Abstract
Escherichia coli-ekspressionssystemet er et kraftfuldt værktøj til fremstilling af rekombinante eukaryote proteiner. Vi bruger den til at producere Shadoo, et protein, der tilhører prion familien. En kromatografisk fremgangsmåde til oprensning af (His) 6-mærkede rekombinante Shadoo udtrykt som inklusionslegemer er beskrevet. Inklusionslegemerne solubiliseres i 8M urinstof og bundet til en Ni 2+ -charged kolonne for at udføre ion-affinitetskromatografi. Bundne proteiner elueres med en gradient af imidazol. Fraktioner indeholdende Shadoo protein underkastes gelpermeationskromatografi til opnåelse af et højt oprensede protein. I det sidste trin oprenses Shadoo afsaltes til fjernelse af salte, urinstof og imidazol. Rekombinant Shadoo protein er en vigtig reagens til biofysiske og biokemiske studier af proteinkonformation sygdomme, der opstår i prionsygdomme. Mange rapporter viste, at prion neurodegenerative sygdomme stammer fra aflejring af stable, beordrede amyloid fibriller. Sample protokoller, der beskriver, hvordan man fibrillere Shadoo til amyloide fibriller på sure og neutrale / basale pH-værdier præsenteres. Fremgangsmåderne om, hvordan man producere og fibrillere Shadoo kan lette forskning i laboratorier, der arbejder i prionsygdomme, da det giver mulighed for produktion af store mængder protein i en hurtig og billig måde.
Introduction
Prion neurodegenerative sygdomme, som omfatter BSE hos kvæg, scrapie hos får og Creutzfeldt-Jakobs sygdom hos mennesker, er dødelige og uhelbredelige. Prionsygdomme er kendetegnet ved konformationelle ændringer af cellulære prionprotein hovedsagelig sammensat af a-helixer, ind på tværs af β-sheet beriget amyloid konformer 1,2. Cross-p-strukturer indeholder tæt pakkede og yderst ordnede krystallinske-lignende p-sheets stabiliseret med hydrogenbindinger 3,4. Prion amyloider kan selv replikere på grund af p-strenge på den voksende kant, der giver en skabelon for at rekruttere og konvertering en monomer protein enhed.
Ifølge "eneste protein" hypotesen, det amyloid konformer af prion protein er det eneste smitstoffet. Imidlertid har nogle andre biomolekyler blevet foreslået at være afgørende for prionlidelser. For eksempel er cellemembraner menes at være et sted, hvor omstilling;på finder sted, og nogle negativt ladede lipider er blevet vist at forbedre konverteringsprocessen 5,6. Desuden kan nogle proteiner også være involveret i prion sygdomme. Konkret er der to andre medlemmer af prionproteinet familien: Doppel og Shadoo 7,8. Doppel har en relativt stiv struktur stabiliseret med di-sulfid broer og undlader at selvpolymerisere og aggregat til amyloide fibriller 9. I modsætning hertil svarer til prionproteinet, kan Shadoo vedtage en β-ark-struktur og beriget selvassociere i amyloidfibrildannelse strukturer. Det blev vist, at Shadoo kan fibrillerer under native betingelser eller efter binding negativt ladede membraner 10,11. Omdannelse af Shadoo i amyloid-lignende fibre kan være forbundet med patologier. Faktisk er de mekanismer, hvormed amyloid-lignende strukturer forårsage sygdom dårligt forstået.
Shadoo bærer et hydrofobt domæne (HD) og en række tandem Arg / Gly gentager tilsvarende to N-terminale del af prionprotein (figur 1A). Som den N-terminale del af prionprotein, er Shadoo stærkt positivt ladet og synes at være en indbygget ustruktureret protein 11,12. Shadoo synes at være funktionelt relateret til prionlidelser eftersom den direkte kan binde prionprotein. Desuden er dets ekspression nedreguleres under prion patologi 13,14. Imidlertid er endnu ikke etableret rolle Shadoo i prionsygdom.
Vi udviklede et plasmid, der bærer den kodende sekvens af muse Shadoo genet. Plasmidet blev anvendt til at transformere E. coli til fremstilling af N-terminale His-6 fusion Shadoo protein. Dette ekspressionssystem er veletableret i vores laboratorium og er almindeligt anvendt i vores igangværende projekter 6,15,16. Et vigtigt spørgsmål for ekspression af Shadoo er valget af E. coli-stamme. Mens kompetente BL21 bakteriestamme er almindeligt anvendt til ekspression af rekombinant proproteiner Shadoo blev med succes udtrykt og oprenset kun fra den transformerede SoluBL21 bakteriestamme. SoluBL21 kompetent E. coli er en forbedret mutant af BL21 værtsstamme udviklet til produktion af proteiner, hvis ekspression i moder- BL21 gav intet påviseligt opløselige produkt. Højniveauekspression af Shadoo i SoluBL21 E. coli fører til akkumulering af proteinet i inklusionslegemer. Som et generelt træk, når en ikke-nativt protein er overudtrykt i E. coli, dette protein har tendens til at ophobe sig i uopløselige inklusionslegemer. Shadoo aggregater sandsynligvis gennem ikke-kovalente hydrofobe eller ioniske interaktioner (eller en kombination af begge) til højt beriget dynamiske strukturer dannet af proteinet foldes til forskellige grader. Som følge heraf oprensningen omfatter mindst to trin: (i) en selektiv separation af proteinet fra andre biomolekyler i et denatureringstrin medium og (ii) en renaturering af det oprensede protein under anvendelse af in vitro foldningteknikker.
Den selektive adskillelse af Shadoo blev opnået i en pufferopløsning indeholdende 8M urinstof (eller alternativt 6M guanidin-HCI). Urinstoffet fjernelse og renaturering af proteinet kan ske ved at anvende forskellige protokoller: (i) renaturering i et surt pH opløsning for at opnå en ustruktureret monomere Shadoo protein eller (ii) renaturering i en opløsning med pH ≥ 7 til opnåelse Shadoo polymeriseret til stabile amyloide fibre med karakteristiske cross-β-sheet motiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af plasmid og Shadoo Expression
Bemærk: Genet, der koder murint Shadoo protein (Shadoo 25-122), blev subklonet ind i ekspressionsvektoren pET-28 11. Denne klon blev transformeret ind i E. coli SoluBL21 bakteriestamme, at udtrykke Shadoo protein med en N-terminal hexahistidinmærke, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) som forklaret tidligere 11. Plasmidet kan rekvireres fra forfatterne. Molekylvægten af Shadoo beregnet ud fra dets aminosyresekvens er 12,243.2 Da.
Bemærk: Udfør alle manipulationer med bakterier under en laminal flow hætte eller tæt Bunsen flamme.
- Transformere kompetente SoluBL21 bakterier med pet-28-His 6 -Shadoo plasmid ved hjælp af en standard varme chok-protokol. For denne blanding 1 til 5 pi plasmidet (typisk 10 pg til 100ng) i 50 pi af bakterierne i et rør. Udfør varmechok ved 42 ° C i 45 sek.
- Kultur transformerede bakterier ved 37 ° C, indtil A600 af 0,5-0,7 i Luria-Bertani-medium suppleret med 40 mg / ml kanamycin (figur 1B).
- Inducere ekspression Shadoo O / N ved tilsætning af 240 ug / ml isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid, ITPG, til kulturen. Kultur bakterier under omrystning ved 150 rpm ved 37 ° C. Bemærk: Typisk bakteriekultur når en 600 3 O / N.
Note: transformerede bakterier kan opbevares ved -80 ° C til fremtidig proteinproduktion. Til dette tilsættes 10% -50% (v / v) steril glycerol i bakteriekultur portioner og fryse ved -80 ° C.
Figur 1. Skema for Shadoo ekspressionskonstruktion, bakterier transformation og induktion af Shadoo ekspression (som beskrevet i trin 1). (A) Ekspressionskonstruktionen for Shadoo koder for et hexahistidinmærke fusioneret til N-terminalen af proteinet, Nt. Ordningen viser, at Shadoo protein indeholder grundlæggende arginin / glycin-gentagelser (grøn cylinder), et hydrofobt domæne (HD), og en enkelt N-glycosyleringssted (CHO), efterfulgt af en C-terminal (CT). (B) pET-28-His 6 -Shadoo plasmid transformeres i SoluBL21 bakterier ved varmechok i 45 sekunder ved 42 ° C. Transformerede bakterier udplades på selektive agar indeholdende 40 ug / ml kanamycin. En enkelt koloni fra pladen anvendes til at inokulere en kultur i et 1,000-3,000 ml rystekolbe. Ekspression af det rekombinante protein induceres med 1 mM IPTG. Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Rensning af Shadoo protein af Low Pressure Liquid Chromatography (LPLC)
- Cellelyse og Ikonklusion organer forberedelse
- Opsaml bakteriesuspension og overføre den til centrifugeringsrør (figur 2).
- Centrifugering ved 2.500 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved dekantering og resuspender pellets i 15 ml puffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 med anti-protease cocktail) for hver pellet afledt af 500 ml cellekultur.
Bemærk: Resuspenderede pellets kan fryses og opbevares ved -20 ° C i flere dage. Frysning letter bakterieceller lysis. - Kontroller overekspression af rekombinant protein under anvendelse af rå bakterier pellets ved SDS-PAGE analyse og Coomassie-farvning.
- Til dette, centrifugation 1 ml bakteriekultur pelletere cellerne. Tilsæt 100 pi Laemmli denatureringsopløsning (277,8 mM Tris-HCI, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% w / v glycerol, 0,02% bromphenolblåt) til pelletering og varme ved 100 ° C i 5 minutter.
- Load 10 pi af prøven til et 12% acrylamidgel, køre SDS-PAGE og visuAlize adskilte proteiner ved Coomassie-farvning.
- Tilføj Triton X-100 til 0,5% slutkoncentration til en helt resuspenderede pellet fra 2.1.2).
- Inkubér suspension i vandbad ved 37 ° C i 30 minutter.
- Sonikeres suspensionen i 5 minutter ved 6-12 mikron peak-to-peak amplitude i iskoldt vand for at lysere bakterieceller.
- Overførsel sonikeret suspension i rene 50 ml centrifugeringsrør.
- Centrifugerør ved 15.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten ved dekantering, og der tilsættes 5 ml af bindingsbuffer (20 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 5 mM imidazol) pr rør.
- Rørene anbringes på det roterende hjul O / N for helt at opblande proteiner fra inklusionslegemer.
Figur 2. Skema for rensning af inklusionorganer (som beskrevet i trin 2.1). Transformerede bakterier, der udtrykker Shadoo høstes ved centrifugering og resuspenderet i lysisbuffer. Suspensionen inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter, og derefter sonikeret for mekanisk bryde bakterieceller. Lydbehandling udføres på is for at forhindre prøven opvarmning. Brudte celler høstes ved centrifugering og resuspenderet i en buffer indeholdende 8 M urinstof for at solubilisere proteiner fra inklusionslegemer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. - Ni 2+ -affinity kromatografi
Bemærk: Kromatografi udføres på FPLC under anvendelse af en Ni2 + -charged, 5 ml Sepharose-chelaterende søjle (figur 3A). Alle opløsninger er sat på søjlen med en strømningshastighed på 1 ml / min.- Injicer 10 ml 0,2 M NISO 4 vandopløsning i sepharosekolonne for at oplade detmed Ni 2+ -ioner.
- Ækvilibrering af søjlen fyldt med Ni2 + -ioner ved at injicere 30-50 ml af bindingsbuffer indeholdende en lav koncentration af imidazol (20 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 5 mM imidazol).
- Indlæse ureasolubiliseret proteiner med en 50 ml injektionssløjfe.
- Opsaml fraktion gennemstrømning ved grundig vask af søjlen med 10 ml lav imidazol bindingsbuffer (20 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 5 mM imidazol) med henblik på at fjerne højst ubundne proteiner fra søjlen.
- Vask søjlen med 50-100 ml af vaskebuffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urinstof, 80 mM imidazol) til eluering proteiner ikke-specifikt bundet til søjlen.
- Anvend en 15 min lineær gradient af 80-800 mM imidazol i puffer indeholdende 20 mM Tris-HCI, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urinstof. Saml 1 ml fraktioner i gradienten ansøgning. Bemærk: His-mærkede proteiner elueres witha gradient af imidazol-holdige puffer (anvendt som konkurrent).
- Læs 8 pi alikvot af hver fraktion, og der tilsættes 4 pi 4x Laemmli denatureringsopløsning (se 2.1.3.1). Heat opløsninger ved 100 ° C i 5 minutter.
- Load 10 pi protein størrelsesmarkør og 10 pi af hver prøve til 12% acrylamid gel, køre SDS-PAGE og visualisere adskilte proteiner ved Coomassie-farvning. Bemærk: Molekylvægten af Shadoo beregnet danne sig sin aminosyrer sekvens er 12,243.2 Da.
- Pool alle fraktioner indeholdende Shadoo.
Figur 3. Oprensning procedure (som beskrevet i trin 2,2-2,4). (A) Ni 2 + -ioner kan koordineres af histidinrester, som tillader den selektive rensning af polyhistidin-mærkede proteiner. Imidazol anvendes til eluering af proteinet, gennemdens evne til at koordinere med Ni2 + -ion og forskyde det bundne protein. (B) Proteiner af varierende hydrodynamiske radius, der blev tilbageholdt på Ni 2+-søjle er adskilt på en gelpermeationssøjle. Proteiner elueres fra det største til de mindste. (C) Før brug fraktioner indeholdende Shadoo pooles og afsaltet for at fjerne urinstof, imidazol og salte. Kvalitetskontrol assays indbefatter SDS-PAGE / Coomassie-farvning, Western blotting. Renset Shadoo kan frysetørres. Frysetørret Shadoo er stabil i måneder ved opbevaring ved -20 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal. - Gelpermeationskromatografi
Bemærk: Et andet oprensningstrin består i gelpermeationskromatografi som adskiller Shadoo protein fra andre proteiner co-eluerede i det første rensningstrin(Figur 3B).- Ækvilibrere Superdex søjle af 120 ml totalt volumen seng ved at injicere 250 ml 20 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea ved en strømningshastighed på 1,5 ml / min.
- Indlæs samlede fraktioner indeholdende Shadoo fra 2.2.9 på den ækvilibrerede søjle. Saml 1 ml fraktioner efter volumen kolonne-tomrum af 40 ml af den konstante strøm af ovennævnte puffer.
- Tage en 10 pi alikvot af hver fraktion og udføre en SDS-PAGE-analyse og Coomassie-farvning som beskrevet ovenfor for at finde ud af, hvilke fraktioner indeholder Shadoo.
- Pool fraktioner indeholdende Shadoo.
- Afsaltning
Bemærk: Afsaltning fremgangsmåde fjerner salte, imidazol og urea for at opnå rekombinant Shadoo protein i en buffer der er egnet til yderligere biofysiske og biokemiske undersøgelser (figur 3C). Det samme resultat kan opnås ved dialyse prøver mod bufferen.- Ækvilibrere en afsaltning søjle af 53 ml med 150 ml10 mM ammoniumacetat, pH 5, ved strømningshastighed på 5 ml / min.
- Load puljet Shadoo fraktioner på søjlen. Efter injektion af ammoniumacetatpuffer- indsamle manuelt fraktioner, der viser en stigning af signalet ved 280 nm ved udgangen af UV-detektor.
- Frysetørre afsaltet Shadoo og opbevar det ved -20 ° C.
- Opløs frysetørret Shadoo i en passende buffer, såsom 10 mM natriumacetatpuffer, pH 5, før brug.
Bemærk: polyhistidinmærke kan fjernes med enterokinase.
3. In vitro samling af Shadoo ind amyloidfibriller ved fysiologisk pH
Bemærk: De Shadoo proteinaggregater og spontant danner fibriller ved pH ≥ 7 11.
Figur 4. Skema for Shadoo refoldning til amyloide fibriller (som descriseng i trin 3). Oprenset Shadoo spontant konverterer til amyloidfibriller ved opløsning i puffer med pH ≥ 7. I en sur opløsning, Shadoo konverterer til amyloidfibriller ved inkubering med 1 M Gdn-HCl under omrystning. Kvalitetskontrol analyser omfatter elektronisk mikroskopi og ThT farvning. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Fortynd Shadoo til en slutkoncentration på 2 uM i en 20 mM Tris-HCI-buffer, pH 7,4. Måle koncentrationen ved at måle den optiske densitet af opløsningen ved 280 nm og under anvendelse af ekstinktionskoefficienten udledes Shadoo aminosyresammensætning 20.970.
- Inkuber 500 pi af opløsning i et konisk plastrør ved 4 ° C i et par uger, for at tillade spontan protein omdannelse til amyloide strukturer (figur 4).
- Tilføj frisklavet thioflavin T (ThT) til en endelig koncentration på 10 um til en 100 pi portion af Shadoo opløsning. Inkubér opløsningen i 5 minutter ved stuetemperatur. Mål fluorescensemission 460-520 nm under anvendelse af en excitationsbølgelængde på 435 nm for at kontrollere tilstedeværelsen af amyloide strukturer 17.
4. In vitro samling af Shadoo til amyloidfibriller ved sure pH-værdier
- Fortynd Shadoo i 1 M GdnHCl, 20 mM Na-acetatpuffer, pH 5 til en slutkoncentration på 2 uM.
- Inkuber 500 pi af denne opløsning i en konisk rør med kontinuerlig omrystning ved 37 ° C, i 3-7 dage.
- Kontrol af tilstedeværelse af amyloidfibriller ved tilsætning ThT til en portion af opløsningen under 3.3.
- Dialyseres opnåede suspension mod 10 mM Na-acetatpuffer, pH 5,0, til rensning af Shadoo amyloidfibriller.
- Opbevar oprensede fibriller ved 4 ° C.
Figur 5. Repræsentative resultater. Proteinfraktioner elueret fra Ni2 + -charged chelaterende søjle (A) og gelpermeationssøjle (B) blev analyseret under anvendelse af SDS-PAGE og Coomassie-farvning. Identifikation af renset Shadoo blev vurderet ved hjælp SPRN anti-Shadoo antistof (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ca. 5-10 mg oprenset protein Shadoo opnås per liter bakteriekultur. Er behov for en to-trins rensning for at opnå rekombinant Shadoo af høj renhed. Det første trin udføres ved affinitetskromatografi med en Ni2 + -charged kolonne, der bevarer sin-mærkede proteiner. Eluerede fraktioner underkastes SDS-PAGE og farvet med Coomassie Brilliant Blue (figur 5A). Fraktioner indeholdende Shadoo protein samles og renses yderligere ved gelpermeationskromatografi som adskiller proteinerne ifølge deres størrelse (Shadoo molekylvægt er ca. 12 kDa). Opsamlede fraktioner ved eluering visualiseres ved SDS-PAGE / Coomassie-analyse (figur 5B). Desuden er Shadoo fremgår af Western-blot under anvendelse af et specifikt anti-Shadoo antistof, SPRN der binder til et følsomt epitop mellem 76-105 aminosyrer fra protein C-terminale region (figur 5C).
Shadoo refoldning til enmyloid fibriller verificeres ved ThT farvning (figur 6A) og ved negativ farvning elektronmikroskopi (figur 6B). ThT er et fluorescerende farvestof, som binder tværs af β-sheet kvaternære strukturer karakteristiske for amyloid samlinger. Stigning i ThT intensitet i figur 6A viser, at Shadoo omdannes til amyloidal strukturer.
Figur 6. Repræsentative resultater. (A) Shadoo fibriller af 2 uM monomer ækvivalent koncentration blev præinkuberet med ThT (10 uM slutkoncentration) i 5 minutter ved stuetemperatur. Fluorescensemission intensiteter registreres for hver prøve under anvendelse af en excitationsbølgelængde på 435 nm. Bemærk en betydelig stigning i ThT fluorescensintensitet i en opløsning indeholdende Shadoo polymeriseres til amyloidfibriller sammenlignet med kontrolgruppen solution af monomert Shadoo. (B) Transmissionselektronmikroskopi af fibrilleret Shadoo. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En nem og effektiv protokol til både ekspression og oprensning af en stor mængde af rekombinant muse Shadoo protein præsenteres. Den beskrevne fremgangsmåde tillader vellykket solubilisering og oprensning af (His 6) -mærket rekombinant Shadoo protein. Det er vigtigt, som påpeget i titlen, at når det udtrykkes i en prokaryot bakterie E. coli Shadoo akkumuleres i inklusionslegemer. Før Shadoo oprensning bakterierne skal lyseres ved lydbehandling i en puffer indeholdende Triton X-100. Efterfølgende inklusionslegemer kan solubiliseres i 8M urinstof-denaturerende opløsning. Endvidere hele oprensningsprocedure skal udføres i 8M urinstof bufferopløsning siden Shadoo tendens til at polymerisere og aggregat. Efter solubilisering og præcisering af inklusionslegemer, supernatanten indeholdende denaturerede proteiner underkastes to-trins oprensningsprocedure: affinitetskromatografi og gelpermeationskromatografi. Affiniteten Chromatography trin består i binding Shadoo via (His 6) -tag til en Ni2 + -charged chelaterende søjle. I 8 M urinstofopløsning proteiner denatureres og deres histidinrester er overfladeeksponeret. Desuden urinstof fremmer Shadoo strukturelle integritet ved at forhindre proteolyse i tilfælde af kontaminerende proteaser. I det andet oprensningstrin, Shadoo elueret fra med gradient af imidazol underkastes gelpermeationskromatografi for at adskille kontaminerende proteiner. I det andet trin, er store proteiner elueres først, da de er i stand til at komme ind i porerne i matrixen og således have en direkte vej gennem søjlen. Mindre proteiner, som Shadoo, tager længere tid at eluere fra søjlen, idet de kan komme ind i porerne og har en mere indviklet vej. Endelig er fremstillingen protein afsaltet for at fjerne urinstof, imidazol og salte. Kvalitetskontrol indikerer at følge denne procedure rekombinant Shadoo er oprenset til høj renhed. Det kan anvendes i various biologiske og bioteknologiske undersøgelser.
E. coli ekspressionssystem er et ekstremt nyttigt værktøj til ekspression af rekombinante proteiner. De lave omkostninger, nem manipulation, hurtighed og bekvemmelighed udtrykke pattedyrproteiner i E. coli gør af denne vært det første valg værktøj til life science-applikationer. Men ikke alle pattedyrproteiner kan udtrykkes i opløselig form og / eller i en tilstrækkelig mængde i denne bakterie. Nogle gange kan forhindringer overvindes ved forskellige strategier som at sænke udtryk temperatur, skiftende initiativtagere, tilføjer oprensningsmærker, ved hjælp af alternative medier 18-20. Men i nogle tilfælde, at finde en optimal ekspression tilstand kan have en høj omkostning i tid og indsats. Vanskeligheder at producere rekombinant Shadoo blev overvundet med SoluBL21 kompetent E. coli-stamme. Denne mutant værtsstamme væsentligt forbedret udbyttet af Shadoo produktion og tilladt os at opnå fuldt opløseligeShadoo. Opnåede udbytter var i intervallet 5-10 mg / l kultur.
Rekombinant Shadoo blev vist at være en indbygget ustruktureret protein og give en tilfældig coil funktion ved cirkulær dikroisme-spektroskopi 11,12. At være en meget positivt ladet protein (pi ~ 10.44) Shadoo tendens til at aggregere ved fysiologisk pH. Men Shadoo er fuldt opløseligt i pufferopløsninger af sure pH'er. Vi præsenteres her enkle og effektive protokoller til at polymerisere Shadoo til amyloide fibriller ved forskellige pH-værdier. Polymeriseret Shadoo repræsenterer et værdifuldt redskab til at studere patologiske protein foldninger, der kendetegner nogle neurodegenerative sygdomme. Det rekombinante Shadoo oprenset ved hjælp af vores fremgangsmåde kan anvendes til yderligere biokemiske og strukturelle karakterisering af den konformationelle omstillingsprocessen.
Baseret på dens primære struktur blev forudsagt Shadoo at have en N-bundet glycosyleringssted og signalpeptider til fastgørelse af glycosylphosphatidylinositol (GPI) anker ved siden af dets C-terminale ende (figur 1A). Rekombinant Shadoo oprenset fra inklusionslegemer er berøvet kulhydrater siden E.coli ekspressionssystem ikke er i stand til at udføre post-translationelle modifikationer. Som følge heraf kan interaktioner af rekombinant Shadoo med proteiner, lipider eller nukleinsyrer modificeres i forhold til det native protein. For eksempel blev betydningen af Shadoo glykosylering nylig foreslået for Shadoo proteasom nedbrydning efter protein modifikation af ubiquitinering 21. Rolle GPI anker i prion sygdom er ikke kendt, men mange undersøgelser tyder på, at GPI ankeret kan spille en rolle i patogenesen af prionsygdomme 22,23. Således bakteriel udtrykt, Shadoo kan bruges til in vitro-undersøgelser, der tager hensyn til disse begrænsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
References
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435, 773-778 (2005).
- Murphy, R. M. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).
- Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).
- Watts, J. C., Westaway, D. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).
- Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel. Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).
- Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations. Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).
- Daude, N., et al. Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions. Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).
- Li, Q., et al. Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).
- Watts, J. C., et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections. The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).
- Watts, J. C., et al. Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein. PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).
- Westaway, D., et al. Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation. PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).
- Chevalier, C., et al. PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments. The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).
- Tarus, B., et al. Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus. Biochimie. 94, 776-785 (2012).
- Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).
- Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors. Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).
- Schein, C. H. A cool way to make proteins. Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).
- Zhang, J., et al. Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells. Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).
- Englund, P. T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).
- Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis. Prion. 8, 11-18 (2014).
