Introduction
فهم بنية البروتين على المستوى الذري هو المفتاح لكشف الأساس الجزيئي للمسارات البيولوجية والأمراض. الأشعة السينية البروتين البلورات هي / طريقة المطبق الأكثر استخداما لتحديد هياكل الجزيئات. التحدي الرئيسي لهذه الطريقة هو الحصول على كميات كافية من مطوية بشكل صحيح، البروتين النقي. هذا يصبح قضية خاصة عندما تعمل مع البروتينات الثدييات يفرز، التي تخضع التعديلات بعد متعدية محددة.
البروتينات أعرب البكتريا-هي المصدر الرئيسي للبروتينات تبلور المودعة في بنك معلومات البروتين 1. ويفضل أنظمة التعبير البكتيرية إلى حد كبير لأنها سريعة وغير مكلفة وتنتج غلة عالية من البروتين عادة. ومع ذلك، غالبا ما تكون غير مطوية بشكل صحيح المجالات خارج الخلية من البروتينات الثدييات أعرب في البكتيريا، التي مطلوبة refolding حالة وتنقية واسعة الخطوات للحصول على متجانس FOlded البروتين. بالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتينات الثدييات تتطلب بالغليكوزيل آخر متعدية لتحقيق لطي السليم 2. على الرغم من أن التعبير وبالغليكوزيل في خلايا الخميرة أو الحشرات يمكن التغلب على مشكلة قابلة للطي، والتعديلات بعد متعدية، بما في ذلك بالغليكوزيل، تختلف كثيرا عن تلك الخلايا الثديية 3، مما أسفر عن البروتينات مع التعديلات غير صحيحة أو غير متجانسة.
خلايا الثدييات تعبر عن جميع الآلات الجزيئية اللازمة لضمان التعديلات في مرحلة ما بعد متعدية المناسبة وقابلة للطي. ومع ذلك، لا يفضل هذه الأنظمة التعبير عادة من قبل معظم المختبرات، وذلك بسبب عائدات محدودة وارتفاع تكاليف الكواشف والمواد الاستهلاكية. Polyethyleneimine (PEI)، وكاشف ترنسفكأيشن هو معيار رخيصة نسبيا ولكن يفرض السمية الخلوية كبيرة وانخفاض كفاءة ترنسفكأيشن، مما أدى إلى زيادة التكاليف في وسائل الإعلام خلية، DNA، وزراعة المعدات. العديد من البدائل لPEI باهظة التكاليف. نتناولهذه القضايا من خلال وصف مزيج من تحسين أدوات زراعة الخلايا ومعدلة كيميائيا PEI للطريقة سريعة وغير مكلفة نسبيا للتعبير عن البروتينات الثدييات يفرز، تليها خطوة واحدة تنقية. هذا الأسلوب القوي يعطي عوائد كافية للدراسات الفنية والبيوكيميائية 4، وفي بعض الحالات، يؤدي إلى بروتين قابلة للتبلور دون مزيد من التنقية.
يصف هذا البروتوكول العديد من التقنيات لتحقيق أقصى قدر من التعبير والاستسلام للبروتينات في الثدييات يفرز في الكلى الجنينية البشرية (HEK) 293F الخلايا المزروعة في التعليق. كفاءة ترنسفكأيشن (والتكلفة)، وإنتاج البروتين وتنقية كلها تتعزز بشكل كبير باتباع هذا البروتوكول. PEI تعديل بإضافة الكربانيت من خلال خطوة واحدة رد فعل عصابة فتح (PEI-TMC-25 والتركيب والخواص وصفها بالتفصيل في المرجع 5) يحسن إلى حد كبير كفاءة ترنسفكأيشن، ويقلل من السمية الخلوية من الموجبةاضطراب الغشاء، وبالتالي يقلل من تكاليف التجربة. وعلاوة على ذلك، بقاء الخلية وبروتين تعبير تحسنت كثيرا مع إضافة المكملات الثقافة لتوفير الجلوكوز والفيتامينات. الأهم لإنتاج البروتينات الغليكوزيلاتي، والمعاملة مع kifunensine، مثبط كيميائية غير سامة من مانوزيداز I، وتنتج البروتينات مع المعرفة، glycans غير الناضجة، والتي يمكن إزالتها بواسطة EndoHf endoglycosidase لانتاج البروتينات مع واحد N-acetylglucosamine في مكان كامل طول N-ربط غليكان 6. وأخيرا، فإن إفراز البروتينات في المصل خالية والمتوسطة محددة كيميائيا يسمح تنقية السريعة والسهلة للدراسات الهيكلية والبيوكيميائية. خطوة واحدة حامض والنيكل nitrilotriacetic (ني NTA) تنقية الراتنج يزيل معظم تلويث الأنواع في طاف، وفي بعض الحالات، يمكن أن تسفر عن بروتين من نقاء كافية لبلورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنتاج كميات مليغرام DNA البلازميد على نطاق واسع ترنسفكأيشن عابر
- استنساخ البروتين من الفائدة في نسخة عالية عدد الثدييات ناقلات التعبير باستخدام الاستنساخ موقع التقييد، أو تقنية أخرى مناسبة.
- لأفضل النتائج، استخدم pHLsec 7 ناقلات، والتي لديها المدمج في محطة سي 6His العلامة، مروج تسلسل كوزاك قوي وإشارة إفراز الأمثل.
- تحويل البلازميد على الخلايا المختصة.
- إضافة 20 ميكرولتر من الخلايا القولونية E. المختصة على 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- خلايا الصدمة الحرارية في 42 درجة مئوية لمدة 35 ثانية، ثم احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة.
- إضافة 300 ميكرولتر من متوسط النمو الميكروبي (SOC)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
- لوحة الخلايا على لوحة أجار مع اختيار المضادات الحيوية المناسبة.
- استخدام 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين إذا البلازميد هو في ناقلات pHLsec.
- المستعمرات ثقافة في 250 مل من مرق لوريا (LB) وسائل الإعلام تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل مضاد حيوي (كربنيسيلين) O / N عند 37 درجة مئوية، والهز في 220 دورة في الدقيقة.
- تنقية DNA من الثقافة باستخدام مرحبا السرعة البلازميد ماكسي كيت وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- أزل الحمض النووي في المخزن EB (10 ملي تريس الكلورين، ودرجة الحموضة 8.5)، بدلا من العازلة TE.
- قسامة البلازميد المنقى في المبلغ اللازم لترنسفكأيشن وتخزينها في -20 ° C.
2. على نطاق واسع الثقافة وعابر ترنسفكأيشن من خلايا 293F
- الملحق 1 L 293F وسائل الإعلام مع 10 مل من الجلوتامين و 5 مل القلم / بكتيريا (سواء 100X). تخزينها في 4 ° C. 5 مل القلم / بكتيريا هو مصدر قوة كافية في ظروف خالية من المصل وتركيز المضادات الحيوية انخفاض يحسن بقاء الخلية خلال ترنسفكأيشن، مما يحسن من عوائد البروتين.
- ثقافة الخلايا 293F في 300 مل سائل الاعلام في 1 L البولي حير قوارير مخروطي مع غطاء تنفيسالصورة في 37 ° C مع 8٪ CO 2، في حين تهتز في نسيج الثقافة حاضنة قياسية.
- تمييع الخلايا إلى 5 × 5 10 / مل كثافة قبل ترنسفكأيشن يوم واحد.
- في يوم ترنسفكأيشن، الملحق مستنبت بإضافة حجم 10٪ من 2٪ ث / ت سرع في 293F وسائل الإعلام.
- قياس تركيز الجلوكوز باستخدام جهاز الجلوكوز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة والمكملات استخدام حسب الحاجة لتحقيق تركيز الجلوكوز من 500 ملغ / ديسيلتر.
- إضافة kifunensine (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) في هذه الخطوة للسيطرة على البروتين بالغليكوزيل.
- حساب حجم DNA اللازمة ل1 ميكروغرام البلازميد في 1 × 10 6 خلايا. تحت ظروف معقمة، وتمييع DNA في 5 مل مصل خالية المتوسطة.
- حساب حجم كاشف ترنسفكأيشن اللازمة ل1 ميكروغرام البلازميد في 2 ميكرولتر كاشف ترنسفكأيشن. تحت ظروف معقمة، وتمييع كاشف ترنسفكأيشن (PEI-TMC-25) في 5 مل مصل خالية المتوسطة.
- إضافةكاشف ترنسفكأيشن إلى حل DNA في 1 مل الزيادات، خلط بلطف. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT للمجمعات-DNA كاشف لتشكيل. ثم إضافة محلول على الخلايا بطريقة الإفلات من الحكمة.
- السماح الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل للتعبير عن البروتين ل72-96 ساعة. الملحق مع وسائل الإعلام ~ 10٪ زيادة حجم خلية يوميا، أو حسب الضرورة للحفاظ على مستوى السكر في قراءة 400-600 ملغ / ديسيلتر.
3. تنقية
- صب الثقافة في قارورة الطرد المركزي، الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1300 x ج لتكوير الخلايا ومن ثم جمع طاف. إذا لزم الأمر، وتدور مرة ثانية و / أو استخدام فلتر 0.22 ميكرون لتوضيح طاف.
- إضافة 10٪ حجم 10X ني NTA العازلة ملزمة (1.5 M كلوريد الصوديوم، 0.5 MK 2 هبو 4، 0.1 M تريس درجة الحموضة 8.5، 50 ملي إميدازول).
- إعداد عمود الجاذبية عن طريق إضافة 2 مل من ني NTA الطين في عمود وتوازنه مع 10 مجلدات العمود (CV) من 1X العازلة ملزمة. إذا كان ذلك ممكنا، القيام بكل الخطوات عمود في غرفة C 4 درجات. البديلةاعل، البروتين البرد وجميع المخازن على الجليد قبل الخطوة العمود، والحفاظ على البروتين والتي تم جمعها من خلال التدفق على الجليد.
ملاحظة: ني NTA الطين هو 50٪ راتنج من حيث الحجم والقدرة على تصنيع وملزمة المعلن هو 50 ملغ / مل. حبات ني NTA يمكن إعادة شحن لاستخدامات متعددة - تدفق طاف على الراتنج وجمع التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة.
- يغسل مع 10 CV من غسل العازلة (300 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي K 2 هبو 4 و 20 ملي إميدازول درجة الحموضة 8).
- أزل البروتين في 5 CV من شطف العازلة (300 ملي كلوريد الصوديوم، و 50 ملي K 2 هبو 4، 250 ملي إميدازول درجة الحموضة 8).
- إذا كنت بحاجة deglycosylation:
- عن الحجم النهائي من 0.5 مل، والتركيز شطافة إلى 0.43 مل باستخدام مكثف الطرد المركزي. إذا يترسب النموذج، بيليه أي حطام بواسطة الطرد المركزي في 16000 x ج و 4 درجات مئوية.
- إضافة 50 ميكرولتر من 500 ملي نا السيترات درجة الحموضة 5.5.
- إضافة 20 ميكرولتر من EndoHf (1 × 10 6 U / مل). في احتضان RT لمدة 2 ساعة.
ليسه: يعمل انزيم الأمثل عند 37 درجة مئوية، مما قد يسبب البروتين مركزة لتجميع. تمديد حضانة RT، إذا deglycosylation، المقررة من قبل SDS-PAGE أو immunoblotting، غير كامل. لم يقم انزيم النشاط في 4 درجات مئوية. - لإزالة EndoHf: غسل الأميلوز الراتنج 3X في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو عازلة التخزين النهائي. احتضان البروتين مع الراتنج لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. تدور 5 دقائق في 1000 x ج لتكوير الخرز وجمع طاف.
- تركيز البروتين باستخدام الوزن الجزيئي قطع فلتر الطرد المركزي المناسب والعازلة الصرف إلى العازلة التخزين (150 ملي كلوريد الصوديوم، و 20 ملي HEPES 7.5 درجة الحموضة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يلي هذه الوثيقة نتائج هذا النظام التعبير تطبيقها على يفرز 13 كيلو دالتون المناعي (IG) المجال من البروتين مما اثار مستقبل بشري أعرب عن خلايا الدم النخاعي 2 (hTREM2، وبقايا 19-132). TREM2 هو نوع I بروتين الغشاء خارج الخلية التي تحتوي على مجال واحد أ.ج التي لديها اثنين من السندات ثاني كبريتيد وموقعين بالغليكوزيل المرتبطة N. على عكس العديد من البروتينات مجال أخرى الإيج 8، كان TREM2 غير قابلة للrefolding من الهيئات إدراج البكتيرية 9. مطلوبة الطفرات اللاحقة أكدت glycans N-ربط للتعبير السليم وقابلة للطي. لتسهيل الدراسات البنيوية والوظيفية، وقدم TREM2 في ناقلات pHLsec مع محطة C 6His العلامة 7 باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية. التعبير عابر في الخلايا HEK293F تعامل مع kifunensine أسفرت عن البروتين الذي تم تنقيته بواسطة ني NTA اللوني (الشكل 1B، 2 لين) وبعد ذلك deglycosylated العينة لإنتاج ناتيمطوية vely، البروتين متجانسة (1B الشكل، حارة 3). 293F التعبير عن TREM2 تنتج 5-10 ملغ / لتر (5-10μg / مليون الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل). بعد عازلة تتبادل في المخزن المؤقت التخزين، وتبلور هذا البروتين (الشكل 1C). وعلى الرغم من نقاء النهائي لنحو 80٪، وهذه البلورات تتكرر بشكل موثوق، diffracted، وعرضت من قبل الفضة وصمة عار لاحتواء فقط بروتين TREM2 (1D الشكل). وتشير هذه الملاحظة تجانس الكيمياء الحيوية من البروتين (أي قابلة للطي والتعديلات بعد متعدية) يمكن، في بعض الحالات، يكون أكثر أهمية من النقاء الكلي للنجاح التبلور.
بالإضافة إلى بلورة، وهذا النظام يوفر أداة قوية لدراسات الهيكلية والوظيفية. يتم استغلاله لإنتاج البروتين الغليكوزيلاتي أصلا وتحقيق> 95٪ نقاء من حيث الحجم الاستبعاد اللوني (الشكل 1E، F). هذه الخطوة تنقية إضافية، مما يدل على solutioالسلوك ن من البروتين، هو أيضا وسيلة مثالية لمراقبة نوعية البروتين. البروتين النقي يجب أن أزل في حجم الموافق الوزن الجزيئي وينبغي أن تكون الأنواع الأكثر وفرة في العينة. بشكل غير طبيعي كميات كبيرة من البروتين مجمعة قد يشير بروتين غير مستقر، وتوفير القرائن لتحسين إنتاج البروتين وتنقية. وعلاوة على ذلك، هذا البروتين النقي النهائي هو الافضل للاستخدام في التجارب الفيزيائية الحيوية الكمية مثل دائري الطيفي ازدواج اللون والاستقرار الحراري، والتحقيق البروتين يجند التفاعلات. وأخيرا، والسيطرة على مدى ارتباط بالغليكوزيل يوفر أداة قوية لدراسة الوظائف التي تعتمد على غليكان.
الشكل 1. نظام التعبير الثدييات: (A) مخطط للتعبير الثدييات من البروتينات مع بالغليكوزيل رقابة أو الأصلي في الخلايا كلوة 293F. ( B) أعربت SDS-PAGE من NiNTA تنقيته-hTREM2 تحت kifunensine تظهر من قبل (حارة 2) وبعد (حارة 3) deglycosylation مع EndoHf. (C) بلورات المنتجة من البروتين NiNTA-المنقى وdeglycosylated. (D) الفضة وصمة عار من المدخلات التبلور (حارة 1) وبلورات تحصد (الممرات 2 و 3) يكشف عن بلورات تحتوي فقط TREM2. وقد تحقق (E) للمزيد من تنقية TREM2 باستخدام الحجم الاستبعاد اللوني من TREM2 NiNTA تنقيته المنتجة في 293F الخلايا دون Kifunensine. النجمة (*) تشير إلى كميات شطف معايير الوزن الجزيئي. البروتينات مزال في TBS باستخدام عمود S200 التحليلي (GE). (F) تحليل SDS-PAGE من الحجم تنقية استبعاد TREM2: البروتين المدخلات (حارة 2) وذروة مطوية (حارة 3). لاحظ كيف، glycans غير متجانسة تشغيلها في الوزن الجزيئي العالي واضح مع مسحة واسعة من قبل SDS-PAGE بالكامل.NK "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خلايا كلوة 293F تقدم إنتاج قوي من البروتينات التي تتطلب التعديلات بعد متعدية. هذا النظام يسمح التعبير السريع وقابلة للبروتينات مطوية أصلا تحتوي على ثنائي السلفيدات، بالغليكوزيل، والفسفرة التي لولاها تكون غائبة في استخدام المزيد من أدوات التعبير الروتينية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام يمكن استخدامه للتعبير عن وتنقية مجمعات متعددة البروتين ببساطة عن طريق التعاون ترنسفكأيشن من البلازميدات متعددة. إلى جانب TREM2، وقد تم هذا النظام يستخدم على نطاق واسع للدراسات الفنية مع البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في المختبر 10،11. خلايا الثدييات كما تقدم خالية من الذيفان الداخلي البروتين الأمثل التعبير عن التجارب المجراة أو لإنتاج المضادات مطوية أصلا لتوليد الأجسام المضادة التي تعتمد على التشكل.
بقاء الخلية وترنسفكأيشن الظروف المثلى هي الأكثر أهمية لإنتاج البروتين بكفاءة. لتحسين بقاء الخلية، وعزز الثقافات الخلية المنخفض مرورمع ملاحق ثقافة الخلية وتركيز المضاد الحيوي في وسائل الإعلام النمو هو انخفاض. لتعديل PEI-TMC-25 لديها كفاءة transection مناسبة مع معظم البروتينات. ومع ذلك، هناك خيارات أخرى متاحة في السعر المعتدل التي تقدم زيادة كفاءة ترنسفكأيشن وانخفاض السمية الخلوية. الضجيج 5 (عوز العلوم البيولوجية) يزيد من غلة مقارنة PEI أو الكواشف الأخرى، بتكلفة مخفضة بشكل كبير مقارنة مع الكواشف ترنسفكأيشن أكثر تكلفة، مثل 293fectin. نوع كاشف وDNA: نسب كاشف يمكن أن يكون الأمثل للتعبير عن الفردية واحتياجات التجربة المطلوبة.
الطريقة الموضحة هنا لديها العديد من المزايا أكثر من غيرها من أساليب إنتاج البروتين. خلايا الثدييات تقدم للطي كوصي الأصلي والتعديلات بعد متعدية متاحة للبكتيريا والخميرة. الوقت تخفيض لبناء البلازميد والإعداد، إلى جانب استخدام وسائل الإعلام، ودرجة الحموضة والتي يمكن تعديلها مباشرة، وجعلها متفوقة على baculovirإنتاج ومقرها الولايات المتحدة في خلايا الحشرات. وأخيرا، فإن وسائل الإعلام الحرة المصل يقدم التحجيم سطحي (أعلى كثافة الخلية) وتنقية لا يمكن تحقيقها لخلايا 293T ملتصقة. كبير الحد من هذا النظام هو فقط الوقت وتوسيع نطاق الباحث الفرد قادرا على الالتزام بروتين التعبير.
وشملت أدناه هي استكشاف خيارات للقضايا الأكثر شيوعا التي تواجهها.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
إذا كان هناك انخفاض البروتين التعبير، وتجنب الركض 293F خلايا أطول من 2-3 أشهر. النتائج الركض لفترات طويلة في صحة الخلية انخفاض عكست في أوقات مضاعفة أبطأ وخفضت إلى حد كبير البروتين التعبير. يجب مراقبة نمو الخلايا يوميا والثقافات لم تعد مضاعفة يوميا يجب التخلص. ويمكن تحسين بقاء الخلية باستخدام المكملات الثقافة في حين الركض الخلايا. مراقبة الجلوكوز لضمان تركيز ثقافة 400-600 ملغ يجب أن لا تتجاوز / DL كثافة الخلايا 2000000 / مل ووينبغي أن يكون بقاء الخلية ≥98٪ خلال استبعاد التريبان الأزرق. تمييع الخلايا الكثيفة إلى 0.5 مليون / مل، والسماح لمضاعفة O / N قبل ترنسفكأيشن. تحسين ترنسفكأيشن استخدام نسب مختلفة من ترنسفكأيشن الكاشف: الحمض النووي (ضمن مجموعة من DNA 1 ميكروغرام: 1،5-6 ميكرولتر كاشف). ويمكن القيام بذلك باستخدام 2 مل الثقافات في لوحة 6 جيدا وإخراج تقاس immunoblotting. فعل 12 نقطة الساعة ساعة يمكن أن تشير إلى ما إذا كان يتم التعبير عن البروتين ويتحلل سريعا. تحقق من المحللة خلية إن لم يكن لوحظ البروتين في جزء طاف. البروتينات تتجمع، والتي فشلت في أن يفرز، سيظل واضحا في المحللة الخلية immunoblotting.
إذا الاحتفاظ ني NTA منخفضة، أي يبقى البروتين في التدفق من خلال بعد العمود ملزم، واستخدام الراتنج الطازجة. وزيادة درجة الحموضة من العينة إلى 8.5 يؤدي إلى أقوى ملزمة للراتنج، على الرغم من أن هذا سيزيد أيضا غير محددة وملزمة. التركيز على عينة دفعة وملزمة لراتنج O / N عند 4 درجات مئوية يكونالصدارة تنقية ني NTA قد يؤدي إلى زيادة ~ 5X في البروتين استردادها. إذا كان 6His العلامة غير قابلة للوصول بسبب بنية التعليم العالي من البروتين، ومحاولة استنساخ ذلك على محطة أخرى. بدلا من ذلك، استخدام الراتنج الكوبالت، والتي لها قابلية أعلى للمخلفات صاحب.
إذا المجاميع البروتين و / أو رواسب خلال تنقية، وزيادة القابلية للذوبان عن طريق إضافة 10٪ الجلسرين في ني NTA غسل وشطف المخازن. تشغيل أعمدة النيكل تقارب في RT بدلا من 4 ° C. استخدام المسح التفاضلي fluorimetry 12 للكشف عن درجة الحموضة والملح / الإضافات التي تزيد من استقرار البروتين في الحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
