitica. Mantenere neutrofili sul ghiaccio in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 5% di siero fetale bovino (v / v), penicillina 200 U / streptomycin, ad una concentrazione di 10 x 10 6 cellule / ml fino al momento dell'uso. Altri tipi di cellule possono essere seminate 1-4 giorni prima.
- Aggiungere 2 x 10 5 (20 ml) di neutrofili al centro di un piatto fondo di vetro 35 mm, diffondere il calo aggiungendo 50 ml di terreno ed incubare a 37 ° C per 5 minuti per consentire cellule di aderire.
- Aggiungere 1 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) riscaldato a 37 ° C che contiene la specifica MPO idrazide inibitore 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 micron). Non specifici inibitori MPO, come il sodio azide (5 mm), possono anche essere utilizzati, ma sono state recentemente suggerito di esercitare ulteriori effetti non specifici sul pH 39.
- Montare il piatto su un microscopio a fluorescenza widefield dotato di un sistema di riscaldamento 37 ° C e un obiettivo 40X olio. Incubare le cellule senza l'imaging per 10 minuti per consentire alle cellule e attrezzature equilibrare.
- Regolare le impostazioni del microscopio per acquisire un'immagine di trasmissione in campo chiaro [phase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC), se disponibile] con 440 nm o 490 nm di eccitazione e 535 nm di emissione ogni 30 sec.
- Regolare il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione secondo il sistema microscopio per evitare troppo photobleaching e fototossicità e seconda delle domande sperimentali viene chiesto. Inizia l'acquisizione delle immagini.
- Dopo 2 min, aggiungere 10 x 10 6 (50 microlitri) opsonizzati FITC-zymosan al centro del piatto. Regolare bersaglio: i rapporti di cellule a seconda del tipo di fagociti e target utilizzato.
- Continuare di imaging per 30 min. Dopo 30 minuti fermare l'acquisizione time-lapse e avviare un timer. Spostare lo stadio e catturare più di 10 istantanee in diversi campi di vista di immagine altri fagosomi, tutti a 5 minuti.
3. taratura e controllo Esperimenti
- Preparare le soluzioni di taratura pH (ricette sono descritti nella Tabella 1) prima del giorno di esperimento e congelare in 10 ml aliquote.Scongelare le soluzioni di taratura e la calda a 37 ° C in un bagno d'acqua. Controllare il pH con un pHmetro e registrare il pH effettivo di soluzioni.
- Montare una pompa peristaltica sul fondo piatto di vetro prima acquisizione dell'immagine ed eseguire la microscopia video dal vivo come descritto sopra (sezione 2).
- Alla fine del periodo di acquisizione 30 min accendere la pompa per rimuovere la soluzione all'interno del piatto, aggiungere 1 ml della prima soluzione di calibrazione e arrestare la pompa.
- Attendere che il segnale si stabilizza, di solito 5 min. Ripetere con ogni soluzione di calibrazione.
- Effettuare almeno una calibrazione al giorno sperimentale, e calibrare iniziando con il più alto pH e sequenzialmente lavorare al minimo, così come a partire dal pH basso e lavorando in sequenza verso l'alto.
- Come controllo, aggiungere 100 ml di 100 mM inibitore NADPH ossidasi difenil propionium ioduro (DPI) diluiti in HBSS alle cellule in 900 microlitri HBSS nel piatto fondo di vetro, eincubare per 10 min.
- Avviare l'acquisizione e aggiungere zymosan come sopra (punto 2.7). Dopo 15 min di fagocitosi, aggiungere 10 ml di 10 mM inibitore V-ATPasi concanamycin A (ConcA) diluiti in HBSS e continuare l'imaging per altri 15 min.
4. Analisi
- L'analisi dei filmati time-lapse e istantanee phagosome.
Nota: Le seguenti istruzioni sono specifici per ImageJ. Step-by-passo le istruzioni possono variare ampiamente a seconda del software utilizzato, ma le funzioni descritte in questa sezione sono disponibili nella maggior parte dei software di analisi immagine professionale.- Aprire le immagini con il software di analisi di immagine professionale. Sottrarre il fondo nel canale 490 tracciando una piccola ROI piazza con lo strumento di selezione del poligono piazza in una zona dove non ci sono le cellule, e facendo clic su Plugins> BG Sottrazione di ROI. Poi caricare lo stesso ROI sul canale 440 facendo clic su Modifica> Selezione> Ripristina selezione e ripetere.
- Fare un rapporto di immagine a 32 bit del canale 490 diviso per il canale 440 cliccando processo> Calcolatrice Immagine ..., selezionando le immagini appropriate nei menu a scorrimento visualizzati Image1 e Image2, quindi selezionando 'Divide' nel menu a discesa Operazione , e controllando il risultato casella di controllo a 32 bit (float).
- Cambia il look-up table colori per una codifica a colori compatibile rapporto facendo clic su Immagine> tabelle di ricerca> Arcobaleno RGB. Soglia l'immagine rapporto di eliminare 0 e infinito pixel facendo clic su Immagine> Regola> Soglia .... Regolare le barre di scorrimento in modo che zymosan appare in rosso e fare clic su Applica, assicurandosi che i pixel dello sfondo Imposta la casella di controllo per NaN è selezionata.
- Combinate questo rapporto stack con il canale in campo chiaro in un composito multi-canale cliccando Immagine> Colore> Unisci canali, e selezionando l'immagine in campo chiaro nel menu a discesa dei canali grigio e l'immagine il rapporto nel menu a discesa canale verde, e selezionando laMantenere immagini di origine check-box. Scansione film time-lapse o istantanee per determinare quale phagosomes devono essere analizzati. Il canale in campo chiaro è utile per questo.
- Disegna regioni di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione ovale poligono attorno fagosomi, e aggiungerli al gestore ROI facendo clic su Analizza> Strumenti> ROI Manager> Aggiungi. Misurare il loro rapporto di intensità zymosan facendo clic su Altro> multimisura e de-selezionando l'Una riga per fetta casella di controllo.
- Per i filmati time-lapse, pista phagosomes uno alla volta disegnando un ROI, digitando CTRL + M per misurare ogni punto di tempo, e spostando il ROI in caso di necessità di monitorare i valori di intensità nel corso del tempo. Copiare le misurazioni dalla finestra Risultati in un foglio elettronico.
Nota: Analisi di 15 (5 andamenti temporali per esperimento x 3) esperimenti indipendenti è ideale, ma più o meno può essere richiesta a seconda della variabilità osservata. Salvataggio delle ROI è sempre consigliato. Alcuni pacchetti software consentono regi immaginestrazione e aggiornamento dinamico di ROI, facilitare questo parte dell'analisi.
- La conversione da fluorescenza a valori di pH
- Misurare il rapporto 490/440 per phagosomes nella calibrazione film time-lapse, come descritto nella sezione 4.1.
- In un foglio di calcolo, tracciare i valori del rapporto nel corso del tempo, e calcolare i valori medi del rapporto da tutti i fagosomi all'interno del campo di vista (di solito, tra 5-20) da 5 punti temporali entro la metà del periodo di tempo corrispondente ad ogni calibrazione pH soluzione. (Vedi anche le caselle rosse nella figura 5A.)
- Tracciare questi medi 490/440 valori del rapporto contro il pH attuale di misura. Combina almeno 3 tarature indipendenti in un unico grafico. Utilizzare un pacchetto software statistico o numerico per eseguire una regressione lineare (migliore misura della curva), di solito per una equazione sigmoidale.
Nota: per esempio, nella Figura 5B l'equazione utilizzata era un sigmoidale Boltzmann [Y = inferiore + ((Alto-Basso)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], dove i valori di Y sono i rapporti 490/440, X sono i valori di pH e alto, in basso, i parametri V50 e pendenza sono calcolati dal software. - Usare l'equazione ottenuto di trasformare valori di rapporto al pH.
Nota: Per esempio, nella Figura 5B nell'equazione ottenuto per la curva di calibrazione in presenza di sodio azide è 490/440 Ratio = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 + EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Risolvendo per pH dà la seguente equazione: pH = 6.993 - 0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))].
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Representative Results
Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi per un esperimento in cui il pH phagosomal dei neutrofili topo primari isolati dal midollo osseo di wild-type o Hvcn1 - / - sono stati confrontati topi. Per un esperimento riuscito, è importante ottenere abbastanza fagosomi all'interno del campo visivo durante tutta la durata del film accelerato, evitando troppi fagosomi, che sarà poi essere più difficile segmento durante l'analisi delle immagini. La figura 1 mostra esempi di confluencies buoni e cattivi. Per il tempo-dipendente e snapshot analisi, particelle zymosan esterni devono essere distinte da fagosomi e esclusi dall'analisi. Figura 2 illustra come l'immagine in campo chiaro può essere utile per aiutare a distinguere le particelle zymosan esterni da fagosomi. La figura 3 mostra esempi di tipica phagosome pH time-corsi di wild-type rispetto a Hvcn1 - / - Figura 4 illustra l'effetto di aggiunta dell'inibitore NADPH ossidasi DPI, che si traduce in una rapida acidificazione, seguita da aggiunta della V-ATPasi inibitore ConcA, che inverte l'acidificazione. Tali esperimenti possono essere fondamentale per dimostrare che le sonde sensibili al pH stanno lavorando all'interno phagosomes come dovrebbero. Una volta portate calibrazione tipico è rappresentato in figura 5, con rettangoli che indicano l'intervallo di valori del rapporto utilizzati per costruire la curva di calibrazione. La figura 5 mostra inoltre come colorante clorurazione attraverso l'attività MPO possono influenzare il intraphagosomal pH-risposta di FITC, sottolineando che le sonde possono rispondere in modo diverso di quanto previsto all'interno del phagoso ambiente Mal e l'importanza di calibrazione situ.
Figura 1. appropriata confluenza e porta: rapporto cellulare Il pannello di sinistra mostra un esempio in cui confluenza cella è troppo scarsa e il bersaglio. Rapporto cellulare è troppo basso, diminuendo la probabilità che un evento si verifichi fagocitaria nel campo visivo. Il pannello centrale mostra un esempio in cui confluenza delle cellule è troppo alta e le cellule sono affollate. In queste condizioni, le cellule non possono avere abbastanza spazio per muoversi e trovare i loro bersagli, o può strisciare su ogni altra analisi rendere più difficile in seguito. Il pannello di destra mostra una confluenza cellulare ideale e obiettivo iniziale: rapporto cellulare, dove molte cellule e gli obiettivi possono essere viste e tuttavia ancora essere chiaramente distinti gli uni dagli altri. Coniugati con zymosan viene visualizzato in verde e la barra della scala rappresenta 10 micron. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. phagosomes distintive e zymosan uningested. Il pannello di sinistra mostra un'immagine brillante in campo dalla fusione e un rapporto di 490/440 FITC-zymosan, mentre il pannello di destra mostra l'immagine in campo chiaro da solo. Fagosomi (piccole frecce verdi) possono essere distinte da particelle esterne, che o non collaborano localizza con cellule (breve freccia rossa) o la cui fluorescenza non corrisponde con un centro scuro (lunga freccia rossa) circondato da un anello luminoso, tipico di fagosomi l'immagine in campo chiaro (frecce verdi) in. Le barre di scala rappresenta 10 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Corsi Tempo, media pH e di rapporto istogrammi di wild-type e Hvcn1 - / -. Phagosomes neutrofili (A) gli andamenti temporali tipici di phagosomal pH mostra che mentre nel wild-type neutrofili (blu) il pH è neutro (linea tratteggiata ) o leggermente alcalino (linea continua) durante i primi punti temporali dopo l'ingestione, i fagosomi di Hvcn1 - / - neutrofili (rosso) possono sia Alcalinizzare (linea continua) e acidificare (linea tratteggiata). (B) La compilazione di istantanee presa 30-35 minuti dopo l'aggiunta di obiettivi permette al media pH phagosomal popolazione da calcolarsi da un gran numero di fagosomi (wild-type: n = 5/1898/383 e Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 / esperimenti phagosomes / cellule, i bar sono mezzi ± SEM, ns non significativo). (C) Istogrammi di FITC zymosan rapporti rivelano differenze di phagosomal pH tra wild-type e Hvcn1 - / - neutrofili. (Questa cifra è stata modificata da [19], con il permesso.) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Effetti di inibitore NADPH ossidasi DPI e V-ATPasi inibitore ConcA su phagosomal pH. Pre-incubazione in 10 mM DPI determinato un rapido acidificazione dei fagosomi poco dopo l'ingestione, che è stato invertito mediante aggiunta di 100 nM ConcA (freccia). (Questa cifra è stata modificata da [19], con il permesso.) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. pH calibrazione dell'ora portate e effetti di inibizione MPO sulla calibrazione di FITC-zymosan. (A) Una tipica curva di calibrazione pH intraphagosomal FITC-zymosan. Scatole rossi indicano l'intervallo di valori del rapporto utilizzati per costruire la curva di calibrazione. I valori di pH delle soluzioni utilizzate e gli orari in cui le soluzioni vengono modificati sono indicati da frecce. La curva rappresenta la media di 10 fagosomi all'interno di un singolo campo di vista. (B) Inibizione di MPO con l'azide non specifico inibitore di sodio (5 mM, Inh MPO) aumenta la gamma dinamica di risposte pH-dipendente FITC-zymosan intraphagosomal. I punti sono medie ± SEM (Questo dato è stato modificato da [19], con il permesso.) Clicca qui per vedere a laVersione rger di questa figura.
| 1.1 | (2x) Base | |||||
| Buffer | Azione | Finale (1x) | Per 500 ml (2x) | |||
| KCl | 1 M | 140 mm | 140 ml | |||
| MgCl 2 | 1 M | 1 mM | 1 ml | |||
| EGTA | 1 M | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCl | 1 M | 20 mm | 20 ml | |||
| 1.2 | Buffer | Azione | Definitivo(1x) | Scopo | ||
| MES | 1 M | 20 mm | per pH 5.5-6.5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mm | per pH 7,0-7,5 | |||
| Tris | 1 M | 20 mm | per pH 5,5-6,7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mm | per pH 5,5-6,8 | |||
| 1.3 | Ionofori | Archivio (100% EtOH) | Finale (1x) | |||
| Nigericina | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensin | 50 mm | 5 pM | ||||
| 1.4 | Per 50 ml | |||||
| pH | 2x Base | Tipo Buffer | Buffer Vol. | Nigericina | Monensin | |
| 5.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 6.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 6.5 | MES | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | ||
| 7.0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 7.5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 8.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 8.5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 9.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 microlitri | 5 ml | |
| Aggiustare il pH conKOH o HCl | ||||||
Tabella 1. Ricetta per la preparazione di soluzioni di taratura. 1.1) ricetta per preparare 500 ml di una soluzione di base 2x. 1.2) ricetta per preparare i diversi buffer utilizzati secondo il pH della soluzione di calibrazione. 1.3) ricetta per preparare i ionofori utilizzati nelle soluzioni di taratura. 1.4) ricetta per preparare 50 ml di ciascuna soluzione di calibrazione utilizzando la base, tamponi e ionofori descritti in 1.1-1.3.
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Discussion
Sebbene più tempo rispetto metodi alternativi, come la spettroscopia e FACS, che impiegano una simile strategia di utilizzo di un colorante sensibile al pH accoppiato obiettivi ma misurano il pH medio di una popolazione di fagosomi, microscopia offre diversi vantaggi. Prima è che interno ed esterno vincolati, ma non interiorizzato, le particelle possono essere facilmente distinguibili, senza dover aggiungere altre sostanze chimiche, come trypan blu o di anticorpi, per placare o etichettare particelle esterne, rispettivamente. La seconda è che in seguito le cellule in tempo reale permette ai ricercatori di osservare molteplici aspetti del processo di fagocitosi simultaneo e così effetti sulla migrazione, di rilevamento e le particelle vincolanti potrebbero essere facilmente distinguere qui, considerando che potrebbe essere trascurato con metodi basati sulla popolazione. Inoltre, la sincronizzazione di apertura di fagocitosi, spesso eseguita da cellule mettendo a 4 ° C, che potrebbe turbare gli altri eventi di traffico a causa di shock freddo 40,41, non èt necessario in quanto tempo zero si può discernere direttamente. Infatti, quando si esegue la microscopia vivo, questo 4 ° tecnica di sincronizzazione C è raccomandato se i periodi di tempo vicino alla apertura di fagocitosi la condensa che si forma sul fondo del piatto durante il cambiamento di temperatura può mescolarsi con l'olio di immersione obiettivo e catturando differenze di temperatura tra i componenti di riscaldamento piatto e microscopio possono causare attenzione si sposta. Un terzo vantaggio deriva dal fatto che fagosomi sono intrinsecamente eterogenea da diversi parametri tra cui, ma non limitati a, pH 42, e certi effetti sul phagosome pH potrebbero essere più sottile, cambiando la distribuzione del pH phagosomal piuttosto che la popolazione media, come è stato mostrato in Figura 3. Tali osservazioni possono dare spunti più profondo meccanicistici nella regolamentazione dei phagosomal pH.
Nel presente studio, è stato scelto come FITC il colorante sensibile al pH di scelta perché èeconomico, ampiamente disponibili, e ha soprattutto un pKa di 6.5 con una gamma dinamica comprende pH da 3 a 9 nella sua forma libera 37, che corrispondeva alla gamma pH originariamente previsto di neutro o leggermente alcalino, secondo studi precedenti 29,30. Più recentemente uno studio che impiega una sonda pH diverso chiamato SNARF, che ha un pKa più fondamentale di 7,5, valori di pH inaspettatamente stimati vanno 1-2 unità di pH più alcalino per entrambi wild-type e Hvcn1 - / - fagosomi neutrofili 39. Così, la scelta del sensore pH è un parametro importante da considerare a seconda dell'applicazione. In linea di principio, il metodo presentato qui può essere facilmente adattato ad impiegare altri coloranti sensibili al pH, come SNARF e 2 ', 7'-bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein (BCECF), i cui derivati succinimidyl-estere sono facilmente accoppiati ammina contenenti particelle, come zymosan. Infatti, i sensori non sono necessariamente limitate ai coloranti fluorescenti, come ratiometproteine sensibili pH ric, ad un Sypher 43, potrebbe essere trasdotte e espresse dai microrganismi. Esistono diverse alternative non raziometrici anche, in particolare la versione rossa del colorante pHrodo, che può essere utilizzato in combinazione con la proteina fluorescente verde (GFP) proteine o la proteina sensibile al pH pHluorin -tagged. Tuttavia, a causa degli effetti potenzialmente grandi che la dura ambiente intraphagosomal può avere sulla coloranti e proteine ivi mirate, queste sonde dovrebbero essere minima combinata con pH sonde insensibili da impiegare nel derivare una pseudo-ratio. Come esemplificato in figura 5, calibrazioni esperimenti possono esporre gli effetti dei danni colorante come gamma dinamica ridotta o distorta. Su una nota pratica, gli esperimenti di calibrazione non sono sempre perfette e possono essere irrealizzabile eseguire dopo ogni esperimento. Di conseguenza, valori del rapporto possono occasionalmente cadere fuori della gamma di taratura e portare a valori impossibili alla conversione nel pH. Può essere approprIATE a uno esprimere questi valori fuori scala come "maggiore / minore di o uguale a" valori minimi di calibrazione di pH massimo e, o per esprimere tutti i valori come rapporti e stima con pH che rapporti medi rappresentano.
Come evidenziato da DPI e controlla Conca, la produzione di ROS e l'attività V-ATPasi sono i principali fattori che determinano phagosomal pH. Infatti, in molte situazioni, cambiamenti nei livelli di produzione di ROS possano costituire il fondamento differenze phagosomal pH, specialmente nei neutrofili, e la misurazione di phagosomal produzione di ROS e del pH spesso vanno di pari passo. Una parola di cautela è che entrambi i farmaci prestano comprendere meglio l'attività degli enzimi che inibiscono ma non alla loro posizione all'interno della cellula. Entrambi gli enzimi sono complessi multi-subunità cui componenti individuo deve traffico verso phagosomes 4, e la loro mancanza di attività sul fagosomi può derivare da traffico di montaggio o difetti, piuttosto che effetti diretti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
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- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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