كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

Daniel L. Kober; Zeynep Yurtsever; Thomas J. Brett

doi:10.3791/53445

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

12.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53445

⸱

ديسمبر 23, 2015

Daniel L. Kober^*¹^,²^,³ , Zeynep Yurtsever^*²^,³^,⁴^,⁵ , Thomas J. Brett²^,³^,⁵^,⁶^,⁷

¹Molecular Microbiology and Microbial Pathogenesis Program, Washington University School of Medicine, ²Department of Internal Medicine, Washington University School of Medicine, ³Drug Discovery Program in Pulmonary and Critical Care Medicine, Washington University School of Medicine, ⁴Biochemistry Program, Washington University School of Medicine, ⁵Center for the Investigation of Membrane Excitability Diseases, Washington University School of Medicine, ⁶Department of Biochemistry and Molecular Biophysics, Washington University School of Medicine, ⁷Department of Cell Biology and Physiology, Washington University School of Medicine

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هذا بروتوكول سريع وفعال من حيث التكلفة لإنتاج بروتينات الثدييات المفرزة والجليكوزيل والتنقية اللاحقة أحادية الخطوة مع عوائد كافية من البروتين المتجانس لعلم البلورات بالأشعة السينية والدراسات الفيزيائية الحيوية الأخرى.

الملخص

يمكن أن يكون إنتاج بروتينات الثدييات المفرزة للدراسات الهيكلية والفيزيائية الحيوية أمرا صعبا ويستغرق وقتا طويلا ومكلفا. فيما يلي بروتوكول فعال من حيث الوقت والتكلفة للتعبير عن البروتين المفرز في خلايا الثدييات وتنقية بخطوة واحدة باستخدام كروماتوغرافيا تقارب النيكل. يعتمد النظام على تعداء عابر على نطاق واسع لخلايا الثدييات المعلقة ، مما يقلل بشكل كبير من وقت إنتاج البروتين ، لأنه يلغي الخطوات ، مثل تطوير فيروسات التعبير أو توليد خطوط خلوية معبرة مستقرة. يستخدم هذا البروتوكول عوامل تعدين رخيصة الثمن ، والتي يمكن تصنيعها بسهولة عن طريق التعديل الكيميائي البسيط ، أو عوامل التعداء ذات الأسعار المعتدلة ، والتي تزيد من العائد من خلال زيادة كفاءة التعداء وتقليل السمية الخلوية. المراقبة الدقيقة والحفاظ على مستويات الجلوكوز في الوسائط تزيد من إنتاجية البروتين. يؤدي التحكم في نضوج الجليكان الأصلي في خطوة التعبير إلى زيادة العائد النهائي لبروتينات الثدييات المطوية والوظيفية بشكل صحيح ، وهي خصائص مثالية لمتابعة علم البلورات بالأشعة السينية. في بعض الحالات ، ينتج التنقية أحادية الخطوة بروتينا بدرجة نقاء كافية للتبلور ، وهو ما يتضح هنا كمثال على الحالة.

المقدمة

فهم بنية البروتين على المستوى الذري هو المفتاح لكشف الأساس الجزيئي للمسارات البيولوجية والأمراض. الأشعة السينية البروتين البلورات هي / طريقة المطبق الأكثر استخداما لتحديد هياكل الجزيئات. التحدي الرئيسي لهذه الطريقة هو الحصول على كميات كافية من مطوية بشكل صحيح، البروتين النقي. هذا يصبح قضية خاصة عندما تعمل مع البروتينات الثدييات يفرز، التي تخضع التعديلات بعد متعدية محددة.

البروتينات أعرب البكتريا-هي المصدر الرئيسي للبروتينات تبلور المودعة في بنك معلومات البروتين ^1. ويفضل أنظمة التعبير البكتيرية إلى حد كبير لأنها سريعة وغير مكلفة وتنتج غلة عالية من ال....