Developmental Biology

鸡小脑切片的体外培养和空间上有针对性的颗粒细胞前体电穿孔

Published: December 14, 2015 doi: 10.3791/53421

Michalina Hanzel¹, Richard J.T. Wingate¹, Thomas Butts²

¹MRC Centre of Developmental Neurobiology, King's College London, ²School of Biological and Chemical Sciences, Queen Mary, University of London

Summary

小脑外部颗粒层是最大的过境扩增在显影脑的部位。在这里，我们提出了一个协议，以目标基因改造这个层扩散采用体外电击和小脑切片文化从胚胎第14天鸡胚的高峰。

Abstract

小脑外部颗粒层（EGL）是最大的中转放大在发育中的大脑的网站，并为研究神经元的增殖和分化一个很好的典范。另外，其增殖能力的进化改进一直负责小脑大小在羊膜急剧扩张，使得小脑为脊椎动物脑的EVO发育生物学研究的优良模型。东瀛的组成细胞，小脑颗粒祖细胞，也代表来源的显著细胞的髓母细胞瘤，最常见的小儿神经肿瘤。以下中转扩增，颗粒的前体的径向迁移进入其中它们代表最大的神经元群中的成熟哺乳动物脑小脑的内部颗粒层。在小鸡，东瀛增殖高峰出现对妊娠的第二周结束。为了目标遗传修饰该层在泛滥的高峰期，我们已经制定了通过小脑切片的离体电穿孔的基因操纵从胚胎第14天鸡胚的方法。这种方法概括体内颗粒神经元发展的几个重要方面，并会生成一个透彻的了解小脑颗粒细胞的增殖和分化是有用的，因而小脑发育，进化和疾病。

Introduction

小脑坐在后脑的前端，并负责感觉和运动处理中的成熟大脑的整合以及调节更高的认知过程^1。在哺乳动物和鸟类，它具有一个精心形态并被大量面理化，的祖细胞的广泛过境扩增产物产生超过一半在成人脑的神经元的发育过程中。小脑一直研究的课题的神经生物学家了几个世纪，在分子的时代也同样收到显著的关注。这不仅涉及其固有的吸引生物学，而且这样的事实，它在很大程度上与人类疾病包括发育的遗传性疾病如孤独症谱系障碍^2，最突出的是小脑癌，髓母细胞瘤^3，这是最普遍的儿童脑瘤。重要的是，它是内的wh的优良模型系统非物质文化遗产研究的命运分配和神经大脑发育过程中^4。近年来，它也被确立为大脑发育的比较研究模型系统，由于对整个可见的脊椎动物系统发育^5-10小脑形态的巨大差异。

小脑从菱1在后脑¹¹背侧半开发和发育是由两个主要祖种群，菱形唇缘和脑室区的。周围的后脑的神经上皮的背部区域的菱形唇延伸与屋顶板的边界。它是小脑^12-14的谷氨酸能神经元的兴奋性的发源地。脑室区产生了抑制GABA能神经元的小脑，最突出的是大浦肯野神经元^14,15。后来在发展（约13.5小鼠胚胎天; E6的小鸡^16），谷氨酸培罗成itors从菱形唇沿切线方向迁移，形成祖细胞的软脑膜层：所谓的外部颗粒层（EGL）二级祖区。正是这层经过广泛的过境放大，导致颗粒神经元的数量巨大，在成熟大脑中发现。

增殖在EGL早已被链接到子软脑膜位置而导致的切向迁移从菱形唇^17，与交换机细胞周期出口和祖细胞的神经元分化正在与他们的出口从外EGL层到中间关联EGL ^18。有丝分裂后的颗粒细胞的中间-侧向轴线广泛切线迁移发生在中间和内部的EGL ^19，最终径向迁移进入成熟小脑皮层的内颗粒层之前。从菱形唇在小脑表面细胞的迁移是依赖于CXCL12信号从软^20-22 23-25。有趣的是，电子显微镜研究¹⁷表明，EGL细胞增殖形态保持软脑膜接触，连接细胞的行为具有增殖能力的让人联想到哺乳动物的大脑皮层²⁶的基底祖细胞的方式。这反映在EGL的前述分层成三个子层是由不同的胞外环境，并在那里颗粒前体具有不同的基因表达签名^18限定。

在oEGL祖细胞增殖发生克隆大小正态分布使得当祖单独遗传标记在小鼠胚胎发育的末端，它们产生的有丝分裂后250-500克的中值平均ranule神经^27,28。扩散是依赖于有丝分裂SHH信号来自底层的浦肯野神经元^29-32。向SHH作出反应的能力已被证明是完全依赖于转录因子ATOH1的细胞中自主表达，在体外³³ 和体内^34,35。同样地，细胞周期出口和分化已被证明是取决于下游转录因子NEUROD1 ^36，这很可能ATOH1 ^37的直接阻遏的表达。

尽管这些进展，并且在解密的细胞周期出口^38-42的细胞生物学的基础相当大的进步，根本的分子机制（S）所依据决定退出细胞周期和从祖过渡到微分神经元，并且在内侧的EGL关联的有丝分裂后的切向迁移以及后来的开关以放射状迁移，仍然不完全理解。这是为了由于EGL的实验棘手的很大程度：它是迟显影，而且很难基因靶向，因为许多相同的神经性分子，可以在颗粒的前体的寿命的关键早些时候在菱形唇。为了解决这个问题，许多作者已经开发出在体内和体外电作为一种方法，目标在啮齿类动物中^43-48产后小脑。在这里，我们率先使用体外电穿孔在小鸡研究EGL，它代表在成本和便利方面相当大的优势。我们的电穿孔和体外切片鸡小脑组织培养的方法使用组织解剖从胚胎第14天的雏鸡在EGL扩散的高峰期。这种方法允许菱形唇的EGL的遗传靶向独立地，将设置了阶段为从颗粒的过渡的遗传解剖祖在有丝分裂后小脑颗粒神经元。

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Protocol

注：所有实验均用按照国王学院，英国伦敦和英国内政部的动物护理准则进行的。

1.解剖E14小脑

在38℃孵育棕色受精母鸡的蛋胚胎第14天。
使用蛋剪刀斩首鸡胚卵内并取出头到含有冰冷的PBS（图1A）培养皿。
使用标准镊子，使切口每只眼睛后面所有的方式，通过组织，消除眼睛和上颚。让所有的方式，通过咽去除下颌（ 图1B），第二个切口。
使用标准镊子，通过剥离它扔掉（ 图1C）从头骨的表面上的所有皮肤，去除额骨和顶骨，揭示大脑。
从腹侧方面，除去咽软骨和辅助间充质。
从背侧，小心LY去除间充质背到后脑，注意不要损坏软，以及独立的整个大脑（ 图1D）。
一路经中脑和后脑和独立的后脑，包括小脑（ 图1E）之间的组织做切口。
通过所有的方式，通过组织在小脑和后脑的翼片的两侧路口做切口，去除整个小脑，注意保持PIA的整个解剖的完整性（ 图1F）。取出形成脉络丛（ 图1G）。
移动解剖小脑入冰冷的HBSS中。

E14小脑2.切片培养

整个小脑传送到使用刮刀或3 ml的巴斯德吸管与尖端一个组织斩波的无菌平台切去加宽孔。用吸管去除多余的液体。
切在T整个产品小脑他使用该组织的切刀设定具有切割速度在最大的50％所需的取向，在300微米的厚度。组织的完整性是最容易被保存在矢状切面;然而，取向也是细胞分析的重要考虑因素（浦肯野细胞树突矢状对齐，而颗粒细胞轴突横向运行，垂直于浦肯野细胞树突的平面）。
使用3mL的巴斯德吸管，覆盖在冰切片小脑冷的HBSS。
转让于HBSS切片到含有冰冷的新鲜的HBSS使用3 ml的巴斯德吸管切头一个60毫米的培养皿。
在解剖显微镜下照射光纤光源，确保使用钟表制造商镊子各个切片的分离。识别片被电穿孔，根据他们组织的完整性和内 - 外的位置。
注：从胚胎通过切片孵化培养基中的每个夹层大约需要10-20分钟取决于UPOñ经验。进行解剖一次，以确保小脑花费最短时间斩首和体外培养的。

3.电穿孔切片

通过电穿孔的阳极固定到60毫米的培养皿用绝缘带的基部构造电穿孔室。添加约1 ml的HBSS中，以覆盖电极。
上放置覆盖在HBSS电极顶部上的0.4微米的培养插管。允许培养插管休息的电极确保总有插入件与电极之间的接触。
注意：在此设置中，培养插管的切片将休息的溶液的表面上，保持电路，但允许在阴极的空间定位。
传输标识切片（最多五个每培养插入）到使用3 ml的巴斯德吸管与切口尖端培养插管。独立，并允许定居到文化插入在sagitt人的方向。
使用移液管，除去过量的HBSS以使切片不再溶液沐浴。
使用P10移液管尖，吸管的DNA（在1微克/微升的浓度）用20％的快绿放在切片的目标区域的表面稀释。 20％的快速绿色确保粘稠的DNA溶液，防止DNA望而却步广泛散布。添加约5微升的DNA /快绿溶液到每个切片（图2B）。
放置在阴极上所需的目标组织电穿孔和用3×10伏，10毫秒持续时间的脉冲。避免与组织中的阴极直接接触。相反，采取的液体的表面张力的优点维持电导（放置阴极尽可能靠近组织尽可能没有实际接触的组织）。
根据需要重复DNA递送和电到EGL的多个区域每个人的小脑切片。
在电穿孔完成后，转移培养樱雪室温至30毫米的培养皿。
向每个培养，加入1毫升预热的培养基（基础培养基Eagle，0.5％（重量/体积）D - （+） - 葡萄糖，1％B27添加剂，2mM的L-谷氨酰胺，100U / ml青霉素， 100微克/ ml链霉素）的培养插管，使得培养插管是在与介质接触，但片没有在它沐浴下方。
孵育培养物，在37℃/ _6％CO 2的最多3天。更换所有培养基中，每24小时用新鲜预热培养基。
继文化，固定片（在4℃或O / N）上培养插入1小时在4％多聚甲醛在新的30毫米的菜，没有文化传媒。

4.成像小脑切片

以下定影，洗涤切片3次，每次5分钟，于PBS中。
用剃刀刀片，通过切割切片周围并除去切片并插入它粘附到的区域解剖从培养插入物的每个电穿孔和培养的小脑切片。做不试图从培养插入物表面上除去切片。
下一个盖玻片小心在大约1毫升含有DAPI（如果需要的话）的安装平台的安装片不引入气泡，并使用激光扫描共聚焦显微镜图像。
注意：成像参数可根据电穿孔将构建而改变，在个人用户的判断。

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Representative Results

本节说明可使用切片电和小脑的文化胚胎第14天的小鸡得到的结果的例子。小脑的解剖示于图1和电穿孔室设置示于图2，我们表明，这是可能的电穿孔，并成功地培养小脑切片，仍保持其结构和细胞形态在体外 （图3A）。目标电穿孔到个别的Folia容易实现（图3B）。我们成功地电穿孔的一些不同质粒的进入EGL细胞，并表明它是可能i）与报道构建观察他们的行为（图3C来标记细胞），ii）向测试可能的基因组区域中小脑细胞功能（图3D ），以及iii）操纵基因的细胞在EGL通过misexpressing感兴趣（图3E）的蛋白质。此外，在电穿孔的片药理操作是可能的（结果未显示）。培养后，可以执行额外的组织分析，如免疫组织化学或增殖测定（ 图3F）。我们由钙结合蛋白和PH3免疫染色进行组织健康分析和显示，组织完整性被维持至少3股利培养后（图4）。这些结果表明，EGL是现在可访问的和易于操作的结构，可以充分研究和遗传改变在小鸡的模型系统。

图1.解剖从E14鸡胚小脑的。（A）杀头的蛋小鸡，取下头上INTOA培养皿用冰冷的PBS。除去下颚和眼睛通过使切口眼后和咽（虚线）。从头骨的表面（B）去除皮肤。（三）删除额叶和顶骨和（D）的间质细胞和关节软骨周围取出大脑。 （E）在解剖显微镜下识别小脑的位置，位于大脑的后端。中脑和后脑（虚线）之间切断而留下小脑和腹侧后脑。 （F）使切口在小脑的横向结（梗）小脑从后脑（虚线）分开。从小脑的腹侧（G）拆下脉络丛（星号），直到只剩下一个完整的整体小脑附带的软。准备切片用纸巾chopp日前将小脑入冰冷的HBSS呃，请点击此处查看该图的放大版本。

图2.电室成立。 （一）定制的电室的画面。该腔室由一个电穿孔可靠地放置一个60毫米的培养皿的基础上的一个阳极。菜含有约1 ml的HBSS中，以覆盖电极。的培养插管应当以对与插入件与电极之间的恒定接触的电极中，并保持电路，但允许在阴极，这是由手操纵的空间定位。 （b）在片画面被电。片覆盖有该DNA /快绿溶液。将切片电作为欲望D：电可以针对一个大青叶或多个位置。电穿孔后插入件被放置在30mm的培养皿预热培养基并培养在培养箱。 1.阳极2.阴极3.文化插入4.培养皿1毫升HBSS 5.解剖显微镜从组织菜刀6.个别切片快速绿色染料7. DNA溶液。请点击此处查看这是一个更大的版本数字。

图3.代表性的成果。（一）申报表编码质粒的控制电到EGL的多个位置的低倍率的画面。该组织保持其结构和电穿孔的细胞显然是在小脑的厚厚的软膜下层可见。 （B）中的例如有针对性的电与控制GFP质粒。目标大青叶由星号表示。比例尺AB = 500微米。 （C），其中一个构建编码GFP由ATOH1增强驱动已经被电到EGL的一个例子。 ATOH1的表达式定义了EGL内的颗粒细胞前体。各种细胞的形态是显然在3股利可见和细胞行为进行监控。 （D）的标签的以下含有NEUROD1基因驱动的GFP推定保守的非编码元件（CNE）的构建体的电穿孔的一个例子。该CNE报告预期基于内生NEUROD1表达暗示该CNE在发展中发挥积极作用的细胞活性。 NEUROD1表达及其与颗粒细胞分化的开始。 （E）的一个例子，其中组织可以通过错误表达NEUROD1蛋白和在颗粒细胞behav的变化来遗传操作iour可以观察到。 （F）的一个例子，其中将电穿孔的组织（控制的GFP质粒）可以被固定和染色的增殖细胞，如磷组H3（PH 3）的标志物。比例尺CF = 50微米请点击此处查看该图的放大版本。

图中的文化4.组织的完整性和增殖。 （A - C）钙结合蛋白染色E14小脑组织在体外 （DIV）电与对照GFP质粒在1-3天。钙结合蛋白染色显示，组织的完整性被维持在培养至少3格。浦肯野细胞层不形成单层在这个阶段中小鸡发展，但它可以清楚地看出形成下方的层EGL其中，颗粒细胞（绿色）的位置。小脑组织2格培养（D）磷组H3（PH3）染色。 PH3染色是在EGL（箭头）可见的，但也可在其他小脑区域（箭头）。这种染色是代表所有阶段的文化研究（1-3格）的。比例尺AD =50μm的请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这里所报告的协议描述了解剖，电穿孔和从小鸡培养的胚胎第14天小脑切片的方法。该协议使电的靶向东瀛小灶地区，包括个别的小脑叶片孤立的目标。它使遗传分析和成像以高分辨率和便利性，并以较低的成本相比，在啮齿类动物中^43-47建立的技术。这样的分析是目前不可能在体内 ，由于延长的发育时间段，在小鼠EGL特异性遗传靶向的可能性很少，和的菱形唇与EGL之间的分子机制的共同性，这意味着改变可能影响EGL生物学经常不能被分析，因为它们影响菱形唇神经发生和废除的EGL形成^49。我们的系统因此表示靶向基因改造的EGL的S方面的一个重大进展比较利息，如非模型哺乳动物和爬行动物的也许pecifically，我们预计这将是适用于其它物种以外小鸡那个。

在进行切片培养电击技术，一些技术考虑是极为重要的。首先，片的坚固性在培养中存活而不一方面发生广泛的细胞死亡，或在另一失去结构完整性限制片在我们手中300微米的厚度。第二个重要的考虑是该DNA溶液，这确保的DNA电穿孔其浓度高到足以诱导遗传修饰的可见或相关级别的粘度。在注入到早期胚胎后脑DNA溶液OVO电中，约1％的快绿的染料浓度是典型的。然而，在我们的协议，我们通常使用的20％的快绿的浓度。这确保了充分可见COUS DNA溶液，以防止DNA的以下分注但电穿孔之前分散，但足够稀1介导高效电传导。

除了这些技术考虑，我们观察到，我们观察到体外增殖该行为并不精确匹配来自体内研究可能是由于软脑膜完整性被破坏的组织制备的预测。在这种条件下，当GFP表达构建体电穿孔，电穿孔的细胞的相当大的比例似乎已离开细胞周期仅一天培养后作为判断PH3染色（ 图3F）。这并不关联与预期的EGL增生的行为，凡在小鼠和鸡克隆增殖延伸到一个大的时间周期^27。该软调节增殖的含意是支持的观察，当我们电穿孔记者construc吨用GFP的NEUROD1调控元件驱动表达所有电穿孔的细胞表达一种天在培养物（图3D）。之后的GFP 在体内，该构建反映内源NEUROD1表达在标记内的EGL的是有丝分裂后细胞^36,37，而全长NEUROD1足以驱动细胞分化（图3E）。这表明，在某些条件下，可能无法保持细胞的增殖能力，因为它是在外部的EGL在体内等效阶段。 PH 3染色并但是表明，有很多增殖的培养，通常定位于EGL区域（图4D）。东瀛外界广泛扩散表示可能增强gliogenesis的PAX2 GABA能前体细胞增殖或白质。其含义是，任何实验过程的解释将不得不采取考虑上述proliferativê行为，事实上，浦肯野细胞不形成单层直至E18小鸡和正常发展可能切片制备后受到损害（ 例如，由于缺乏与攀爬纤维等相互作用的）

尽管有这些限制，我们的协议代表向前一个显著步骤相对于学习颗粒细胞生物学的许多方面。有利的空间和时间中的EGL的特异性标记从菱形唇部不同的关键优势将促进颗粒祖细胞的两个细胞生物学和基因调控支撑它的方式，是不可能在本体内的多个检查。我们在小鸡技术将补充在啮齿类^43-48现有的体外培养和电穿孔的协议和携带在成本和与小鸡相关联的便利的相当大的优势。此外，它代表一个显著提前超过的培养颗粒祖³⁹现有技术。而这将补充而不是取代后者，我们的协议将开放的颗粒神经元分化的控制，以各种各样的药物治疗和细胞中自主遗传操作是可能在小鸡的多样性。它提供了检查粒细胞生物学的空前细致的基础。

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Acknowledgments

在这篇文章中介绍的方法源于由BBSRC BB /资助的工作I021507 / 1（TB，RJTW）和MRC博士助学金（MH）。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300 μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4 μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation.