Introduction
Das Verständnis von Proteinstrukturen auf atomarer Ebene ist der Schlüssel zur Aufdeckung der molekularen Grundlagen der biologischen Wege und Krankheiten. Röntgen Proteinkristallographie ist das am häufigsten verwendete / anwendbares Verfahren zur Bestimmung von hochmolekularen Strukturen. Die größte Herausforderung bei diesem Verfahren ist, ausreichende Mengen an korrekt gefalteten, reines Protein. Dies wird ein Problem besonders bei der Arbeit mit sezerniertes Säugerproteinen, die bestimmte post-translationale Modifikationen unterzogen werden.
Bakteriell exprimierten Proteine sind die Hauptquelle für kristallisierte Proteine in der Proteindatenbank 1 abgeschieden. Bakterielle Expressionssysteme sind weitgehend bevorzugt, da sie schnell, kostengünstig und erzeugen typischerweise hohe Ausbeuten an Protein. Jedoch extrazellulären Domänen von Säugerproteinen in Bakterien exprimiert werden oftmals nicht richtig gefaltet sind, zum Erhalten homogen fo in welchem Fall die Rückfaltung und aufwendige Reinigungsschritte erforderlich sindlded Protein. Darüber hinaus haben viele Säugetierproteinen erfordern posttranslationale Glykosylierung, um die richtige Faltung 2 zu erzielen. Obwohl die Expression und Glycosylierung in Hefe oder Insektenzellen können die Falte Problem zu überwinden, post-translationale Modifikationen einschließlich Glykosylierung, unterscheiden sich erheblich von denen von Säugetierzellen 3, wodurch Proteine, die mit fehlerhaften oder nicht homogenen Modifikationen.
Säugerzellen alle erforderlichen molekularen Maschinerie zum richtigen post-translationalen Modifikationen und Faltung zu gewährleisten; aber diese Expressionssysteme sind in der Regel nicht von den meisten Labors bevorzugt, aufgrund der begrenzten Ausbeuten und hohen Kosten für Reagenzien und Verbrauchsmaterialien. Polyethylenimin (PEI), ist ein Standard-Transfektionsreagenz relativ billig, aber erlegt beträchtliche Zytotoxizität und niedrige Transfektionseffizienz, was zu erhöhten Kosten in Zellmedien, DNA, und Kultivieren Ausrüstung. Viele Alternativen zu PEI sind unerschwinglich teuer. Wir sprechenDiese Probleme mit der Beschreibung einer Kombination von verbesserten Zellkulturwerkzeuge und chemisch modifizierte PEI für die schnelle und relativ kostengünstige Methode für die Expression von sezernierten Säugetierproteinen, gefolgt von der Einzelschritt-Reinigung. Das robuste Verfahren ergibt ausreichende Ausbeuten zur funktionellen und biochemischen Untersuchungen 4 und in einigen Fällen führt Protein zugänglich, um die Kristallisation ohne weitere Reinigung.
Dieses Protokoll beschreibt verschiedene Techniken, um die Expression zu maximieren und die Ausbeute für sezernierte Säugetierproteinen in humanen embryonalen Nieren (HEK) 293F Zellen in Suspension gezüchtet. Transfektionseffizienz (und Kosten), Protein-Produktion und Reinigung sind alle stark von folgenden dieses Protokoll erweitert. PEI durch Zugabe von Carbamaten durch eine Einzelschritt-Ringöffnungsreaktion modifiziert (PEI-TMC-25 Synthese und Eigenschaften im Detail in Lit. 5 beschrieben) verbessert Transfektionseffizienz, verringert die Zytotoxizität von kationischenMembranzerstörung und entsprechend reduziert Experiment Kosten. Weiterhin werden die Lebensfähigkeit der Zellen und die Proteinexpression stark mit der Zugabe der Kultur Ergänzungen Glucose und Vitamine zuzuführen verbessert. Wichtig ist für die Herstellung von glycosylierten Proteinen, Behandlung mit kifunensine, eine ungiftige chemische Inhibitor von Mannosidase I, produziert Proteine mit definierten, unreife Glycane, die durch die Endoglycosidase EndoHf entfernt werden, um Proteine mit einer einzelnen N-Acetylglucosamin anstelle von zu ergeben ein voller Länge N-gebundene Glycan 6. Schließlich wird die Sekretion von Proteinen in einem serumfreien, chemisch definierten Medium ermöglicht eine schnelle und leichte Reinigung für strukturelle und biochemische Untersuchungen. Einzelschritt-Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA-Harz) Reinigung entfernt die meisten verunreinigenden Spezies im Überstand und in einigen Fällen kann Protein mit ausreichender Reinheit für eine Kristallisation ergeben.
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Protocol
1. Herstellung von Milligramm-Mengen von Plasmid-DNA für eine groß angelegte Transiente Transfektion
- Klonierung des Proteins von Interesse in einer hohen Kopienzahl Säuger-Expressionsvektor unter Verwendung von Restriktionsstelle Klonierung oder andere geeignete Technik.
- Für optimale Ergebnisse verwenden pHLsec 7 Vektor, der hat einen eingebauten in C-terminal 6His-tag, ein starker Promotor Kozak-Sequenz und eine optimierte Sekretionssignal.
- Verwandeln Sie das Plasmid auf kompetente Zellen.
- Mit 20 ul kompetenter E. coli-Zellen auf 1 & mgr; g Plasmid-DNA und Inkubieren auf Eis für 30 min.
- Hitzeschock-Zellen bei 42 ° C für 35 sec, dann auf Eis für 2 min inkubiert.
- Werden 300 & mgr; l mikrobielle Wachstumsmedium (SOC) und bei 37 ° C für 45 Minuten, bei 220 UpM schüttelnd.
- Platte Zellen auf Agar-Platte mit geeigneten Antibiotika-Selektion.
- Verwenden von 100 & mgr; g / ml Carbenicillin, wenn das Plasmid in der pHLsec vector.
- Kultur Kolonien in 250 ml Luria Broth (LB) Medium, ergänzt mit 100 ug / ml Antibiotikum (Carbenicillin) O / N bei 37 ° C, bei 220 Upm Schütteln.
- Reinigen DNA aus der Kultur unter Verwendung von Hallo-Geschwindigkeit Plasmid Maxi Kit nach Herstellerprotokoll.
- Eluieren der DNA in Puffer EB (10 mM Tris-Cl, pH 8,5) anstelle von Puffer TE.
- Aliquots des gereinigten Plasmids an Menge für die Transfektion und Speicherung erforderlich bei -20 ° C.
2. Großflächige, Kultur und transiente Transfektion von Zellen 293F
- Supplement 1 L 293F Medien mit 10 ml Glutamin und 5 ml Pen / Strep (beide 100x). Lagerung bei 4 ° C. 5 ml Pen / Strep ist eine ausreichende Festigkeit in serumfreien Bedingungen und das reduzierte antibiotische Konzentration verbessert die Lebensfähigkeit der Zellen während der Transfektion, die Proteinausbeute verbessert.
- Kultur 293F-Zellen in 300 ml Medium in 1 L Polycarbonat Erlenmeyer-Kolben mit belüfteten Kappes bei 37 ° C und 8% CO 2, während sie in einem Standard-Gewebekultur-Inkubator Schütteln.
- Verdünnte Zellen bis 5 x 10 5 / ml Dichte einen Tag vor der Transfektion.
- Am Tag der Transfektion Ergänzung Kulturmedium durch Zugabe von 10% Volumen von 2% w / v Cell Boost in 293F Medien.
- Messung der Glucosekonzentration unter Verwendung einer Glukoseüberwachungsvorrichtung gemß den Anweisungen des Herstellers und die Verwendung Ergänzungsmittel erforderlich, um eine Glukosekonzentration von 500 mg / dl zu erreichen.
- Hinzufügen kifunensine (1 ug / ml Endkonzentration) bei diesem Schritt zu Proteinglykosylierung steuern.
- Berechnung des Volumens von DNA 1 & mgr; g Plasmid pro 1 x 10 6 Zellen benötigt. Unter sterilen Bedingungen, verdünnte DNA in 5 ml serumfreiem Medium.
- Berechnen Sie Volumen von Transfektionsreagenz für 1 & mgr; g Plasmid pro 2 ul Transfektionsreagenz erforderlich. Unter sterilen Bedingungen, verdünnten Transfektionsreagenz (PEI-TMC-25) in 5 ml serumfreiem Medium.
- HinzufügenTransfektionsreagenz in die DNA-Lösung in 1 ml-Schritten, Mischen sanft. Inkubation 30 min bei RT Reagenz-DNA-Komplexe zu bilden. Dann fügen Sie die Lösung auf die Zellen in einer tropfenweise Mode.
- Erlauben transfizierten Zellen an Protein für 72 bis 96 h zum Ausdruck bringen. Ergänzung mit ~ 10% Volumen Cell Boost Medien täglich, oder wie erforderlich, zu halten Glukosemesswert von 400 bis 600 mg / dl.
3. Reinigung
- Dekantier-Kultur in ein Zentrifugenflasche, Zentrifuge für 20 min bei 1.300 × g Zellen zu pelletieren und zu sammeln, dann den Überstand. Wenn nötig, drehen ein zweites Mal und / oder verwenden 0,22 um Filter, um Überstand zu klären.
- Zugabe von 10% Volumen 10x Ni-NTA-Bindungspuffer (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M Tris pH 8,5, 50 mM Imidazol).
- Vorbereitung einer Schwerkraftsäule durch Zugabe von 2 ml von Ni-NTA-Aufschlämmung in einer Spalte und Äquilibrieren mit 10 Säulenvolumina (CV) des 1x Bindungspuffer. Wenn möglich, alle Spalten Schritte in einem 4 ° C Raum. AlternativEly, Chill-Protein und alle Puffer auf Eis vor der Spalte Schritt, und halten Protein und gesammelt Durchfluss auf Eis.
Anmerkung: Ni-NTA-Aufschlämmung beträgt 50% Harz nach Volumen und angegebenen Bindungskapazität des Herstellers beträgt 50 mg / ml. Für mehrfachen Gebrauch Ni-NTA-Perlen kann wieder aufgeladen werden - Fließt der Überstand über das Harz und sammeln Durchfluss. Wiederholen Sie diesen Schritt.
- Waschen mit 10 CV Waschpuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM Imidazol, pH 8).
- Eluieren des Proteins in 5 CV Elutionspuffer (300 mM NaCl, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM Imidazol, pH 8).
- Wenn Deglykosylierung ist erforderlich:
- Bis zu einem Endvolumen von 0,5 ml Konzentrat Eluat 0,43 ml unter Verwendung einer Zentrifugation Konzentrator. Wenn Niederschläge gebildet, pelle jede Trümmer durch Zentrifugation bei 16.000 × g und 4 ° C.
- In 50 ul 500 mM Na-Citrat pH 5,5.
- Mit 20 ul EndoHf (1 x 10 & sup6; U / ml). Inkubation bei RT für 2 h.
NichtE: Das Enzym arbeitet optimal bei 37 ° C, was dazu führen kann die konzentrierte Protein zu aggregieren. Verlängern Sie die RT Inkubation wenn Deglykosylierung, durch SDS-PAGE und Immunoblotting untersucht, ist unvollständig. Das Enzym muss nicht Aktivität bei 4 ° C. - Um EndoHf entfernen: Wash Amyloseharz 3x in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) oder Endlagerung Puffer. Inkubieren Protein mit Harz für 1 h bei 4 ° C. Spin 5 min bei 1000 xg zu pelletieren Perlen und sammeln Sie den Überstand.
- Konzentrat Protein unter Verwendung geeigneter Molekulargewichtsgrenze Zentrifugation Filter und Pufferaustausch in Lagerungspuffer (150 mM NaCl und 20 mM HEPES pH 7.5).
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Representative Results
Hierin folgt die Ergebnisse dieser Expressionssystem zu einem sekretierten 13 kDa-Immunglobulin (Ig) -Domäne von menschlichem Protein Auslöse Rezeptor auf myeloide Zellen 2 (hTREM2, Reste 19 bis 132) angegeben angewendet wird. TREM2 ist ein Typ I Transmembranprotein, das eine einzelne extrazelluläre Ig-Domäne, die zwei Disulfidbrücken und zwei N-verknüpfte Glykosylierungsstellen aufweist. Im Gegensatz zu anderen Ig-Domänenproteine 8 wurde TREM2 nicht zugänglich Rückfaltung aus bakteriellen Einschlusskörpern 9. Anschließende Mutagenese bestätigt N-verknüpften Glykane sind für die richtige Expression und Faltung erforderlich. Strukturelle und funktionelle Untersuchungen zu erleichtern, wurde in die pHLsec TREM2 Vektor mit einem C-terminalen 6His-Tag 7 unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken eingeführt. Transiente Expression in Zellen, die mit kifunensine HEK293F behandelt ergab Protein, das von Ni-NTA-Chromatographie gereinigt wurde (1B, Spur 2) und die Probe wurde dann deglycosyliert herzustellen Natively gefaltet, homogenes Protein (1B, Spur 3). 293F Expression TREM2 hergestellt 5-10 mg / L (5-10μg / Millionen transfizierte Zellen). Nach Pufferaustausch in den Speicherpuffer, wurde dieses Protein kristallisiert (Abbildung 1C). Trotz der endgültigen Reinheit von etwa 80%, diese Kristalle zuverlässig reproduziert wird, gebeugt und wurden durch Silberfleck abgebildet nur TREM2 Protein (1D) enthalten. Diese Beobachtung deutet auf die biochemischen Homogenität des Proteins (das heißt, Faltung und posttranslationale Modifikationen) kann in einigen Fällen sein kritischer als Gesamtreinheit zur Kristallisation Erfolg.
Neben der Kristallisation, bietet dieses System ein robustes Werkzeug für die strukturelle und funktionelle Studien. Es wird ausgenutzt, um nativ glykosyliertes Protein zu produzieren und zu erreichen> 95% Reinheit durch Größenausschlusschromatographie (1E, F). Diese zusätzlichen Reinigungsschritt, der die solutio zeigtn Verhalten des Proteins, ist auch ein idealer Weg, um die Proteinqualität zu überwachen. Das gereinigte Protein sollte bei einer entsprechend seinem Molekulargewicht Volumen eluieren und sollte die häufigsten Arten in der Probe sein. Ungewöhnlich große Mengen an aggregiertem Protein instabil Protein angeben und Hinweise auf die Proteinproduktion und Reinigung zu optimieren. Darüber hinaus ist diese endgültige gereinigte Protein superior zur Verwendung in quantitativen biophysikalischen Experimente wie Zirkulardichroismus-Spektroskopie, thermische Stabilität, und die Untersuchung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Schließlich steuert das Ausmaß der Glykosylierung ein robustes Werkzeug zur Glycan abhängige Funktionen zu studieren.
Abbildung 1. Mammalian Expression System: (A) Schema für Säugetier Expression von Proteinen mit kontrollierter oder native Glykosylierung in HEK 293F-Zellen. ( B) SDS-PAGE von NiNTA gereinigten hTREM2 ausgedrückt unter kifunensine vor (Bahn 2) gezeigt, und nach (Bahn 3) Deglykosylierung mit EndoHf. (C) Kristalle von NiNTA-gereinigt und deglykosyliertes Protein produziert. (D) Silberfärbung der Kristallisation Eingang (Spur 1) und geerntet Kristalle (Bahnen 2 und 3) ergibt Kristalle enthalten nur TREM2. (E) Eine weitere Reinigung wurde unter Verwendung TREM2 Grßenausschlußchromatographie der NiNTA-gereinigten TREM2 in 293F-Zellen ohne Kifunensine hergestellt erreicht. Sternchen (*) zeigen Elutionsvolumen der Molekulargewichtsstandards. Proteine in TBS unter Verwendung eines analytischen S200-Säule (GE) eluiert. (F) SDS-PAGE-Analyse der Größenausschluss-gereinigt TREM2: Eingangs Protein (Spur 2) und gefaltet Spitzen (Bahn 3). Zustellen, wie voll, heterogenen Glykane auf einem höheren scheinbaren Molekulargewicht mit einem breiten Abstrich durch SDS-PAGE laufen gelassen.nk "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
HEK 293F-Zellen bieten robuste Produktion von Proteinen erfordert post-translationale Modifikationen. Dieses System ermöglicht eine schnelle und skalierbare Ausdruck der nativ gefalteten Proteine enthalten, Disulfide, Glykosylierung und Phosphorylierung, die sonst mit mehr Routine Expression Tools abwesend sein würde. Darüber hinaus kann dieses System für die Expression und Reinigung von Multiproteinkomplexen einfach durch Co-Transfektion von mehreren Plasmiden verwendet werden. Neben TREM2 Dieses System wurde ausgiebig für funktionelle Studien mit anderen Proteinen von Interesse in der Labor 10,11 eingesetzt. Säugetierzellen bieten auch Endotoxin-freiem Proteinexpression optimal für die in-vivo-Experimente oder für die Herstellung von Antigenen an nativ gefalteten konformationsabhängige Antikörper zu erzeugen.
Optimale Zelllebensfähigkeit und Transfektion Bedingungen sind der wichtigste für die effiziente Proteinproduktion. Für eine bessere Lebensfähigkeit der Zellen, Niedergang Zellkulturen gefördert werdenmit Zellkulturergänzungsmittel und der Konzentration des Antibiotikums in dem Wachstumsmedium verringert. Die modifizierte PEI-TMC-25 hat geeignete Durchtrennung Effizienz bei den meisten Proteinen; aber es gibt auch andere Optionen zur Verfügung, bei moderaten Preis, der erhöhte Transfektionseffizienz und reduzierte Zytotoxizität bieten. Hype 5 (Oz Bioscience) steigert den Ertrag im Vergleich zu PEI oder anderen Reagenzien, mit einer beträchtlich reduzierten Kosten im Vergleich zu den teureren Transfektionsreagenzien wie 293fectin. Das Reagenz Art und DNA: Reagenz-Verhältnisse für die einzelnen Ausdrücke und den Erfordernissen des gewünschten Versuchs optimiert werden.
Das hier beschriebene Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Herstellung von Proteinen. Säugetierzellen bieten nativen Chaperon Faltung und posttranslationale Modifikationen nicht verfügbar, um Bakterien und Hefe. Die reduzierte Zeit für die Plasmidkonstruktion und Herstellung sowie die Verwendung von Medien, deren pH-Wert kann direkt modifiziert werden, überlegen macht baculovirus-basierte Produktion in Insektenzellen; und schließlich bietet die serumfreien Medien facile Skalierung (höhere Zelldichte) und Reinigung nicht erreichbar adhärente 293T-Zellen. Der Chef Begrenzung dieses Systems ist nur die Zeit und Umfang der einzelne Forscher in der Lage, um die Proteinexpression zu begehen.
Unten enthalten sind Optionen zur Fehlerbehebung für die am häufigsten auftretenden Probleme.
Fehlerbehebung
Wenn es niedrige Proteinexpression, zu vermeiden Passagieren 293F-Zellen länger als 2-3 Monate. Längerer Passage führt zu einer verringerten Zell Gesundheit spiegelt sich in langsameren Verdopplungszeiten und Protein-Expression signifikant reduziert. Zellwachstum sollte täglich überwacht und Kulturen nicht mehr verdoppeln täglich zu verwerfen. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch die Verwendung Kultur Ergänzungen während Passagierung Zellen verbessert werden. Überwachen Glukose, eine Kultur-Konzentration von 400-600 mg / dl Die Zelldichte sollte 2 Millionen / ml nicht überschreitet undZelllebensfähigkeit sollte ≥98% durch Trypanblau-Ausschluss zu sein. Verdünnen Sie dichten Zellen auf 0,5 Mio. / ml und ermöglichen zu verdoppeln O / N vor der Transfektion. Optimierung der Transfektion unter Verwendung von verschiedenen Verhältnissen von Transfektionsreagenz: DNA (im Bereich von 1 ug DNA: 1,5-6 ul Reagenz). Dies kann unter Verwendung von 2 ml Kulturen in einer 6-Well-Platte und die Ausgabe durch Immunoblotting gemessen erfolgen. Dabei 12 h Zeitpunkte zeigen, wenn das Protein exprimiert wird und schnell abgebaut; überprüfen Sie das Zelllysat, wenn Protein nicht in der überstehenden Fraktion beobachtet. Fehlgefaltete Proteine, die sezerniert werden scheitern, wird noch sichtbar in dem Zelllysat durch Immunoblotting sein.
Wenn Ni-NTA Retentions niedrig ist, dh, bleibt Protein in Durchfluss nach Spalte Bindung, verwenden Sie frisches Harz. Steigendem pH von Proben bis 8,5 wird in eine stärkere Bindung zu dem Harz führen, obwohl dies erhöht auch nicht-spezifischen Bindung. Konzentrieren der Probe und Batch-Bindung an Harz O / N bei 4 ° C sein,Vorder Ni-NTA-Reinigung kann in ~ 5x Erhöhung gewonnenen Proteins führen. Wenn der 6His-Tag ist der Zugriff aufgrund der Tertiärstruktur des Proteins, versuchen Klonierung anderer Terminus. Alternativ können Sie auch Cobalt-Harz, das eine höhere Affinität für His-Reste besitzt.
Wenn die Proteinaggregate und / oder Ausfällungen während der Reinigung, die Löslichkeit erhöhen, durch Zugabe von 10% Glycerin in die Ni-NTA Wasch- und Elutionspuffer. Laufen die Nickel-Affinitätssäulen bei RT anstelle von 4 ° C. Verwenden Differentialscanningkalorimetrie Fluorimetrie 12 für pH und Salz / Additive, die Stabilität des Proteins in der Lösung zu erhöhen screenen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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