Abstract
Escherichia coli-ekspresjonssystem er et kraftig verktøy for fremstilling av rekombinante eukaryote proteiner. Vi bruker den til å produsere Shadoo, et protein som tilhører prion familien. En kromatografisk fremgangsmåte for rensing av (His) 6 -tagged rekombinant Shadoo uttrykt som inklusjonslegemer, er beskrevet. Inklusjonslegemene blir løst i 8 M urea, og bundet til en Ni2 + -charged kolonne for å utføre ion-affinitetskromatografi. Bundne proteiner elueres med en gradient av imidazol. Fraksjoner inneholdende Shadoo protein utsettes for størrelse-utelukkelses-kromatografi for å oppnå et høyt renset protein. I det siste trinnet ble renset Shadoo avsaltet for å fjerne salter, urea og imidazol. Rekombinant Shadoo protein er et viktig reagens for biofysiske og biokjemiske studier av protein conformation lidelser som oppstår i prionsykdommer. Mange rapporter har vist at prion neurodegenerative sykdommer stammer fra avsetningen av stavle, bestilte amyloidfibriler. Eksempel protokoller som beskriver hvordan du fibrillere Shadoo inn amyloidfibriler på syrlig og nøytral / grunnleggende pH presenteres. Metodene for hvordan å produsere og fibrillere Shadoo kan legge til rette for forskning i laboratorier som arbeider på prionsykdommer, siden det gir mulighet for produksjon av store mengder av protein i en rask og rimelig måte.
Introduction
Prion nevrodegenerative sykdommer, som inkluderer kugalskap hos storfe, skrapesyke hos sau og Creutzfeldt-Jakobs sykdom hos mennesker, er dødelig og uhelbredelig. Prionsykdommer er kjennetegnet ved konformasjonsendringer av cellular prionprotein i hovedsak sammensatt av a-helikser, inn i den tverr β ark anriket amyloid konformer 1,2. Cross-P-strukturer inneholder tettpakket og svært bestilt krystallinske lignende p-ark stabilisert med hydrogenbindinger 3,4. Prion amyloids kan kopiere seg selv på grunn av p-trådene på den voksende kant som gir en mal for å rekruttere og konvertere en monomerisk protein enhet.
I henhold til den "eneste protein" hypotese, er amyloid konformer av prionprotein sålen smittestoffet. Imidlertid har enkelte andre biomolekyler er foreslått å være avgjørende for prion lidelser. For eksempel er cellemembraner antatt å være et sted hvor Conversividere finner sted, og noen negativt ladede lipidene har vist seg å forbedre konverteringen 5,6. I tillegg kan enkelte proteiner også være involvert i prion patologier. Spesielt er det to andre medlemmer av prionproteinet familien: Doppel og Shadoo 7,8. Doppel har en relativt stiv struktur stabilisert med di-sulfid broer og ikke klarer å selvpolymerisere og aggregat til amyloidfibriler 9. I kontrast, i likhet med prion protein, kan Shadoo innta en β-ark-anriket struktur og selv-assosiere til amyloid fibril strukturer. Det ble vist at Shadoo kan fibrillere henhold innfødte forhold eller ved binding negativt ladede membraner 10,11. Omdannelse av Shadoo til amyloid-lignende fibere kan være assosiert med sykdomstilstander. Faktisk er de mekanismer som amyloid-lignende strukturer forårsaker sykdommen dårlig forstått.
Shadoo bærer et hydrofobt domene (HD) og en rekke tandem-Arg / Gly gjentar lignende to N-terminale delen av prionprotein (figur 1A). Som de N-terminale delen av prionprotein, er Shadoo sterkt positivt ladet, og synes å være et nativt protein ustrukturert 11,12. Shadoo synes å være funksjonelt relatert til prion lidelser siden det kan direkte binde prionproteinet. I tillegg er dets ekspresjon nedregulert i løpet av prion patologi 13,14. Imidlertid er ikke etablert, men rolle Shadoo i prionsykdom.
Vi har utviklet et plasmid som bærer den kodende sekvens av muse Shadoo genet. Plasmidet ble brukt til å transformere E. coli for fremstilling av N-terminal His 6-fusjonsprotein Shadoo. Dette uttrykket systemet er godt etablert i vårt laboratorium, og er ofte brukt i våre pågående prosjekter 6,15,16. En viktig sak for ekspresjon av Shadoo er valget av E. coli-stamme. Mens kompetente BL21 bakteriestamme er ofte brukt for ekspresjon av rekombinant proproteiner Shadoo ble vellykket uttrykt og renset fra bare den transform SoluBL21 bakteriestamme. SoluBL21 kompetente E. coli er en forbedret mutant av BL21 vertsstammen er utviklet for produksjon av proteiner hvis ekspresjon i moder BL21 ga ingen påviselig løselig produkt. Høyt nivå uttrykk for Shadoo i SoluBL21 E. coli fører til opphopning av proteinet i inklusjonslegemer. Som en generell funksjon, når en ikke-native protein er sterkt uttrykt i E. coli, dette har en tendens til å akkumuleres i proteinet uoppløselige inklusjonslegemer. Shadoo aggregater sannsynligvis gjennom ikke-kovalente hydrofobe eller ioniske interaksjoner (eller en kombinasjon av begge) til høyanriket dynamiske strukturer dannet av proteinet foldes i varierende grad. Følgelig omfatter rensing i det minste to trinn: (i) en selektiv separasjon av protein fra andre biomolekyler i et medium denaturering, og (ii) en renaturering av det rensede protein ved hjelp av in vitro foldingteknikker.
Den selektive separasjon av Shadoo ble oppnådd i en bufferløsning inneholdende 8M urea (eller alternativt 6M guanidin-HCl). Urea fjerning og renaturering av proteinet kan gjøres ved å anvende ulike protokoller: (i) renaturering i et surt pH-løsning for å oppnå en ustrukturert monomert Shadoo protein, eller (ii) renaturering i en oppløsning med pH ≥ 7 for å oppnå Shadoo polymerisert til stabile amyloid fibrene med karakteristiske tverr β-sheet motiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon av Plasmid og Shadoo Expression
Merk: Genet som koder for murine Shadoo protein (Shadoo 25-122), ble subklonet i Ekspresjonsvektor Dyre 28 11. Denne klonen ble forvandlet til E. coli SoluBL21 bakteriestamme, for å uttrykke Shadoo protein med en N-terminal hexahistidine tag, (HHHHHHHHHHSSGHIDDDDKHMKGGRGGARGSARGVRGGARGASRVRVRP APRYGSSLRVAAAGAAAGAAAGVAAGLATGSGWRRTSGPGELGLEDDENGAMGGNGTDRGVYSYWAWTSG) som forklart tidligere 11. Plasmidet kan bestilles fra forfatterne. Molekylvekten til Shadoo beregnet fra dens aminosyresekvens er 12,243.2 Da.
Merk: Utfør alle manipulasjoner med bakterier under en laminær strømningshette eller nær bunsenbrenner.
- Transform kompetente SoluBL21 bakterier med kjæledyr 28-His 6 -Shadoo plasmid, ved hjelp av en standard heat shock protokoll. Til denne blandingen 1 til 5 pl av plasmid (typisk 10 til 100 pgng) i 50 pl av bakteriene i et rør. Utføre varmesjokk ved 42 ° C i 45 sek.
- Kultur transformert bakterier ved 37 ° C til 600 A fra 0,5 til 0,7 i Luria-Bertani-medium tilsatt 40 mg / ml kanamycin (figur 1B).
- Shadoo indusere ekspresjon O / N ved tilsetning av 240 ug / ml isopropyl-β-D-tiogalaktopyranosid, ITPG, til kulturen. Kultur bakterier med rysting ved 150 rpm ved 37 ° C. Merk: Vanligvis når A 600 av 3 O / N bakteriekultur.
Note: transformerte bakterier kan oppbevares ved -80 ° C for fremtidig proteinproduksjon. Til dette tilsettes 10% -50% (v / v) steril glyserol til bakteriekultur aliquoter og fryse dem ved -80 ° C.
Figur 1. Skjema for Shadoo ekspresjonskonstruksjon, bakterier transformasjon og induksjon av ekspresjon Shadoo (som beskrevet i trinn 1). (A) ekspresjonskonstruksjon for Shadoo koder for et hexahistidine tag fusjonert til N-terminus av proteinet, Nt. Ordningen viser at Shadoo protein inneholder basiske arginin / glycin-repetisjoner (grønn) sylinder, et hydrofobt domene (HD) og en enkelt N-glykosyleringssete (CHO), etterfulgt av en C-terminal (Ct). (B) Dyre 28-His 6 -Shadoo plasmid er forvandlet til SoluBL21 bakterier ved varmesjokk for 45 sek ved 42 ° C. Transformerte bakterier blir sådd ut på selektiv agar inneholdende 40 ug / ml kanamycin. En enkelt koloni fra platen blir brukt til å inokulere en kultur i en 1000-3000 ml rystekolbe. Uttrykk for rekombinant protein er indusert med 1 mM IPTG. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
2. Rensing av Shadoo Protein ved lavtrykk væskekromatografi (LPLC)
- Cellelysis og Inutstøting organer forberedelse
- Samle bakteriesuspensjonen og overføre den til sentrifugeringsrør (figur 2).
- Sentrifugering ved 2500 xg, i 20 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten ved dekantering og resuspender pellets i 15 ml buffer (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 med anti-protease cocktail) for hver pellet avledet fra 500 ml cellekultur.
Merk: Resuspenderte pellets kan fryses og lagres ved -20 ° C i flere dager. Frysing letter bakterieceller lyse. - Kontroller over-ekspresjon av rekombinant protein ved anvendelse av ubearbeidet bakteriepelletene ved hjelp av SDS-PAGE-analyse og Coomassie-farging.
- For dette, sentrifuger 1 ml av bakteriekultur pelletere cellene. Tilsett 100 pl Laemmli denaturering oppløsning (277,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4,4% SDS, 44,4% vekt / volum glycerol, 0,02% bromfenolblått) for å pelletere og varme ved 100 ° C i 5 min.
- Belastning 10 ul av prøven til en 12% akrylamid-gel, drevet SDS-PAGE og visuelt utstyrAlize separert proteiner ved Coomassie farging.
- Legg Triton X-100 0,5% sluttkonsentrasjon på helt resuspenderte pellet fra 2.1.2).
- Inkuber suspensjonen i vannbad ved 37 ° C i 30 min.
- Sonikere suspensjonen i 5 min ved 6-12 mikron fra topp til topp amplitude i is-kaldt vann for å lysere bakterieceller.
- Transfer lydbehandlet suspensjon i rene 50 ml sentrifugeringsrør.
- Sentrifugerør ved 15 000 xg i 15 min ved 4 ° C.
- Fjern supernatanten ved dekantering og tilsett 5 ml av bindingsbufferen (20 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 5 mM imidazol) per rør.
- Plasser rørene på roterende hjul O / N til resuspendere proteiner fra inklusjonslegemer.
Figur 2. Skjema for rensing av inkluderingorganer (som beskrevet i trinn 2.1). Transformerte bakterier som uttrykker Shadoo blir høstet ved sentrifugering og resuspendert i lyseringsbuffer. Suspensjonen inkuberes ved 37 ° C i 30 min, og deretter sonikert for mekanisk å bryte bakterieceller. Ultralydbehandling utføres på is for å forhindre at prøven oppvarming. Ødelagte celler blir høstet ved sentrifugering og resuspendert i en buffer som inneholder 8 M urea å oppløse proteiner fra inklusjonslegemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. - Ni 2+ -affinity kromatografi
Merk: Kromatografi er utført på FPLC System bruker en Ni 2+ -charged, 5 ml sefarose gelaterende kolonne (figur 3A). Alle løsningene er lastet på kolonnen med en strømningshastighet på 1 ml / min.- Injisere 10 ml 0,2 M NISO fire vannløsning til Sepharosekolonnen for å lade denmed Ni 2+ -ioner.
- Ekvilibrer kolonnen ladet med Ni2 + -ioner ved å injisere 30-50 ml bindingsbuffer inneholdende en lav konsentrasjon av imidazol (20 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 5 mM imidazol).
- Installering av urea-solubilisert proteiner med en 50 ml injeksjonssløyfe.
- Gjenvinne gjennomstrømningsfraksjonen ved grundig vasking i rekkefølge av kolonnen med 10 ml lav imidazol bindingsbuffer (20 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 5 mM imidazol) for å fjerne et maksimum av ubundne proteiner fra kolonnen.
- Vask kolonnen med 50 til 100 ml av vaskebufferen (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea, 80 mM imidazol) for å eluere proteiner ikke-spesifikt bundet til kolonnen.
- Anvende en 15 min lineær gradient av 80-800 mM imidazol i buffer inneholdende 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea. Samle 1 ml fraksjoner under graderingen søknaden. Merk: Hans-tagget-proteiner elueres viddhektar gradient imidazol-buffer inneholdende (brukt som en konkurrent).
- Ta en 8 pl prøve av hver fraksjon og tilsett 4 mL 4x Laemmli denaturering løsning (se 2.1.3.1). Varme oppløsninger ved 100 ° C i 5 min.
- Belastning 10 ul protein størrelsesmarkør og 10 ul av hver prøve til 12% akrylamid-gel, drevet SDS-PAGE og visual separerte proteiner med Coomassie-farging. Merknad: Molekylvekten av Shadoo beregnet danner dens aminosyresekvens er 12,243.2 Da.
- Pool alle fraksjoner som inneholder Shadoo.
Figur 3. Rensing prosedyre (som beskrevet i trinn 2,2-2,4). (A) 2 + Ni -ioner kan koordineres av histidinrester, som tillater selektiv rensing av polyhistidin-merkede proteiner. Imidazol ble benyttet for å eluere proteinet, viadens evne til å koordinere med Ni2 + -ion og fortrenge bundet protein (B). Proteiner av varierende hydrodynamisk radius som ble holdt tilbake på en Ni2 + -column separeres på en størrelseseksklusjonskolonne. Proteiner elueres fra de største til de minste. (C) før bruk, fraksjoner inneholdende Shadoo slås sammen og avsaltet for å fjerne urea, imidazol og salter. Kvalitetskontroll analyser inkluderer SDS-PAGE / Coomassie-farging, Western blotting. Renset Shadoo kan frysetørkes. Lyofilisert Shadoo er stabilt i flere måneder når den lagres ved -20 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. - Størrelseseksklusjonskromatografi
Merk: Et andre rensetrinn består i det størrelseseksklusjonskromatografi som skiller Shadoo protein fra andre proteiner ko-eluerte i løpet av det første rensetrinn(Figur 3B).- Ekvilibrer Superdex kolonne av 120 ml totalt sjiktvolum ved å injisere 250 ml av 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4, 0,5 M NaCl, 8 M urea ved en strømningshastighet på 1,5 ml / min.
- Last samlede fraksjoner som inneholder Shadoo fra 2.2.9 på likevekt kolonne. Samle 1 ml fraksjoner etter kolonne-hulromsvolum på 40 ml til av den konstante strømmen av den ovennevnte buffer.
- Ta 10 ul aliquot av hver fraksjon og utføre en SDS-PAGE-analyse og Coomassie-farging som beskrevet ovenfor for å finne ut hvilke fraksjoner som inneholder Shadoo.
- Basseng fraksjoner som inneholder Shadoo.
- Avsalting
Merk: Avsalting fremgangsmåten fjerner salter, imidazol og urea for å oppnå rekombinant Shadoo protein i en buffer egnet for videre biofysiske og biokjemiske studier (figur 3C). Det samme resultatet kan oppnås ved å dialysere prøvene mot bufferen.- Ekvilibrer avsalting en kolonne av 53 ml med 150 mlav 10 mM ammoniumacetatbuffer, pH 5, ved en strømningshastighet på 5 ml / min.
- Load samlet Shadoo fraksjoner på kolonnen. Ved innsprøyting av ammoniumacetatbuffer samle manuelt fraksjoner som viser en økning av signalet ved 280 nm på utgangen av UV-detektoren.
- Fryse-tørke avsaltet Shadoo og lagre det ved -20 ° C.
- Oppløs lyofilisert Shadoo på en adekvat buffer, såsom 10 mM natriumacetat-buffer, pH 5, før bruk.
Merk: polyhistidin lappen kan fjernes med enterokinase.
3. In Vitro Montering av Shadoo inn amyloidfibriler ved fysiologisk pH
Merk: Shadoo protein aggregater og spontant danner fibriller ved pH ≥ 7 11.
Figur 4. Scheme av Shadoo refoldingen å amyloidfibriler (som descriSengen i trinn 3). Renset Shadoo spontant omdannes til amyloidfibriler når oppløst i en buffer med pH ≥ 7. I en sur oppløsning, konverterer Shadoo til amyloide fibriller ved inkubering med 1 M Gdn-HCl under rysting. Kvalitetskontroll analyser inkluderer elektronisk mikroskopi og ThT farging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Fortynn Shadoo til en endelig konsentrasjon på 2 mM i 20 mM Tris-HCl-buffer, pH 7,4. Måle konsentrasjonen ved å måle den optiske tettheten av oppløsningen ved 280 nm og ved hjelp av ekstinksjonskoeffisienten utledes Shadoo aminosyre-sammensetning av 20970.
- Inkuber 500 ul av løsningen i et konisk plastrør ved 4 ° C i et par uker, for å tillate spontan omdannelse til amyloidproteinstrukturer (figur 4).
- Legg nylaget thioflavin T (ThT) til en endelig concentration på 10 uM til en 100 ul alikvot av Shadoo løsningen. Inkuber løsningen i 5 min ved RT. Måle fluorescensemisjonen fra 460 til 520 nm ved bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 435 nm for å bekrefte tilstedeværelsen av amyloid strukturer 17.
4. In Vitro Montering av Shadoo til amyloidfibriler ved sur pH
- Fortynn Shadoo i 1 M GdnHCl, 20 mM Na-acetatbuffer, pH 5 til en sluttkonsentrasjon på 2 mM.
- Inkuber 500 ul av denne løsningen i et konisk rør med kontinuerlig rysting ved 37 ° C i 3-7 dager.
- Kontroller nærvær av amyloidfibriler ved tilsetning av ThT til en alikvot av løsningen som i 3.3.
- Dialyser oppnådde suspensjonen mot 10 mM Na-acetatbuffer, pH 5,0, for å rense Shadoo amyloide fibriller.
- Oppbevar rensede fibriller ved 4 ° C.
Figur 5. Representative resultater. Protein fraksjonene som ble eluert fra Ni2 + -charged chelaterende kolonne (A) og kolonne størrelseseksklusjonskromatografi (B) ble analysert ved hjelp av SDS-PAGE og Coomassie-farging. Identifisering av renset Shadoo ble vurdert ved hjelp SPRN anti-Shadoo antistoff (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
5-10 mg av renset protein Shadoo oppnås per liter bakteriekultur. En to-trinns rensing er nødvendig for å oppnå rekombinant Shadoo av høy renhet. Det første trinn blir utført ved affinitetskromatografi med en Ni2 + -charged kolonne som beholder His-tagget-proteiner. Eluerte fraksjoner underkastet SDS-PAGE og farget med Coomassie Brilliant Blue (figur 5A). Fraksjoner inneholdende protein Shadoo blir slått sammen og ytterligere renset ved størrelses-eksklusjonskromatografi, som separerer proteiner i henhold til deres størrelse (Shadoo molekylvekt er omtrent 12 kDa). Fraksjoner oppsamlet ved eluering blir visualisert ved SDS-PAGE / Coomassie-analyse (figur 5B). I tillegg er Shadoo dokumentert av Western-blot ved anvendelse av et spesifikt anti-Shadoo antistoff SPRN som binder seg til en epitop mellom følsom 76-105 aminosyrer fra den protein C-terminale område (figur 5C).
Shadoo refoldingen til enmyloid fibriller bekreftes ved ThT farging (figur 6A), og ved negativ farging elektronmikroskopi (figur 6B). ThT er et fluorescerende fargestoff som binder cross-β-sheet kvartære strukturer karakteristiske for amyloid forsamlinger. Økning i ThT intensitet på figur 6A viser at Shadoo omdannes til amyloidal strukturer.
Figur 6. Representative resultater. (A) Shadoo fibriller av 2 pM monomer ekvivalent konsentrasjon ble preinkubert med ThT (10 pM sluttkonsentrasjon) i 5 min ved RT. Fluorescens-emisjonsintensitet blir registrert for hver prøve ved anvendelse av en eksitasjonsbølgelengde på 435 nm. Legg merke til en betydelig økning i ThT fluorescensintensitet i en oppløsning inneholdende Shadoo polymeriseres for å amyloidfibriler sammenlignet med kontrollen solution av monomerisk Shadoo. (B) Overføring elektronmikroskopi av fibrillert Shadoo. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En enkel og effektiv protokoll for både ekspresjon og rensing av en stor mengde av rekombinant mus Shadoo protein er presentert. Fremgangsmåten som er beskrevet gjør det mulig vellykket oppløseliggjøring og rensing av (His 6) -tagged Shadoo rekombinant protein. Det er viktig, som påpekt i tittelen, som når det uttrykkes i en prokaryot bakterie E. coli Shadoo akkumuleres i inklusjonslegemer. Før Shadoo rensing, bakterier har til å bli lysert ved sonikering i en buffer inneholdende Triton X-100. Deretter inklusjonslegemer kan bli oppløst i 8 M urea denaturerende oppløsning. Videre har hele renseprosedyren som skal utføres i 8 M urea bufferoppløsning siden Shadoo har en tendens til å polymerisere og aggregat. Etter oppløseliggjøring og rensing av inklusjonslegemene blir supernatanten som inneholder denaturerte proteiner underkastes to-trinns renseprosess: affinitetskromatografi og størrelse-eksklusjonskromatografi. Affinitet Chromatography trinnet består i å binde Shadoo via (Hans 6) -tag til en Ni 2+ -charged gelaterende kolonne. I 8 M urea løsnings proteiner er denaturert og deres histidinrester er overflateeksponert. I tillegg fremmer urea Shadoo strukturell integritet ved å forhindre proteolyse i tilfelle av forurensende proteaser. I det andre rensetrinnet, Shadoo eluert fra med gradienten av imidazol underkastes størrelseseksklusjonskromatografi for å separere kontaminerende proteiner. Under det andre trinnet blir store proteiner elueres først, mens de er ute av stand til å gå inn i porene i matriksen, og dermed ha en direkte bane gjennom kolonnen. Mindre proteiner, som Shadoo, ta lengre tid å eluere fra kolonnen fordi de kan gå inn i porene, og har en mer korrugert bane. Til slutt blir proteinblandingen avsaltet for å fjerne urea, imidazol og salter. Kvalitetskontroll indikerer at etter denne prosedyren rekombinant Shadoo renses til høy renhet. Det kan benyttes i various biologiske og bioteknologiske studier.
E. coli-ekspresjonssystem er et ekstremt nyttig verktøy for ekspresjon av rekombinante proteiner. Den lave kostnaden, enkel manipulasjon, hurtighet og bekvemmeligheten av å uttrykke pattedyr proteiner i E. coli gjøre dette vert det første valget verktøy for life science applikasjoner. Imidlertid kan ikke alle pattedyrproteiner kan bli uttrykt i løselig form eller / og i en tilstrekkelig mengde i denne bakterien. Noen ganger kan hindringer overvinnes ved ulike strategier som senking uttrykk temperatur, endre arrangører, og legger til rensing tags, ved hjelp av alternative medier 18-20. Men i noen tilfeller kan finne en optimal ekspresjon tilstand har en høy pris i tid og innsats. Vanskeligheter med å produsere rekombinant Shadoo ble overvunnet med SoluBL21 kompetente E. coli-stamme. Dette mutant vertsstammen bedret seg betydelig utbyttet av Shadoo produksjon og tillater oss å få fullt oppløseligShadoo. Utbyttene som ble oppnådd var i området 5-10 mg / l kultur.
Rekombinant Shadoo viste seg å være en innfødt ustrukturert protein gir en tilfeldig pole funksjonen ved sirkulærdikroisme spektroskopi 11,12. Være et høyt positivt ladet protein (pI ~ 10,44) Shadoo en tendens til å aggregere ved fysiologisk pH. Imidlertid er Shadoo fullstendig oppløselig i bufferoppløsninger på sure pH-verdier. Vi presenterte her enkle og effektive protokoller å polymer Shadoo til amyloidfibriler på ulike pH-verdier. Polymerisert Shadoo representerer et verdifullt verktøy for å studere patologiske protein folder som preger enkelte nevrodegenerative sykdommer. Rekombinant Shadoo renset ved hjelp av vår prosedyre kan brukes for videre biokjemiske og strukturelle karakterisering av den konformasjonelle overgangsprosessen.
Basert på sin primærstrukturen, ble Shadoo forutsagt til å ha en N-bundet glykosyleringssete og signalpeptider for feste av glycosylphosphatidylinositol (GPI) anker ved sin C-terminale ende (figur 1A). Rekombinant Shadoo renset fra inklusjonslegemer er fratatt karbohydrater siden E.coli uttrykk systemet ikke er i stand til å utføre post-translasjonelle modifikasjoner. Følgelig kan interaksjoner av rekombinante Shadoo med proteiner, lipider eller nukleinsyrer bli modifisert sammenlignet med det native protein. For eksempel, ble betydningen av Shadoo glykosylering nylig foreslått for Shadoo proteasomet nedbrytning etter proteinmodifisering av ubiquitinering 21. Rollen til GPI anker i prionsykdom er ikke kjent, men mange studier tyder på at GPI-ankeret kan spille en rolle i patogenesen av prionsykdommer 22,23. Således bakteriell uttrykt Shadoo kan anvendes for in vitro studier som tar hensyn til disse begrensningene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
References
- Biasini, E., Turnbaugh, J. A., Unterberger, U., Harris, D. A. Prion protein at the crossroads of physiology and disease. Trends in Neurosciences. 35, 92-103 (2012).
- Colby, D. W., Prusiner, S. B. De novo generation of prion strains. Nature Reviews. Microbiology. 9, 771-777 (2011).
- Chiti, F., Dobson, C. M. Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).
- Nelson, R., et al. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature. 435, 773-778 (2005).
- Murphy, R. M. Kinetics of amyloid formation and membrane interaction with amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1923-1934 (2007).
- Steunou, S., Chich, J. F., Rezaei, H., Vidic, J. Biosensing of lipid-prion interactions: insights on charge effect, Cu(II)-ions binding and prion oligomerization. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1399-1406 (2010).
- Watts, J. C., Westaway, D. The prion protein family: diversity, rivalry, and dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta. 1772, 654-672 (2007).
- Westaway, D., Daude, N., Wohlgemuth, S., Harrison, P. The PrP-like proteins Shadoo and Doppel. Topics in Current Chemistry. 305, 225-256 (2011).
- Baillod, P., Garrec, J., Tavernelli, I., Rothlisberger, U. Prion versus doppel protein misfolding: new insights from replica-exchange molecular dynamics simulations. Biochemistry. 52, 8518-8526 (2013).
- Daude, N., et al. Wild-type Shadoo proteins convert to amyloid-like forms under native conditions. Journal of Neurochemistry. 113, 92-104 (2010).
- Li, Q., et al. Shadoo binds lipid membranes and undergoes aggregation and fibrillization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 438, 519-525 (2013).
- Watts, J. C., et al. The CNS glycoprotein Shadoo has PrP(C)-like protective properties and displays reduced levels in prion infections. The EMBO Journal. 26, 4038-4050 (2007).
- Watts, J. C., et al. Protease-resistant prions selectively decrease Shadoo protein. PLoS Pathogens. 7, e1002382 (2011).
- Westaway, D., et al. Down-regulation of Shadoo in prion infections traces a pre-clinical event inversely related to PrP(Sc) accumulation. PLoS Pathogens. 7, e1002391 (2011).
- Chevalier, C., et al. PB1-F2 influenza A virus protein adopts a beta-sheet conformation and forms amyloid fibers in membrane environments. The Journal of Biological Chemistry. 285, 13233-13243 (2010).
- Tarus, B., et al. Oligomerization paths of the nucleoprotein of influenza A virus. Biochimie. 94, 776-785 (2012).
- Biancalana, M., Koide, S. Molecular mechanism of Thioflavin-T binding to amyloid fibrils. Biochimica et Biophysica Acta. 1804, 1405-1412 (2010).
- Minic, J., Sautel, M., Salesse, R., Pajot-Augy, E. Yeast system as a screening tool for pharmacological assessment of g protein coupled receptors. Current Medicinal Chemistry. 12, 961-969 (2005).
- Schein, C. H. A cool way to make proteins. Nature Biotechnology. 22, 826-827 (2004).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein expression in Escherichia coli. Journal of Biotechnology. 115, 113-128 (2005).
- Zhang, J., et al. Disruption of glycosylation enhances ubiquitin-mediated proteasomal degradation of Shadoo in Scrapie-infected rodents and cultured cells. Molecular Neurobiology. 49, 1373-1384 (2014).
- Englund, P. T. The structure and biosynthesis of glycosyl phosphatidylinositol protein anchors. Annual Review of Biochemistry. 62, 121-138 (1993).
- Puig, B., Altmeppen, H., Glatzel, M. The GPI-anchoring of PrP: implications in sorting and pathogenesis. Prion. 8, 11-18 (2014).
