Introduction
Compreender a estrutura da proteína em nível atômico é a chave para desvendar a base molecular das vias biológicas e as doenças. Cristalografia de raios X da proteína é o método mais amplamente utilizado / aplicável para a determinação de estruturas macromoleculares. O principal desafio deste método é a obtenção de quantidades suficientes de devidamente dobradas, proteína pura. Isto torna-se um problema particular quando se trabalha com as proteínas secretadas de mamíferos, que sofrem modificações pós-tradução específicos.
Proteínas expressas em bactérias, são a fonte primária das proteínas cristalizadas depositadas no Protein Data Bank 1. Os sistemas de expressão bacterianos são largamente preferidos porque são rápidos, baratos e geralmente produzem rendimentos elevados de proteína. No entanto, os domínios extracelulares de proteínas de mamífero expressas em bactérias muitas vezes não são correctamente dobrado, em que são necessárias caso de redobragem e purificação extensa passos para a obtenção de forma homogénea folded proteína. Além disso, muitas proteínas de mamíferos necessitam de glicosilação pós-tradução para atingir a dobragem correcta 2. Embora a expressão e a glicosilação em células de levedura ou de insecto pode ultrapassar o problema de dobragem, modificações pós-traducionais, incluindo a glicosilação, são significativamente diferentes das células de mamífero de 3, obtendo-se as proteínas com alterações incorrectos ou não-homogéneas.
As células de mamífero expressam toda a maquinaria molecular necessário para assegurar modificações pós-traducionais apropriadas e dobragem; No entanto, esses sistemas de expressão não são tipicamente preferido pela maioria dos laboratórios, devido a rendimentos limitados e os elevados custos de reagentes e materiais de consumo. A polietilenoimina (PEI), um reagente de transfecção padrão é relativamente barato, mas impõe citotoxicidade considerável e baixa eficiência de transfecção, o que resulta em aumento de custos em meio celular, ADN, e equipamentos de cultura. Muitas alternativas para PEI são proibitivamente caras. Abordamosestes problemas, descrevendo uma combinação de melhoria das ferramentas de cultura de células e quimicamente modificados de PEI para o método rápido e relativamente barato para a expressão de proteínas de mamífero secretada, seguido por purificação de um só passo. Este método dá rendimentos robusta suficientes para estudos funcionais e bioquímicos 4, e, em alguns casos, resulta em proteína passível de cristalização sem purificação adicional.
Este protocolo descreve várias técnicas para maximizar a expressão e para produzir as proteínas segregadas em mamíferos humano de rim embrionário (HEK 293F) células crescidas em suspensão. Eficiência de transfecção (e custo), a produção e purificação de proteínas são todos bastante reforçada, seguindo este protocolo. PEI modificada pela adição de carbamatos por meio de uma reacção de abertura do anel de um único passo (PEI-TMC-25, síntese e propriedades descritas em detalhe na ref 5) melhora a eficiência da transfecção, reduz a citotoxicidade de catiónicoda ruptura da membrana e, consequentemente, reduz os custos da experiência. Além disso, a viabilidade das células e expressão de proteínas são grandemente melhorada com a adição de suplementos de cultura para fornecimento de glucose e vitaminas. É importante para a produção de proteínas glicosiladas, o tratamento com kifunensine, um inibidor químico não-tóxico de manosidase I, produz proteínas com definidas, glicanos imaturos, que podem ser removidos pelo EndoHf endoglicosidase para produzir proteínas com um único N-acetilglucosamina em lugar de um de comprimento completo 6 glicano N-ligado. Finalmente, a secreção de proteínas em, num meio quimicamente definido isento de soro permite a purificação rápida e fácil para estudos estruturais e bioquímicos. Um único passo de níquel-ácido nitriloacético (Ni-NTA) purificação resina remove a maioria das espécies contaminantes no sobrenadante e, em alguns casos, pode originar proteínas com uma pureza suficiente para a cristalização.
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Protocol
1. Produção de miligramas As quantidades de DNA de plasmídeo para a transfecção transitória em grande escala
- Clone da proteína de interesse em um número elevado de cópias de mamífero vector de expressão de clonagem utilizando local de restrição, ou outra técnica adequada.
- Para melhores resultados, use pHLsec 7 vetor, que tem um built-in 6His-tag C-terminal, uma seqüência Kozak promotor forte e um sinal de secreção otimizado.
- Transformar o plasmídeo para células competentes.
- Adicionar 20 ul de células competentes de E. coli em 1 ug de ADN plasmídeo e incubar em gelo durante 30 min.
- Células de choque térmico a 42 ° C durante 35 seg, depois incubar em gelo durante 2 min.
- Adicionar 300 ul de meio de crescimento microbiano (SOC) e incubar a 37 ° C durante 45 min, agitando a 220 rpm.
- Células da placa na placa de agar com selecção antibiótico apropriado.
- Use 100 ug / ml de carbenicilina se o plasmídeo é no vector pHLsec.
- Colónias da cultura em 250 ml de Caldo de Luria (LB) suplementado com meios 100 ug / ml de antibiótico (carbenicilina) O / N a 37 ° C, agitação a 220 rpm.
- Purificar o DNA de cultura utilizando Kit Hi-Speed Plasmid Maxi acordo com o protocolo do fabricante.
- Elui-se o ADN em tampão de EB (Tris 10 mM-Cl, pH 8,5), em vez de tampão TE.
- Alíquota do plasmídeo purificado a quantidade necessária para a transfecção e armazenar a -20 ° C.
2. grande escala Cultura e Transient transfecção de células 293F
- Suplemento de meio 1 L 293F com 10 ml de glutamina e 5 mL de Pen / Strep (ambos 100x). Armazenar a 4 ° C. 5 mL de Pen / Strep é uma força suficiente em condições isentas de soro e a concentração de antibiótico reduzida melhora a viabilidade das células durante a transfecção, o que melhora o rendimento de proteína.
- Cultura células 293F em 300 ml de mídia em 1 L de policarbonato perplexo Erlenmeyers com tampa ventiladas a 37 ° C com 8% de CO2, enquanto agitação num incubador de cultura de tecido padrão.
- Dilui-se as células a 5 x 10 5 / ml de densidade um dia antes da transfecção.
- No dia da transfecção, suplemento de meio de cultura, adicionando 10% de volume de 2% w / v de impulso celular em meios 293F.
- Medir a concentração de glicose utilizando um monitor de glucose de acordo com as instruções do fabricante e suplementos uso como necessário para alcançar uma concentração de glucose de 500 mg / dL.
- Adicionar kifunensine (1 ug / ml de concentração final) nesta etapa de controlar a glicosilação de proteínas.
- Calcular o volume de ADN necessária para 1 ug de plasmídeo por 1 x 10 6 células. Sob condições estéreis, dilui-se ADN em meio isento de soro de 5 ml.
- Calcular o volume de reagente de transfecção necessária para 1 ug de plasmídeo por 2 mL de reagente de transfecção. Sob condições estéreis, dilui-se o reagente de transfecção (PEI-TMC-25) em meio isento de soro de 5 ml.
- Adicionaro reagente de transfecção de ADN em solução em incrementos de 1 ml, misturando suavemente. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente para os complexos ADN-reagente para formar. Em seguida, adicione a solução sobre as células de um modo gota a gota.
- Permitir que as células transfectadas para expressar a proteína de 72-96 horas. Suplemento com ~ 10% de aumento do volume celular de mídia diariamente, ou como necessário para manter a glicose lendo 400-600 mg / dl.
3. Purificação
- Decantar a cultura para um frasco de centrífuga, centrífuga durante 20 min a 1300 xg para sedimentar as células e em seguida, recolher o sobrenadante. Se necessário, girar uma segunda vez e / ou usar filtro de 0,22 um para clarificar o sobrenadante.
- Adicionar 10% de tampão de ligação 10 x o volume de Ni-NTA (1,5 M de NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0,1 M de Tris pH 8,5, imidazole 50 mM).
- Prepara-se uma coluna de gravidade através da adição de 2 ml de suspensão de Ni-NTA de uma coluna e equilibrando com 10 volumes de coluna (CV) de tampão de ligação 1x. Se possível, fazer todos os passos de coluna em uma sala de 4 ° C. Alternatively, proteína frio e todos os buffers em gelo antes do passo da coluna e manter a proteína e recolhidos flow-through em gelo.
Nota: suspensão de Ni-NTA é resina de 50% em volume e capacidade de ligação do dito fabrico é de 50 mg / ml. Pérolas de Ni-NTA pode ser re-carregada para usos múltiplos - Fluir o sobrenadante sobre a resina e recolher flow-through. Repita este passo.
- Lava-se com 10 VC de tampão de lavagem (300 mM NaCl, 50 mM de K 2 HPO 4, 20 mM de imidazol, pH 8).
- Eluir a proteína em 5 VC de tampão de eluição (NaCl 300 mM, 50 mM de K 2 HPO 4, imidazole 250 mM, pH 8).
- Se deglycosylation é necessário:
- Para um volume final de 0,5 ml, concentrado eluato para 0,43 ml, utilizando um concentrador de centrifugao. Se se formam precipitados, sedimentar quaisquer detritos por centrifugação a 16.000 xg e 4 ° C.
- Adicionar 50 ul de 500 mM de Na-citrato, pH 5,5.
- Adicionar 20 ul de EndoHf (1 x 10 6 U / mL). Incubar à temperatura ambiente durante 2 h.
NãoE: A enzima funciona optimamente a 37 ° C, o que pode fazer com que a proteína concentrada para se agregar. Estender a incubação à temperatura ambiente, se desglicosilação, avaliada por SDS-PAGE ou imunotransferência, é incompleta. A enzima não tem actividade a 4 ° C. - Para remover EndoHf: Lavar 3x resina de amilose em tampão fosfato salino (PBS), ou tampão de armazenamento final. Incubar proteína com a resina durante 1 hora a 4 ° C. Gire 5 min a 1000 xg para sedimentar pérolas e recolher o sobrenadante.
- Concentrado de proteína utilizando filtro molecular apropriado centrifugação corte de peso e troca de tampão para tampão de armazenamento (150 mM de NaCl e 20 mM de HEPES pH 7,5).
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Representative Results
Aqui a seguir os resultados deste sistema de expressão aplicada a um domínio segregado 13 kDa imunoglobulina (Ig) a partir da proteína do receptor humano provocando expresso em células mielóides (2 hTREM2, resíduos 19-132). Trem2 é uma proteína transmembranar do tipo I contendo um único domínio Ig extracelular que tem duas ligações de dissulfureto e dois locais de glicosilação N-ligados. Ao contrário de muitas outras proteínas de domínio Ig 8, trem2 não era passível de redobramento de corpos de inclusão bacterianos 9. Mutagénese subsequente confirmou glicanos N-ligados são necessários para a expressão e a dobragem correcta. Para facilitar os estudos estruturais e funcionais, trem2 foi introduzido no vector pHLsec com um 6His-Tag de terminal-C 7 utilizando técnicas padrão de biologia molecular. A expressão transitória em células tratadas com kifunensine HEK293F produziu proteína que foi purificado por cromatografia de Ni-NTA (Figura 1B, pista 2) e, em seguida, a amostra foi desglicosilada para produzir Natipectivamente dobradas, proteína homogénea (Figura 1B, pista 3). 293F expressão de trem2 produziu 5-10 mg / l (5-10μg / milhão de células transfectadas). Após a troca de tampão para o tampão de armazenamento, esta proteína foi cristalizado (Figura 1C). Apesar da pureza final de cerca de 80%, estes cristais reproduzido de forma fiável, difractada, e foram exibidas por prata-mancha para conter apenas a proteína trem2 (Figura 1D). Esta observação sugere que a homogeneidade bioquímica da proteína (isto é, dobragem e modificações pós-traducionais) pode, em alguns casos, ser mais crítico do que a pureza global para o sucesso cristalização.
Além de cristalização, este sistema oferece uma ferramenta robusta para estudos estruturais e funcionais. Explora-se para produzir a proteína nativa e glicosilada atingir> 95% de pureza por cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 1E, F). Este passo de purificação adicional, a qual mostra o solution comportamento da proteína, é também uma maneira ideal para monitorar a qualidade da proteína. A proteína purificada deve eluir com um volume que corresponde ao seu peso molecular e devem ser as espécies mais abundantes na amostra. Anormalmente grandes quantidades de proteína agregada pode indicar proteína instável e fornecer pistas para otimizar a produção e purificação de proteínas. Além disso, esta proteína purificada final é superior para uso em experiências quantitativas biofísicos tais como espectroscopia de dicroismo circular, a estabilidade térmica, e investigando interacções proteína-ligando. Finalmente, o controlo da extensão da glicosilação proporciona uma ferramenta robusta para estudar as funções dependentes de glicano.
Figura 1. Sistema de expressão de mamífero: (A) Esquema de mamíferos para a expressão de proteínas com glicosilação controlada ou nativo em células HEK 293F. ( B) SDS-PAGE de NiNTA-purificado hTREM2 expresso sob kifunensine mostrado antes (pista 2) e após (pista 3) desglicosilação com EndoHf. (C) Os cristais produzidos a partir de proteína purificada e NiNTA-desglicosilada. (D) mancha de prata de cristalização de entrada (pista 1) e cristais recolhidos (pistas 2 e 3), revela cristais contêm apenas trem2. (E) A purificação adicional de trem2 foi realizada utilizando cromatografia de exclusão de tamanho de trem2 NiNTA-purificado produzido em células sem Kifunensine 293F. Asteriscos (*) indicam os volumes de eluição dos padrões de peso molecular. As proteínas eluídas em TBS usando uma coluna analítica S200 (GE). (F) a análise de SDS-PAGE de tamanho trem2 Purificou-exclusão: proteína de entrada (pista 2) e pico dobrado (pista 3). Note-se como, glicanos heterogêneos executados em um peso molecular aparente superior com uma ampla mancha por SDS-PAGE completo.nk "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Células HEK 293F oferecer a produção de proteínas que requerem robusta modificações pós-traducionais. Este sistema permite a expressão rápida e escalável de proteínas nativamente dobradas contendo persulfuretos, glicosilação e fosforilação que seriam ausente usando mais ferramentas de expressão de rotina. Além disso, este sistema pode ser usado para a expressão e purificação de complexos de multi-proteínas simplesmente por co-transfecção de plasmídeos múltiplos. Além trem2, este sistema tem sido extensivamente utilizado para os estudos funcionais com outras proteínas de interesse no laboratório 10,11. As células de mamíferos também oferecem livre de endotoxina proteína expressão ideal para experimentos in vivo ou para a produção de antígenos nativamente dobradas para gerar anticorpos dependente da conformação.
Condições de viabilidade celular e de transfecção óptimas são os mais importantes para a produção de proteínas eficiente. Para uma melhor viabilidade celular, culturas de células de baixa passagem são impulsionadoscom suplementos de cultura celular e a concentração do antibiótico no meio de crescimento é reduzida. A modificado PEI-TMC-25 tem eficiência transection adequado com a maioria das proteínas; no entanto, existem outras opções disponíveis a preço moderado que oferecem maior eficiência de transfecção e reduziu a citotoxicidade. 5 Hype (Oz Bioscience) aumenta o rendimento em comparação com PEI ou de outros reagentes, a um custo consideravelmente reduzida em comparação com os reagentes de transfecção mais caros, tais como 293fectin. O tipo de reagente e ADN: proporções de reagentes pode ser optimizado para expressões individuais e as necessidades da experiência desejado.
O método aqui descrito tem várias vantagens sobre outros métodos de produção de proteínas. As células de mamíferos oferecem dobragem chaperona nativa e modificações pós-traducionais indisponíveis para bactérias e leveduras. O tempo reduzido para a construção dos plasmídeos e preparação, ao longo da utilização dos meios de comunicação, o pH do qual pode ser directamente modificada, fazer com que seja superior a baculovirprodução baseada nos Estados Unidos em células de inseto; e finalmente, o meio isento de soro oferece escalamento fácil (maior densidade das células) e a purificação não atingível para células 293T aderentes. O chefe limitação deste sistema é apenas o tempo e dimensionar o pesquisador indivíduo é capaz de comprometer-se a expressão da proteína.
Incluído abaixo são opções para a solução dos problemas mais comuns encontrados.
Solução de problemas
Se há expressão baixa proteína, evitar passaging 293F células com mais de 2-3 meses. Passaging resultados prolongados na saúde celular diminuiu refletido em tempos mais lentos duplicação e reduziu significativamente a expressão da proteína. O crescimento celular deve ser monitorizado diariamente e as culturas não duplicação diária deve ser descartado. A viabilidade celular pode ser melhorada pela utilização de suplementos de cultura enquanto passaging células. Monitor de glicose para garantir uma concentração cultura de 400-600 mg / dl densidade celular não deve exceder 2 milhões / ml ea viabilidade celular deve ser ≥98% por exclusão com azul de tripano. Diluir as células densas para 0,5 milhões / ml e deixa-se dobrar O / N antes da transfecção. Optimizar a transfecção utilizando diferentes razões de reagente de transfecção: ADN (dentro da gama de 1 ug de ADN: 1,5-6 ul de reagente). Isto pode ser feito usando 2 ml de culturas em uma placa de 6 poços e a saída, medido por imunotransferência. Fazendo 12 pontos de tempo RH pode indicar se a proteína está a ser expresso e degradados rapidamente; verificar se o lisado celular a proteína não é observada na fracção sobrenadante. Proteínas deformadas, as quais deixam de ser segregada, ainda será aparente no ligado celular por imunotransferência.
Se a retenção de Ni-NTA é baixa, ou seja, a proteína permanece em flow-through após vinculativo coluna, utilize resina fresca. O aumento do pH da amostra para 8,5 vai resultar numa maior ligação à resina, embora isto também aumentará a ligação não específica. Concentrando-se a amostra do lote e a ligação a resina O / N a 4 ° C sejatona de Ni-NTA a purificação pode resultar em aumento ~ 5x em proteína recuperada. Se a marcação 6His é inacessível devido à estrutura terciária da proteína, tentar clonar no outro terminal. Como alternativa, use resina Cobalt, que tem uma maior afinidade para seus resíduos.
Se os agregados de proteína e / ou precipita durante a purificação, aumentar a solubilidade por adição de 10% de glicerol para a Ni-NTA lavar e tampões de eluição. Executar as colunas de afinidade de níquel à RT, em vez de 4 ° C. Use fluorimetria diferencial de varrimento 12 para a tela para pH e sal / aditivos que aumentam a estabilidade da proteína em solução.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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