Summary
Lillhjärnan yttre granulskiktet är platsen för den största transit förstärkningen i den växande hjärnan. Här presenterar vi ett protokoll för att rikta genetisk modifiering till detta skikt på toppen av spridning med hjälp av ex vivo elektroporering och kultur cerebellär skivor från embryonala dag 14 kycklingembryon.
Abstract
Lillhjärnan yttre granulskiktet (EGL) är platsen för den största transit förstärkningen i den växande hjärnan, och en utmärkt modell för att studera neuronal proliferation och differentiering. Dessutom har evolutionära förändringar av sin proliferativa förmåga varit ansvarig för den dramatiska expansionen av cerebellär storlek i amnioternas, vilket gör lillhjärnan en utmärkt modell för evo-devo studier av ryggradsdjur hjärnan. De ingående cellerna i EGL, cerebellära granulatföregångare, också utgöra en betydande cell ursprungs för medulloblastom, den vanligaste pediatriska neuronal tumör. Efter att ha passerat förstärkning, granulat prekursorer migrerar radiellt i den inre granulära skiktet av lillhjärnan där de utgör den största neuronala befolkningen i den mogna däggdjurshjärnan. I chick inträffar toppen av EGL spridning i slutet av den andra graviditetsveckan. För att rikta genetisk modifiering till detta skikt påtoppen av spridning, har vi utvecklat en metod för genetisk manipulation genom ex vivo elektroporering av cerebellum skivor från embryonala dag 14 kycklingembryon. Denna metod rekapitulerar flera viktiga aspekter av in vivo granulat neuron utveckling och kommer att vara användbara för att generera en grundlig förståelse av cerebellär granulat celltillväxt och differentiering, och därmed lillhjärnan utveckling, evolution och sjukdom.
Introduction
Lillhjärnan sitter vid den främre änden av hindbrain och är ansvarig för integrationen av sensorisk och motorisk bearbetning i den mogna hjärnan samt reglering högre kognitiva processer 1. I däggdjur och fåglar, besitter det en utarbetad morfologi och är kraftigt folierade, en produkt från omfattande transit amplifiering av progenitorer under utvecklingen som producerar över hälften av nervceller i den vuxna hjärnan. Lillhjärnan har varit föremål för undersökning för neurobiologists i århundraden och den molekylära eran har också fått stor uppmärksamhet. Detta gäller inte bara dess inneboende intressanta biologi, men också till det faktum att det är starkt inblandad i mänskliga sjukdomar inklusive utvecklings genetiska störningar såsom autismspektrumstörningar 2 och mest framträdande lillhjärnan cancer, medulloblastom 3, vilket är den vanligaste barn hjärna tumör. Viktigt är det ett utmärkt modellsystem inom which att studera ödet tilldelning och neurogenes under hjärnans utveckling 4. Under de senaste åren har det också etablerats som ett modellsystem för jämförande studie av hjärnans utveckling, på grund av den enorma mångfald av cerebellära former ses över ryggradsdjur fylogeni 5-10.
Lillhjärnan utvecklas från den dorsala halv av rhombomere en i bakhjäman 11 och utvecklingsmässigt består av två primära gångarpopulationer, den rombiska läppen och den ventrikulära zonen. Den rombiska läpp sträcker sig runt rygg regionen av neuroepithelium av bakhjäman vid gränsen med takplåt. Det är födelseplatsen för de glutamaterg excitatoriska nervceller i lillhjärnan 12-14. Den ventrikulära zonen ger upphov till de hämmande GABAergic cerebellära neuroner, framförallt de stora Purkinje nervceller 14,15. Senare under utveckling (från ca embryonala dag 13,5 i mus, e6 i chick 16), glutamaterga Progennärer migrera tangentiellt från rombiska läppen och bildar en pial lager av stamceller: en sekundär stamfader zon kallas yttre granulskiktet (EGL). Det är detta skikt som genomgår omfattande transit förstärkning som leder till det stora antalet granulära neuroner som finns i den mogna hjärnan.
Spridning i EGL har länge kopplats samman med under pial plats som resultat av tangent migrering från rombiska läppen 17, med övergången till cellcykeln exit och neuronal differentiering av stamceller som i samband med deras utträde ur yttre EGL skiktet i mitten EGL 18. Omfattande tangentiell migration av post mitotiska granulceller i medial-lateral axel uppträder i mitten och inre EGL 19, före slutlig radiell migrering in i det inre granulatskiktet av det mogna cerebellär cortex. Migration av celler från rombiska läpp över lillhjärnan ytan är beroende av CXCL12 signalering från Pia 20-22 23-25. Intressant, elektronmikroskopiska undersökningar 17 har föreslagit att EGL celler med en proliferativ morfologi hålla pial kontakt förbinder cellens beteende med proliferativ kapacitet på ett sätt som påminner om de basala stamfäder för däggdjurs cortex 26. Detta återspeglas i den tidigare nämnda skiktning av EGL i tre underskikt som definieras av olika extracellulära miljöer och där granulat prekursorer har distinkta genuttryck signaturer 18.
Proliferation av progenitorceller i oEGL inträffar med en normal fördelning av klon storlekar så att när progenitorer är individuellt genetiskt märkt vid slutet av embryonal utveckling hos mus, ger de upphov till en median genomsnitt 250-500 postmitotisk granule neuroner 27,28. Spridning är beroende av mitogen SHH signalering från underliggande Purkinje neuroner 29-32. Förmågan att svara på SHH har visat sig vara helt beroende av cell självständig uttryck av transkriptionsfaktorn Atoh1, både in vitro 33 och in vivo 34,35. På samma sätt har cellcykel exit och differentiering visats vara beroende av expressionen av nedströms transkriptionsfaktorn NeuroD1 36, vilket sannolikt direkt repressor Atoh1 37.
Trots dessa framsteg, och betydande framsteg i att dechiffrera cellen biologiska grunden för cellcykel exit 38-42, den grundläggande molekylära mekanismen (s) som ligger till grund för beslutet lämna cellcykeln och att övergå från en föregångare till en differentierande neuron, och tillhörande postmitotisk tangentiell migration i den inre EGL liksom senare switchradiell migration, fortfarande ofullständigt känd. Detta är till stor del på grund av den experimentella intractability av EGL: det är sent utveckling, och svåra att rikta genetiskt eftersom många av samma neurogena molekylerna är också avgörande tidigare i livet av granulat prekursorer på rombiska läppen. För att övervinna detta problem, har talrika författare utvecklats in vivo och ex vivo elektroporering som en metod för att rikta den postnatala cerebellum hos gnagare 43-48. Här, vi pionjär användningen av ex vivo elektroporering i chick att studera EGL, som representerar betydande fördelar i fråga om kostnader och bekvämlighet. Vår metod för elektroporering och ex vivo bit kultur av chick cerebellär vävnad använder vävnad dissekerades från embryonala dag 14 kycklingar på toppen av EGL spridning. Denna metod tillåter genetisk riktat EGL oberoende av rombiska läppen och kommer att sätta scenen för genetisk dissektion av övergången från granulatstamfader till postmitotisk granulat neuron i lillhjärnan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Alla experiment utfördes med enlighet med Kings College London, Storbritannien och riktlinjerna för brittiska hemmakontoret djurskötsel.
1. Dissektion av e14 Cerebellum
- Inkubera brun befruktade hönsägg vid 38 ° C till embryonal dag 14.
- Använda ägg sax halshugga kycklingembryo in ovo och ta bort huvudet till en petriskål med iskall PBS (Figur 1A).
- Med användning av standard pincett, gör snitt bakom varje öga hela vägen genom vävnaden, ta bort ögonen och överkäken. Gör en andra snitt hela vägen genom svalget avlägsnande av underkäken (Figur 1B).
- Med användning av standard pincett, ta bort alla huden från ytan av skallen genom att dra bort den (Figur 1C) och ta bort frontal- och parietalben, avslöjar hjärnan.
- Ur en ventral aspekt bort svalg brosk och hjälp mesenkym.
- Ur en dorsal aspekt försiktigly bort mesenkym rygg till bakhjäman noga med att inte skada pia, separat hela hjärnan (Figur 1D).
- Gör snitt hela vägen genom vävnaden mellan mitthjärnan och bakhjäman och separat bakhjäman inklusive lillhjärnan (Figur 1E).
- Genom att göra snitt hela vägen genom vävnaden vid båda sido korsningar av lillhjärnan och alar platta bakhjäman, ta bort hela lillhjärnan, för att bevara integriteten i pia hela dissektion (figur 1F). Ta formnings koroidea plexus (figur 1G).
- Flytta dissekerade lillhjärnan i iskall HBSS.
2. Skiva kultur e14 Cerebellum
- Överför hela lillhjärnan till den sterila plattform för en Tissue Chopper med hjälp av en spatel eller en 3 ml pasteurpipett med spetsen bortskurna för att vidga öppningen. Ta bort överflödig vätska med hjälp av en pipett.
- Skär hela hela lillhjärnan i tHan önskad riktning vid 300 ìm tjocklek med hjälp av vävnads hackaren in med en skärhastighet på 50% av den maximala. Vävnadsintegritet lättast bevarade i sagittalsnitt; dock orientering också en viktig faktor för cellanalys (är Purkinje cell dendriter sagittally linje, medan granulat cell axoner köra på tvären, vinkelrätt mot planet för Purkinje cell dendriter).
- Med hjälp av en 3 ml Pasteur pipett täcker skivade lillhjärnan i iskall HBSS.
- Överför skivor i HBSS till en 60 mm petriskål med iskall färsk HBSS med en 3 ml pasteurpipett med skuren spets.
- Under ett dissektionsmikroskop belyses med en fiberoptisk ljuskälla, säkerställa separation av enskilda skivor använder urmakare pincett. Identifiera skivor som ska elektroporeras, baserat på deras vävnadsintegritet och medio-sidoläge.
Obs: Varje dissektion från embryo genom att skära inkubation i odlingsmedium tar ca 10-20 min beroende upon erfarenhet. Utför dissektioner en i taget för att säkerställa att cerebella spendera minsta tid mellan halshuggning och ex vivo kultur.
3. Elektroporation skivor
- Konstruera en elektroporering kammare genom att fastställa anoden i en elektroporator till basen av en 60 mm petriskål med isoleringstejp. Tillsätt ca 1 ml HBSS för att täcka elektroden.
- Placera en 0,4 | im odlingsinsatsen ovanpå elektroden täcks i HBSS. Tillåt odlingsinsatsen för att vila på elektroden gör att det alltid finns kontakt mellan insatsen och elektroden.
Obs: Med den här inställningen, kommer odlingsinsatsen med skivorna vilar på ytan av lösningen, upprätthålla kretsen men möjliggör rumslig inriktning på katoden. - Överför identifierade skivor (upp till fem per odlingsinsatsen) på odlingsinsatsen med hjälp av 3 ml pasteurpipett med den skurna spetsen. Separera och låt sedimentera på odlingsinsatsen i en sagittläggning.
- Med hjälp av en pipett, avlägsna överskott HBSS så att skivorna inte längre badade i lösning.
- Med användning av en P10 pipettspets pipett-DNA (i en koncentration av 1 ug / ul) utspäddes med 20% snabb grön över ytan på målregionen av ett segment. 20% snabbt grönt ger viskösa DNA-lösning och förhindrar oöverkomligt bred spridning av DNA. Tillsätt cirka 5 l DNA / snabb grön lösning på varje skiva (Figur 2B).
- Placera katoden över önskade målvävnaden och electroporate med 3 x 10 V, 10 ms varaktighet pulser. Undvik direkt kontakt av katoden med vävnaden. Istället utnyttjar ytspänningen hos vätskan för att upprätthålla konduktans (placera katoden så nära vävnaden som möjligt utan att röra vävnaden).
- Upprepa DNA leverans och elektroporering till flera regioner i EGL på varje enskild cerebellär skiva som önskas.
- Efter avslutad elektroporering, överföring kultur insert för att 30 mm petriskål.
- Till varje kultur, tillsätt 1 ml förvärmd odlingsmedium (Basal Medium Eagle, 0,5% (vikt / volym) D - (+) - glukos, 1% B27 supplement, 2 mM L-glutamin, 100 E / ml penicillin, 100 | j, g / ml streptomycin) under odlingsinsatsen, så att odlingsinsatsen är i kontakt med mediet, men skivorna inte badade i den.
- Inkubera kulturer vid 37 ° C / 6% CO2 under upp till 3 dagar. Ersätta alla odlingsmediet varje 24 h med färsk förvärmt medium.
- Efter kultur, fixa skivor på kulturen skär i 1 timme i 4% paraformaldehyd (eller O / N vid 4 ° C) i en ny 30 mm skålen med ingen kultur media.
4. Imaging av Cerebellar Slices
- Efter fixering, tvätta skivorna 3 gånger under 5 minuter i PBS.
- Med hjälp av ett rakblad, dissekera varje elektro och odlade cerebellär bit från odlingsinsatsen genom att skära runt segmentet och ta bort skivan och regionen insatsen det följs. DoFörsök inte ta bort skiva från odlingsinsatsen ytan.
- Montera skivor i cirka 1 ml monteringsmedium innehållande DAPI (om så önskas) inom ramen för ett täck noga med att inte införa bubblor och bild med hjälp av laserskanning konfokalmikroskopi.
Obs: Imaging parametrar kan varieras enligt konstruktionerna elektroporerade, och efter bedömning av den enskilde användaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det här avsnittet visar exempel på resultat som kan uppnås med hjälp av skiva elektroporering och kultur av lillhjärnan från embryonala dag 14 chick. Dissektionen av lillhjärnan illustreras i figur 1 och elektroporeringskammaren inrättat visas i figur 2. Vi visar att det är möjligt att elektroporera och framgångsrikt kultur cerebellära segment, som bibehåller deras struktur och cellulära morfologier in vitro (Figur 3A). Riktad elektroporering till enskilda folia är lätt uppnås (Figur 3B). Vi electroporate framgångsrikt ett antal olika plasmider i EGL-celler och visar att det är möjligt i) att märka celler med reporter konstruktioner att observera deras beteende (Figur 3C), ii) för att testa eventuella genom regioner för funktionalitet i cerebellära celler (Figur 3D ), och iii) att manipulera genetiskt denceller i EGL genom misexpressing proteiner av intresse (figur 3E). Dessutom farmakologiska manipulationer på electroporated segment är möjliga (resultat ej visade). Efter odling är det möjligt att utföra ytterligare vävnadsanalys, såsom immunohistokemi eller proliferationsanalyser (Figur 3F). Vi utför vävnadshälsoanalys av calbindin och PH3 immunfärgning och visar att vävnadsintegritet bibehålls under minst 3 div efter kultur (Figur 4). Dessa resultat visar att EGL är nu en lättillgänglig och lättmanipulerade struktur som helt kan undersökas och genetiskt förändrade i chick modellsystem.
Figur 1. Dissektion av lillhjärnan från E14 kycklingembryon. (A) halshugga brud i ägget och ta bort huvudet intoa petriskål med iskall PBS. Ta underkäken och ögonen genom att göra snitt bakom ögonen och svalget (streckad linje). (B) Ta bort skinnet från ytan av skallen. (C) Ta bort frontal- och parietalbenen och (D) ta bort hjärnan från mesenkymet och brosk som omger den. (E) under ett dissektionsmikroskop identifiera platsen för lillhjärnan vid den bakre änden av hjärnan. Klipp mellan mitthjärnan och bakhjäman (streckade linjer) lämnas med lillhjärnan och ventrala bakhjäman. (F) Gör snitt vid sido korsningar (skaft) i cerebellum att separera cerebellum från hindbrain (streckad linje). (G) Ta koroidea plexus (asterisk) från den ventrala sidan av lillhjärnan tills du är kvar med en hel intakt lillhjärnan med pia bifogas. Överför lillhjärnan i iskallt HBSS innan du förbereder skivor med en vävnad chopper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. elektroporering kammare inrättas. (A) En bild av skräddarsydda elektroporering kammare. Kammaren består av en anod av en elektroporator placeras säkert på basen av en 60 mm petriskål. Skålen innehåller cirka 1 ml HBSS för att täcka elektroden. Odlingsinsatsen bör vila på elektroden med konstant kontakt mellan insatsen och elektroden, bibehåller kretsen men möjliggör rumslig inriktning av katoden, som manipuleras för hand. (B) En bild av skivor som elektro. Skivor är täckta med DNA / snabb grön lösning. Skivorna elektro som lustd: elektroporering kan riktas till en folium eller flera platser. Efter elektroporering insatsen placeras i en 30 mm petriskål med förvärmt odlingsmedium och odlades i inkubatorn. 1. Anoden 2. katoden 3. Kultur insats 4. petriskål med 1 ml HBSS 5. dissektionsmikroskop 6. Enskilda skivor från vävnads chopper 7. DNA-lösning med snabb grönt färgämne. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3. Representativa resultat. (A) En låg förstoring bild av en styr elektroporering av en RFP kodande plasmiden i EGL på flera platser. Vävnaden behåller sin struktur och elektroporerade celler är klart synliga i ett tjockt subpial skikt av lillhjärnan. (B) Enexempel på en målinriktad elektroporering med en styr GFP plasmid. Den riktade folium indikeras med en asterisk. Skalstreck AB = 500 | im. (C) Ett exempel där en konstruktion som kodar GFP drivs av en Atoh1 förstärkare har elektroporerades in EGL. Uttrycket av Atoh1 definierar granulat cellprekursorer inom EGL. Olika cell morfologier är klart synliga på 3 div och cellbeteende kan övervakas. (D) Ett exempel på märkning efter elektroporering av en konstruktion innehållande en förmodad konserverad icke-kodande element (CNE) i NeuroD1 genen körning GFP. CNE redovisar aktiviteten i cellerna som förväntas baserat på endogen NeuroD1 uttryck tyder på en aktiv roll i denna CNE i utvecklingen. NeuroD1 uttryck korrelerar med initieringen av granulat celldifferentiering. (E) Ett exempel där vävnaden kan vara genetiskt manipuleras av misexpression av NeuroD1 protein och en förändring i granulatcell behaviour kan observeras. (F) Ett exempel där electroporated vävnaden (kontroll GFP plasmid) kan fixeras och färgas för markörer av prolifererande celler, såsom phosphohistone H3 (PH3). Skala bar CF = 50 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Vävnads integritet och spridning av kultur. (A - C) Calbindin färgning av E14 cerebellär vävnad elektro med en styr GFP plasmiden vid 1-3 dagar in vitro (div). Calbindin färgning visar att vävnadsintegritet bibehålls i odling under minst 3 div. Purkinje cellskiktet inte bildar ett monoskikt på detta stadium i kyckling utveckling men det är tydligt att bilda ett skikt på undersidan avEGL där granulceller (grön) är belägna. (D) Phosphohistone H3 (PH3) färgning på cerebellär vävnad odlades under 2 div. PH3 färgning är synlig i EGL (pilar), utan även i andra cerebellära regioner (pilspetsar). Denna färgning är representativt för alla stadier i kultur undersöktes (1-3 div). Skala bar AD = 50 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet redovisas här beskriver en metod för att dissekera, electroporating och odling skivor embryonala dag 14 lillhjärnan från ungen. Detta protokoll möjliggör målsökning av elektroporering till små bränn regioner i EGL, inklusive isolerade inriktning på enskilda cerebellära lober. Det möjliggör genetisk analys och bildbehandling med hög upplösning och bekvämlighet, och till en låg kostnad jämfört med etablerade tekniker i gnagare 43-47. En sådan analys är för närvarande inte möjligt in vivo på grund av den förlängda utvecklings tid, bristen på EGL-specifika genetiska inriktningsmöjligheter i mus, och likheterna av molekylära mekanismer mellan rombiska läppen och EGL, vilket innebär att förändringar som kan påverka EGL biologi ofta kan inte analyseras eftersom de påverkar rombiska läpp neurogenes och upphäva EGL bildning 49. Vårt system utgör således ett stort framsteg när det gäller att rikta genetisk modifiering till EGL specifically, och vi räknar med att det kommer att tillämpas på andra arter än ungen som kanske av jämförande intresse, såsom icke-modell däggdjur och reptiler.
Vid genomförande av skiva kultur elektroporering teknik, ett antal tekniska överväganden är av största vikt. För det första att den robusthet skivor överleva i odling utan å ena sidan genomgår en omfattande celldöd eller å andra sidan förlorar strukturell integritet begränsar tjockleken på skiva till 300 nm i våra händer. Ett andra viktigt övervägande är viskositeten hos DNA-lösningen, som säkerställer elektroporation av DNA vid koncentrationer som är tillräckligt höga för att inducera synliga eller relevanta nivåer av genetisk modifiering. I in ovo elektroporering av DNA-lösningar injiceras i tidig embryonal hindbrain, koncentrationer av snabb grönt färgämne av ungefär 1% är typiska. Men i våra protokoll, använder vi normalt koncentrationer av snabb gröna 20%. Detta säkerställer en tillräckligt viscous DNA-lösning för att förhindra spridning av DNA efter pipettering men före elektroporering, men tillräckligt späda en att förmedla en effektiv elektrisk ledning.
Förutom dessa tekniska överväganden, observerade vi att proliferativ beteende som vi observerar ex vivo inte exakt match som förutspåtts från in vivo-studier förmodligen på grund av pial integritet störs av vävnadspreparatet. Under sådana förhållanden, när en GFP uttryck konstruktion elektroporeras, en stor andel av elektroporerade celler verkar ha lämnat cellcykeln efter bara en dag av kulturen som bedöms av PH3 färgning (Figur 3F). Detta inte korrelerar med förväntad EGL proliferativ beteende, där spridningen av kloner i både mus och chick sträcker sig över en stor tidsperiod 27. Slutsatsen att pia modulerar proliferationen stöds av observationen att när vi electroporate en reporter byggt med en NeuroD1 reglerande element driver uttryck av GFP alla elektroporerade celler uttrycker GFP efter en dag i odling (figur 3D). In vivo speglar denna konstruktion endogen NeuroD1 expression i märkningen cellerna i den inre EGL som är post-mitotiska 36,37, medan full längd NeuroD1 är tillräcklig för att driva celldifferentiering (figur 3E). Detta tyder på att under vissa förutsättningar, den proliferativa förmågan hos celler kan inte upprätthållas eftersom det är i den yttre EGL vid ekvivalenta steg in vivo. PH3 färgning innebär dock tyder på att det finns en hel del spridning i kultur, ofta lokaliserad till EGL området (Figur 4D). Omfattande spridning utanför EGL indikerar eventuellt förhöjd gliogenesis eller spridning av Pax2 GABAerga prekursorer vit substans. Innebörden är att tolkningen av något experimentellt förfarande måste ta hänsyn till ovanstående proliferative beteende, kan det faktum att Purkinje celler inte bildar ett monolager tills E18 i chick och att normal utveckling äventyras efter beredning skiva (t ex på grund av bristande samverkan med klättring fibrer etc.)
Trots dessa begränsningar, utgör våra protokoll ett viktigt steg framåt i förhållande till att studera många aspekter av granulat cellbiologi. Den avgörande fördelen att möjliggöra rumsligt och tidsmässigt specifik märkning av EGL till skillnad från rombiska läppen kommer att underlätta flera undersökningar av både cellbiologi av granulat stamceller och den genetiska regleringen ligger till grund för det på ett sätt som inte är möjligt för närvarande in vivo. Vår teknik chick kommer att komplettera befintliga ex vivo kultur och elektroporation protokoll i gnagare 43-48 och bär avsevärda fördelar i kostnader och bekvämlighet som är förknippade med chick. Dessutom innebär det ett betydande framsteg överbefintliga tekniker för odling granulatföregångare 39. Även om det kommer att komplettera snarare än att ersätta den senare, kommer våra protokoll öppnar kontrollen av granulat neuron differentiering till ett brett utbud av läkemedelsbehandling och mångfalden av cell autonoma genetiska manipulationer som är möjliga i chick. Det ger en grund för att undersöka granulat cellbiologi i oöverträffad detaljrikedom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Den metod som presenteras i den här artikeln uppstod från arbetet finansieras av BBSRC BB / I021507 / 1 (TB, RJTW) och MRC doktorand (MH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| McIlwain tissue chopper | Mickle Laboratory Engineering Ltd | Cut at 300 μm for best results. | |
| Basal Medium Eagle (Gibco) | Life Technologies | 41010-026 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| penicillin/streptomycin | Sigma | P4333 | |
| 0.4 μm culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| TSS20 Ovodyne electroporator | Intracel | 01-916-02 | Use 3 x 10 V, 10 msec pulses for electroporation. |
References
- Schmahmann, J. D. The role of the cerebellum in cognition and emotion: personal reflections since 1982 on the dysmetria of thought hypothesis, and its historical evolution from theory to therapy. Neuropsychology Review. 20, 236-260 (2010).
- Becker, E. B., Stoodley, C. J. Autism spectrum disorder and the cerebellum. International Review of Neurobiology. 113, 1-34 (2013).
- Hatten, M. E., Roussel, M. F.
- Butts, T., Green, M. J., Wingate, R. J. Development of the cerebellum: simple steps to make a 'little brain. Development. 141, 4031-4041 (2014).
- Rodriguez-Moldes, I., et al. Development of the cerebellar body in sharks: spatiotemporal relations of Pax6 expression, cell proliferation and differentiation. Neuroscience Letters. 432, 105-110 (2008).
- Kaslin, J., et al. Stem cells in the adult zebrafish cerebellum: initiation and maintenance of a novel stem cell niche. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 29, 6142-6153 (2009).
- Chaplin, N., Tendeng, C., Wingate, R. J. Absence of an external germinal layer in zebrafish and shark reveals a distinct, anamniote ground plan of cerebellum development. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 3048-3057 (2010).
- Kani, S., et al. Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum. Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).
- Butts, T., Modrell, M. S., Baker, C. V., Wingate, R. J. The evolution of the vertebrate cerebellum: absence of a proliferative external granule layer in a non-teleost ray-finned fish. Evolution & Development. 16, 92-100 (2014).
- Corrales, J. D., Blaess, S., Mahoney, E. M., Joyner, A. L. The level of sonic hedgehog signaling regulates the complexity of cerebellar foliation. Development. 133, 1811-1821 (2006).
- Wingate, R. J., Hatten, M. E. The role of the rhombic lip in avian cerebellum development. Development. 126, 4395-4404 (1999).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum. Neuron. 48, 31-43 (2005).
- Yamada, M., et al. Specification of spatial identities of cerebellar neuron progenitors by ptf1a and atoh1 for proper production of GABAergic and glutamatergic neurons. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 4786-4800 (2014).
- Hoshino, M., et al. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 47, 201-213 (2005).
- Wilson, L. J., Wingate, R. J. Temporal identity transition in the avian cerebellar rhombic lip. Developmental Biology. 297, 508-521 (2006).
- Hausmann, B., Sievers, J. Cerebellar external granule cells are attached to the basal lamina from the onset of migration up to the end of their proliferative activity. The Journal of Comparative Neurology. 241, 50-62 (1985).
- Xenaki, D., et al. F3/contactin and TAG1 play antagonistic roles in the regulation of sonic hedgehog-induced cerebellar granule neuron progenitor proliferation. Development. 138, 519-529 (2011).
- Komuro, H., Yacubova, E., Yacubova, E., Rakic, P. Mode and tempo of tangential cell migration in the cerebellar external granular layer. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 21, 527-540 (2001).
- Klein, R. S., et al. SDF-1 alpha induces chemotaxis and enhances Sonic hedgehog-induced proliferation of cerebellar granule cells. Development. 128, 1971-1981 (2001).
- Zhu, Y., et al. Role of the chemokine SDF-1 as the meningeal attractant for embryonic cerebellar neurons. Nature Neuroscience. 5, 719-720 (2002).
- Hagihara, K., et al. Shp2 acts downstream of SDF-1alpha/CXCR4 in guiding granule cell migration during cerebellar development. Developmental Biology. 334, 276-284 (2009).
- Borrell, V., Marin, O. Meninges control tangential migration of hem-derived Cajal-Retzius cells via CXCL12/CXCR4 signaling. Nature Neuroscience. 9, 1284-1293 (2006).
- Paredes, M. F., Li, G., Berger, O., Baraban, S. C., Pleasure, S. J. Stromal-derived factor-1 (CXCL12) regulates laminar position of Cajal-Retzius cells in normal and dysplastic brains. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 26, 9404-9412 (2006).
- Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 1613-1624 (2008).
- Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
- Espinosa, J. S., Luo, L. Timing neurogenesis and differentiation: insights from quantitative clonal analyses of cerebellar granule cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 28, 2301-2312 (2008).
- Legue, E., Riedel, E., Joyner, A. L. Clonal analysis reveals granule cell behaviors and compartmentalization that determine the folded morphology of the cerebellum. Development. 142, 1661-1671 (2015).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba,, A, Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126, 3089-3100 (1999).
- Wallace, V. A. Purkinje-cell-derived Sonic hedgehog regulates granule neuron precursor cell proliferation in the developing mouse cerebellum. Current Biology : CB. 9, 445-448 (1999).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22, 103-114 (1999).
- Lewis, P. M., Gritli-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., McMahon, A. P. Sonic hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270, 393-410 (2004).
- Zhao, H., Ayrault, O., Zindy, F., Kim, J. H., Roussel, M. F. Post-transcriptional down-regulation of Atoh1/Math1 by bone morphogenic proteins suppresses medulloblastoma development. Genes & Development. 22, 722-727 (2008).
- Flora, A., Klisch, T. J., Schuster, G., Zoghbi, H. Y. Deletion of Atoh1 disrupts Sonic Hedgehog signaling in the developing cerebellum and prevents medulloblastoma. Science. 326, 1424-1427 (2009).
- Klisch, T. J., et al. In vivo Atoh1 targetome reveals how a proneural transcription factor regulates cerebellar development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3288-3293 (2011).
- Miyata, T., Maeda, T., Lee, J. E. NeuroD is required for differentiation of the granule cells in the cerebellum and hippocampus. Genes & Development. 13, 1647-1652 (1999).
- Butts, T., Hanzel, M., Wingate, R. J. Transit amplification in the amniote cerebellum evolved via a heterochronic shift in NeuroD1 expression. Development. 141, 2791-2795 (2014).
- Rios, I., Alvarez-Rodriguez, R., Marti, E., Pons, S. Bmp2 antagonizes sonic hedgehog-mediated proliferation of cerebellar granule neurones through Smad5 signalling. Development. 131, 3159-3168 (2004).
- Anne, S. L., et al. WNT3 inhibits cerebellar granule neuron progenitor proliferation and medulloblastoma formation via MAPK activation. PloS One. 8, e81769 (2013).
- Chedotal, A. Should I stay or should I go? Becoming a granule cell. Trends in Neurosciences. 33, 163-172 (2010).
- Penas, C., et al. Casein Kinase 1delta Is an APC/C(Cdh1) Substrate that Regulates Cerebellar Granule Cell Neurogenesis. Cell Reports. 11, 249-260 (2015).
- Penas, C., et al. GSK3 inhibitors stabilize Wee1 and reduce cerebellar granule cell progenitor proliferation. Cell Cycle. 14, 417-424 (2015).
- Yang, Z. J., et al. Novel strategy to study gene expression and function in developing cerebellar granule cells. Journal of Neuroscience Methods. 132, 149-160 (2004).
- Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival. Nature Neuroscience. 10, 559-567 (2007).
- Umeshima, H., Hirano, T., Kengaku, M. Microtubule-based nuclear movement occurs independently of centrosome positioning in migrating neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 16182-16187 (2007).
- Famulski, J. K., et al. Siah regulation of Pard3A controls neuronal cell adhesion during germinal zone exit. Science. 330, 1834-1838 (2010).
- Puram, S. V., et al. A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain. Nature Neuroscience. 14, 973-983 (2011).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. , (2014).
- Ben-Arie, N., et al. Math1 is essential for genesis of cerebellar granule neurons. Nature. 390, 169-172 (1997).
