Introduction
Comprendre la structure des protéines à un niveau atomique est clé pour découvrir la base moléculaire des voies biologiques et de maladies. X-ray cristallographie des protéines est la méthode la plus largement utilisée / applicable pour la détermination des structures macromoléculaires. Le principal défi de cette méthode est d'obtenir des quantités suffisantes de bien plié, protéine pure. Cela devient un problème particulier lorsque l'on travaille avec des protéines sécrétées mammifères, qui subissent des modifications post-traductionnelles spécifiques.
Protéines bactérienne exprimées sont la principale source de protéines cristallisées déposés dans la Protein Data Bank 1. Des systèmes d'expression bactériens sont largement préférés parce qu'ils sont rapides, peu coûteux et généralement produire des rendements élevés de protéine. Cependant, domaines extracellulaires des protéines de mammifère exprimées dans des bactéries sont souvent pas correctement repliés, dans ce cas, repliement et purification extensive étapes sont nécessaires pour obtenir de façon homogène foLDED protéines. En outre, de nombreuses protéines de mammifères exigent glycosylation post-traductionnelle pour atteindre un repliement approprié 2. Bien que l'expression et la glycosylation dans les cellules de levure ou d'insectes peuvent surmonter le problème de pliage, modifications post-traductionnelles, y compris la glycosylation, diffèrent considérablement de celles des cellules de mammifères 3, produisant des protéines avec des modifications incorrectes ou non-homogènes.
Les cellules de mammifères expriment toute la machinerie moléculaire nécessaire pour assurer modifications et pliage de post-traductionnelle appropriés; Toutefois, ces systèmes d'expression ne sont pas généralement préféré par la plupart des laboratoires, en raison de rendements limités et des coûts élevés de réactifs et de consommables. Polyéthylèneimine (PEI), un réactif de transfection norme est relativement pas cher mais impose cytotoxicité considérable et une faible efficacité de transfection, résultant en une augmentation des coûts dans les médias de la cellule, l'ADN, et de l'équipement en culture. Beaucoup de solutions de rechange aux PEI sont prohibitifs. Nous nous adressonsces questions en décrivant une combinaison de l'amélioration des outils de culture cellulaire et chimiquement modifiée PEI pour la méthode rapide et relativement peu coûteux pour l'expression de protéines de mammifères sécrétées, suivie d'une purification en une seule étape. Ce procédé donne des rendements suffisants robuste pour des études fonctionnelles et biochimiques 4, et dans certains cas, se traduit par une protéine se prêtent à une cristallisation sans autre purification.
Ce protocole décrit plusieurs techniques pour maximiser l'expression et le rendement pour les protéines de mammifères sécrété dans le rein embryonnaire humain (HEK) 293F cellules cultivées en suspension. L'efficacité de transfection (et le coût), la production et la purification de la protéine sont grandement améliorées tout en suivant le protocole. PEI modifié par l'addition de carbamates par réaction d'ouverture de cycle en une seule étape (PEI-TMC-25, synthèse et les propriétés décrites en détail dans la référence 5) améliore grandement l'efficacité de transfection, réduit la cytotoxicité de cationiquerupture de la membrane et par conséquent de réduire les coûts d'expérimentation. En outre, la viabilité des cellules et l'expression des protéines sont grandement améliorées grâce à l'ajout de compléments de culture à fournir du glucose et des vitamines. Il est important pour la production de protéines glycosylées, le traitement par la kifunensine, un inhibiteur chimique non-toxique de la mannosidase I, produit des protéines avec définis glycanes immatures, qui peuvent être éliminés par la EndoHf d'endoglycosidase pour produire des protéines avec un seul N-acétylglucosamine à la place du une pleine longueur glycane 6 N-liée. Enfin, la sécrétion de protéines dans un milieu défini chimiquement sans sérum permet une purification rapide et facile pour les études structurales et biochimiques. Single-step nickel-acide nitrilotriacétique de (Ni-NTA) purification de résine élimine la majorité des espèces contaminantes dans le surnageant et, dans certains cas, peut donner une protéine d'une pureté suffisante pour la cristallisation.
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Protocol
1. production de quantités milligramme d'ADN plasmidique à grande échelle pour la transfection transitoire
- Cloner la protéine d'intérêt dans un certain nombre vecteur d'expression mammifère élevé de copies en utilisant le site de restriction clonage, ou une autre technique appropriée.
- Pour des résultats optimaux, utilisez pHLsec 7 vecteur, qui a un haut-C-terminal 6His-tag, une séquence forte Kozak promoteur et un signal de sécrétion optimisé.
- Transformer le plasmide sur des cellules compétentes.
- Ajouter 20 ul de cellules compétentes de E. coli sur 1 ug d'ADN de plasmide et incuber sur de la glace pendant 30 min.
- Des cellules de choc thermique à 42 ° C pendant 35 sec, puis incuber sur de la glace pendant 2 min.
- Ajouter 300 pi de milieu de croissance microbienne (SOC) et incuber à 37 ° C pendant 45 minutes, en agitant à 220 rpm.
- Les cellules de plaque sur plaque de gélose avec la sélection antibiotique approprié.
- Utilisez 100 pg / ml de carbénicilline si le plasmide est dans le vecteur pHLsec.
- Les colonies de la culture dans 250 ml de bouillon de Luria (LB) additionné de médias 100 ug / antibiotique (carbénicilline) O / N ml à 37 ° C, sous agitation à 220 tours par minute.
- On purifie l'ADN à partir de la culture en utilisant un kit Salut débit Plasmid Maxi selon le protocole du fabricant.
- Eluer ADN dans un tampon EB (10 mM de Tris-Cl, pH 8,5), au lieu de tampon TE.
- Aliquoter le plasmide purifié au montant nécessaire pour la transfection et conserver à -20 ° C.
2. grande échelle Culture et transfection transitoire de cellules 293F
- Supplément médias 1 L 293F avec 10 ml de glutamine et 5 ml Pen / Strep (deux 100x). Conserver à 4 ° C. 5 ml Pen / Strep est une résistance suffisante dans des conditions sans sérum et la concentration en antibiotique réduite améliore la viabilité des cellules au cours de la transfection, ce qui améliore les rendements en protéines.
- Culture cellules 293F dans 300 ml médias dans 1 L polycarbonate déconcertés flacons Erlenmeyer avec bouchon à évents à 37 ° C avec 8% de CO2, sous agitation dans un incubateur de culture de tissu standard.
- Diluer les cellules à 5 x 10 5 / ml densité une veille de la transfection.
- Le jour de la transfection, le milieu de culture par addition de supplément de volume de 10% à 2% en poids / volume dans 293F cellulaire Boost médias.
- Mesurer la concentration de glucose en utilisant un moniteur de glucose selon les instructions du fabricant et les suppléments d'utilisation selon les besoins pour obtenir une concentration en glucose de 500 mg / dL.
- Ajouter kifunensine (1 pg / ml de concentration finale) à cette étape pour contrôler la glycosylation des protéines.
- Calculer le volume de l'ADN requis pour une pg de plasmide pour 1 x 10 6 cellules. Dans des conditions stériles, diluer l'ADN dans un milieu exempt de sérum de 5 ml.
- Calculer le volume de réactif de transfection requis pour une pg de plasmide par 2 ul de réactif de transfection. Dans des conditions stériles, diluer le réactif de transfection (PEI-TMC-25) dans du milieu exempt de sérum de 5 ml.
- Ajouterréactif de transfection d'ADN en solution dans 1 ml incréments, en mélangeant doucement. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour les complexes ADN-réactif de se former. Puis ajouter la solution sur les cellules dans un mode goutte à goutte.
- Laisser les cellules transfectées pour exprimer la protéine de 72-96 h. Supplément avec ~ 10% du volume cellulaire Boost médias quotidiens, ou au besoin pour maintenir le glucose lecture 400-600 mg / dl.
3. Purification
- Décanter la culture dans un flacon de centrifugeuse, centrifugeuse pendant 20 min à 1300 x g pour sédimenter les cellules, puis recueillir le surnageant. Si nécessaire, faites tourner une deuxième fois et / ou utiliser le filtre de 0,22 um pour clarifier surnageant.
- Ajouter tampon de liaison de 10% du volume 10x Ni-NTA (1,5 M de NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, Tris 0,1 M pH 8,5 mM imidazole 50).
- Préparer une colonne de gravité par addition de 2 ml de suspension épaisse de Ni-NTA dans une colonne d'équilibrage et avec 10 volumes de colonne (CV) de tampon de liaison 1x. Si possible, faire toutes les étapes de colonne dans une chambre de 4 C °. AlternativEly, la protéine de refroidissement et tous les tampons sur la glace avant l'étape de la colonne, et garder la protéine et recueilli accréditives sur la glace.
Remarque: Ni-NTA suspension est une résine de 50% en volume et de capacité de liaison déclaré de la fabrication est de 50 mg / ml. Ni-NTA beads peuvent être rechargées pour des usages multiples - Écouler le surnageant sur la résine et de recueillir accréditives. Répétez cette étape.
- Laver avec 10 CV de tampon de lavage (300 mM de NaCl, 50 mM de K 2 HPO 4, 20 mM d'imidazole pH 8).
- Eluer la protéine en 5 CV de tampon d'élution (300 mM NaCl, 50 mM de K 2 HPO 4, imidazole 250 mM, pH 8).
- Si déglycosylation est nécessaire:
- Pour un volume final de 0,5 ml, on concentre l'éluat à 0,43 ml en utilisant un concentrateur de centrifugation. Si des précipités se forment, sédimenter les débris par centrifugation à 16.000 xg et 4 ° C.
- Ajouter 50 pi de 500 mM Na-Citrate pH 5,5.
- Ajouter 20 ul de EndoHf (1 x 10 6 U / ml). Incuber à température ambiante pendant 2 h.
ne pase: L'enzyme fonctionne de manière optimale à 37 ° C, ce qui peut provoquer le concentré de protéine agrégée. Prolonger l'incubation RT, si déglycosylation, évaluée par SDS-PAGE ou immunoblotting, est incomplète. L'enzyme n'a pas d'activité à 4 ° C. - Pour supprimer EndoHf: Laver amylose Résine 3x dans un tampon phosphate salin (PBS) ou un tampon de stockage final. Incuber protéines avec de la résine pendant 1 h à 4 ° C. Spin 5 min à 1000 x g pour sédimenter perles et de recueillir le surnageant.
- Concentrez-protéine en utilisant un filtre approprié de centrifugation poids de coupure moléculaire et échange de tampon dans le tampon de stockage (NaCl 150 mM et HEPES 20 mM pH 7,5).
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Representative Results
Ici suit les résultats de ce système d'expression appliquée à une immunoglobuline sécrétée 13 kDa (Ig) le domaine de récepteur de protéine humaine exprimée de déclenchement sur les cellules myéloïdes (2, résidus 19-132 hTREM2). TREM2 est une protéine transmembranaire de type I contenant un seul domaine de type Ig extracellulaire qui dispose de deux ponts disulfure et deux sites de glycosylation N-liés. Contrairement à de nombreux autres domaines Ig protéines 8, TREM2 ne se prêtaient pas à repliement des corps d'inclusion bactériens 9. Après mutagenèse N-glycanes confirmés sont tenus d'expression et de repliement. Pour faciliter les études structurales et fonctionnelles, TREM2 a été introduit dans le vecteur pHLsec avec un 6His-tag C-terminal 7 en utilisant des techniques classiques de biologie moléculaire. L'expression transitoire dans des cellules traitées avec la kifunensine HEK293F a abouti à une protéine qui a été purifié par Chromatographie Ni-NTA (Figure 1B, piste 2) et l'échantillon a ensuite été déglycosylée pour produire natiVely plié, la protéine homogène (figure 1B, ligne 3). 293F expression de TREM2 produit 5-10 mg / L (5-10μg / millions de cellules transfectées). Après l'échange de tampon dans le tampon de stockage, cette protéine a été cristallisé (figure 1C). En dépit de la pureté finale d'environ 80%, de manière fiable ces cristaux de reproduction, diffractée, et ont été montrés par coloration à l'argent-protéine TREM2 contenir seulement (figure 1D). Cette observation suggère l'homogénéité biochimique de la protéine (par exemple, de pliage et de modifications post-traductionnelles) peuvent, dans certains cas, être plus critique que la pureté globale pour le succès de cristallisation.
En plus de la cristallisation, ce système offre un outil solide pour des études structurales et fonctionnelles. Elle est exploitée pour produire une protéine glycosylée native et atteindre> 95% de pureté par Chromatographie par exclusion de taille (figure 1E, F). Cette étape de purification supplémentaire, qui montre la solution comportement de la protéine, est également un moyen idéal pour surveiller la qualité de la protéine. La protéine purifiée doit éluer à un volume correspondant à son poids moléculaire et devraient être les espèces les plus abondantes dans l'échantillon. Anormalement grandes quantités de protéines agrégées peuvent indiquer protéines instables et fournir des indices pour optimiser la production et purification de protéines. En outre, cette protéine purifiée finale est supérieure pour une utilisation dans des expériences quantitatives biophysiques telles que la spectroscopie de dichroïsme circulaire, la stabilité thermique, et l'enquête interactions protéine-ligand. Enfin, le contrôle de l'étendue de la glycosylation fournit un outil robuste pour étudier les fonctions de glycanes-dépendante.
Figure 1. Système d'expression mammalien: (A) Schéma d'expression mammalien de protéines avec la glycosylation contrôlée ou natif dans les cellules HEK 293F. ( B) SDS-PAGE de NiNTA-hTREM2 purifiée exprimée sous kifunensine montré avant (piste 2) et après (ligne 3) déglycosylation avec EndoHf. (C) des cristaux obtenus à partir des protéines purifiées et NiNTA-déglycosylée. (D) Argent tache de l'entrée de cristallisation (voie 1) et des cristaux récoltés (voies 2 et 3) révèle des cristaux ne contiennent que TREM2. (E) purification supplémentaire de TREM2 été réalisée en utilisant une Chromatographie d'exclusion de taille de TREM2 NiNTA purifiée produite dans les cellules 293F sans kifunensine. Les astérisques (*) indiquent des volumes d'élution de standards de poids moléculaire. Protéines élues dans SCT en utilisant une colonne S200 analytique (GE). (F) Analyse SDS-PAGE de taille exclusion purifié TREM2: protéine d'entrée (piste 2) et de pointe repliée (piste 3). Notez comment, glycanes hétérogènes fonctionnent à un poids moléculaire apparent supérieur avec un large frottis par SDS-PAGE complète.nk "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cellules HEK 293F offrent une forte production de protéines nécessitant modifications post-traductionnelles. Ce système permet l'expression rapide et évolutive des protéines pliées contenant nativement disulfures, la glycosylation, la phosphorylation et qui, autrement, être absent en utilisant plus d'outils d'expression de routine. En outre, ce système peut être utilisé pour l'expression et la purification de complexes multi-protéines simplement par co-transfection de plusieurs plasmides. Outre TREM2, ce système a été largement utilisé pour des études fonctionnelles avec d'autres protéines d'intérêt dans le laboratoire 10,11. Les cellules de mammifères offrent également sans endotoxine protéique optimal d'expression pour des expériences in vivo ou pour la production d'antigènes nativement croisés pour générer des anticorps conformation-dépendant.
Conditions de viabilité cellulaire et transfection optimales sont les plus importantes pour la production efficace de protéines. Pour une meilleure viabilité des cellules, des cultures de cellules à faible passage sont amplifiéesavec des compléments de culture de cellules et la concentration en antibiotique dans le milieu de croissance est réduite. Le PEI-TMC-25 modifié a une efficacité de transection adapté à la plupart des protéines; Cependant, il ya d'autres options disponibles à prix modéré qui offrent une efficacité accrue de la transfection et la cytotoxicité réduite. Hype 5 (Oz Bioscience) augmente les rendements par rapport à l'Île ou d'autres réactifs, à un coût considérablement réduit par rapport aux réactifs de transfection plus chers, tels que 293fectin. Le type de réactif et de l'ADN: ratios réactifs peuvent être optimisés pour les expressions individuelles et les besoins de l'expérience souhaitée.
Le procédé décrit ici a plusieurs avantages sur d'autres méthodes de production de protéines. Les cellules de mammifères offrent pliage chaperon natif et modifications post-traductionnelles indisponible pour les bactéries et les levures. Le temps réduit pour la construction du plasmide et la préparation, ainsi que l'utilisation des médias, dont le pH peut être modifiée directement, rendre supérieure à baculovirla production aux États-Unis dans les cellules d'insectes; et enfin, le milieu sans sérum propose échelle facile (densité cellulaire plus élevée) et la purification ne peut être atteinte à des cellules 293T adhérentes. La principale limite de ce système est que le temps et l'échelle du chercheur individuel est capable de commettre à l'expression de la protéine.
Inclus ci-dessous sont des options dépannage pour les problèmes les plus courants rencontrés.
Dépannage
Si il est faible expression de protéines, d'éviter repiquage 293F cellules de plus de 2-3 mois. Résultats de passages prolongés dans la santé des cellules diminué reflétées dans plus lents temps de doublement et réduit de façon significative l'expression des protéines. La croissance cellulaire doit être contrôlée quotidiennement et cultures plus doublement par jour doit être jeté. La viabilité des cellules peut être amélioré par l'utilisation de suppléments de culture tout en passage de cellules. Surveiller le glucose pour assurer une concentration de culture de 400-600 mg / dl densité cellulaire ne devrait pas dépasser 2 millions / ml etla viabilité des cellules doit être ≥98% par exclusion au bleu trypan. Diluer cellules denses à 0,5 million / ml et laisser doubler O / N avant la transfection. Optimiser la transfection en utilisant différents rapports de réactif de transfection d'ADN: (dans la plage de 1 ug d'ADN: réactif de 1,5 à 6 pi). Cela peut être fait en utilisant 2 ml de cultures dans une plaque à 6 puits et la sortie mesurée par immunotransfert. Faire 12 points dans le temps des ressources humaines peuvent indiquer si la protéine est exprimée et rapidement dégradée; vérifier le lysat cellulaire si la protéine est pas observée dans la fraction de surnageant. Protéines mal repliées, qui ne parviennent pas à être sécrétée, seront toujours apparente dans le lysat cellulaire par immunotransfert.
Si la rétention Ni-NTA est faible, à savoir, la protéine reste dans accréditives après liaison colonne, utilisez résine fraîche. L'augmentation de pH de l'échantillon à 8,5 entraîne une liaison plus forte à la résine, bien que cela permettra également d'augmenter la liaison non spécifique. La concentration de l'échantillon et le lot de liaison à la résine O / N à 4 ° C soitavant purification Ni-NTA peut résulter en augmentation 5x ~ en protéine récupérée. Si le 6His-tag est inaccessible en raison de la structure tertiaire de la protéine, essayez de clonage sur l'autre extrémité. En variante, utiliser une résine de Cobalt, qui présente une affinité plus élevée pour les résidus His.
Si les agrégats de protéines et / ou des précipités lors de la purification, augmenter la solubilité en ajoutant 10% de glycerol dans du Ni-NTA laver et des tampons d'élution. Exécutez les colonnes d'affinité de nickel à température ambiante au lieu de 4 ° C. Utilisation balayage différentiel fluorimétrie 12 pour le dépistage de pH et de sel / additifs qui augmentent la stabilité de la protéine en solution.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
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