Introduction
Atomik düzeyde protein yapısını anlamak biyolojik yollar ve hastalıkların moleküler temelini açığa çıkarmak için bir anahtardır. X-ışını protein kristalografisi makromoleküler yapıları belirlemek için en yaygın olarak kullanılan / uygulanabilir bir yöntemdir. Bu yöntemin en önemli sorun uygun bir şekilde katlanmış, saf protein yeterli miktarda elde edilmesidir. Bu durum, özellikle, belirli post-translasyonel modifikasyonlar maruz salgılanan memeli proteinlerinin birlikte çalışan bir sorun haline gelir.
Bakteriyel-ifade proteinler Protein Bilgi Bankası 1 yatırılır kristalize proteinlerin başlıca kaynağıdır. Bunların pahalı olmayan, hızlı ve tipik olarak proteinin yüksek verimlerinin üretilmesi için bakteriyel ekspresyon sistemleri büyük ölçüde tercih edilmektedir. Bununla birlikte, bakteriler içinde ifade edilen memeli proteinlerinin hücre dışı alanları genellikle düzgün fo homojen elde edilmesi için, bu durumda katlama ve kapsamlı saflaştırma adımları gereklidir katlanmış edilmezlded proteini. Ayrıca, birçok memeli proteinleri düzgün katlanmasına 2 elde etmek için post-translasyonel glikozilasyon gerektirir. Maya ya da böcek hücrelerinde ekspresyonu ve glikosilasyon katlama sorunun üstesinden de, glikosilasyon içeren post-translasyonel modifikasyonlar, yanlış ya da homojen olmayan modifikasyonlara sahip proteinlerin, sonuçta memeli hücreleri 3 kişilerce önemli ölçüde farklıdır.
Memeli hücreleri, uygun post-translasyonel modifikasyonları ve katlama sağlamak için gereken tüm moleküler yapıların ifade ederler; Bununla birlikte, bu ifade sistemleri tipik olarak, sınırlı miktarlarda ve reaktifler ve sarf maliyetlerinin yüksek, en çok laboratuarlar tarafından tercih edilmemektedir. Polietilenimin (PEI), standart transfeksiyon reaktifi nispeten ucuz ama önemli bir sitotoksisite ve düşük transfeksiyon verimi, hücre ortamı, DNA artan maliyeti ile sonuçlanır ve ekipman kültürlenmesi getirir. PEI Birçok alternatifler pahalıya bulunmaktadır. Biz elegeliştirilmiş hücre kültürü bir araç kombinasyonu tanımlama ve kimyasal olarak tek aşamalı saflaştırma ile salgılanan bir memeli proteinlerinin ifadesi için hızlı ve nispeten pahalı olmayan yöntemi için değiştirilmiş PEI, bu sorunlar. Bu sağlam bir yöntem, fonksiyonel ve biyokimyasal çalışmalar 4 için yeterli verim sağlar ve bazı durumlarda, daha fazla arıtılmadan kristalleştirme için uygun bir protein ile sonuçlanır.
Bu protokol ekspresyonunu maksimize etmek ve süspansiyon içinde yetiştirilmiş insan embriyonik böbrek (HEK) 'de salgılanmış proteinleri memeli hücreleri için 293F elde etmek için çeşitli teknikler tarif eder. Transfeksiyon verimliliği (ve maliyet), protein üretimi ve saflaştırılması tüm büyük ölçüde bu protokolü takip ederek geliştirilmiştir. Tek basamaklı halka açma reaksiyonu yoluyla karbamatlar eklenmesiyle tadil PEI (PEI-TMC-25, ref 5 ayrıntılı olarak tarif edilen sentez ve özellikleri) büyük ölçüde, transfeksiyon verimi iyileştirir katyonik gelen sitotoksisitesini azaltırbuna göre membran bozulması ve deney maliyetlerini azaltır. Bundan başka, hücre canlılığı ve protein ifadesi büyük ölçüde glukoz ve vitamin temin etmek için kültür takviyelerinin eklenmesiyle geliştirilmektedir. Önemli kifunensine ile glikosile proteinlerin, tedavi üretimi için, Manosidaz I'in bir toksik olmayan kimyasal inhibitörü yerine tek bir N-asetilglukosamin proteinleri üretmek üzere endoglikosidaz EndoHf çıkarılabilir tanımlanan, olgunlaşmamış glikanlar ile proteinler üretir Tam uzunlukta bir glikanın 6 N-bağlantılı. Son olarak, serumsuz, kimyasal olarak tanımlanmış ortam içine proteinleri salgılanmaktadır yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için, hızlı ve kolay saflaştırılmasını sağlar. Tek aşamalı nikel nitrilotriasetik asit (Ni-NTA) reçinesi saflaştırma, bazı durumlarda, kristalizasyon için yeterli saflıkta bir proteini elde edilebilir, üstte kalan sıvı türlerin kirletici ve çoğunu çıkarır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Büyük ölçekli geçici Transfeksiyonu için Plazmid DNA Miligram metrajlarının 1. Üretim
- Kısıtlama alanı klonlama ya da diğer uygun teknik kullanılarak yüksek bir kopya sayısı memeli ifade vektörüne ilgili proteini klonlama.
- En iyi sonuçlar için, sahip pHLsec 7 vektörü, kullanmak yerleşik C-terminal 6His-etiketi, güçlü bir promotör Kozak dizisi ve optimize salgılama sinyali.
- Yetkili hücreleri üzerine plazmid Transform.
- Plazmid DNA 1 ug üzerine E. coli hücreleri 20 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- 42 ° C'de ısı şoku hücreler 35 sn için, daha sonra 2 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkalayın.
- Mikrobiyal büyüme ortamı (SOC) 300 ul ilave edin ve 220 rpm'de çalkalanarak, 45 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Uygun antibiyotik seçimi ile agar plaka üzerinde plaka hücreleri.
- Plazmid pHLsec vektörü ise 100 ug / ml karbenisilin kullanın.
- Luria Broth (LB) Medya 250 ml kültür koloni 220 rpm'de çalkalanarak, 37 ° C'de 100 ug / ml bir antibiyotik (karbenisilin) O / N ile takviye edilmiştir.
- Üreticinin protokolüne uygun olarak yüksek hızlı Plazmid Maxi Seti kullanılarak DNA kültürden saflaştınlır.
- Bunun yerine tamponu TE tampon EB (10 mM Tris-Cl, pH 8.5) 'de DNA Zehir.
- -20 ° C de transfeksiyon ve mağaza için gerekli miktarda saflaştırılmış plazmid alikotu.
293F Hücreler 2. Büyük ölçekli kültür ve geçici transfeksiyonu
- 10 glutamin ml ve 5 ml Pen / Strep (her ikisi de 100x) ile Ek 1 L 293F ortam. 4 ° C'de saklayın. 5 ml Pen / Strep protein verimi artırır, serum içermeyen koşullar ve düşük antibiyotik konsantrasyonu transfeksiyon sırasında hücre canlılığını artırır yeterli bir güçtür.
- 1 L polikarbonat 300 mi ortam içinde kültür 293F hücreleri delikli kapaklı Erlenmeyer flasks bölmeli% 8 CO2 ile 37 ° C 'de s, standart bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde çalkalandı.
- Hücreleri 5 x 10 5 / ml yoğunlukta Transfeksiyondan bir gün önce sulandırmak.
- 293F ortam içinde hücre artışı ağırlık / hacim% 2,% 10 hacim ekleyerek transfeksiyon, ek Kültür aracı maddesi, günde.
- 500 mg / dL glukoz konsantrasyonu elde etmek için gerektiği gibi üreticinin talimatlarına ve kullanım takviyeleri göre glikoz monitörü kullanarak glikoz konsantrasyonu ölçün.
- Protein glikosilasyonu kontrol etmek için bu aşamada kifunensine (1 ug / ml nihai konsantrasyon) ilave edilir.
- DNA hesaplayın hacmi 1 x 10 6 hücre başına 1 ug plazmid için gereklidir. Steril koşullar altında, 5 ml serum barındırmayan ortam içinde DNA seyreltin.
- Transfeksiyon reaktifi ul 2 için 1 ug plasmid için gereken transfeksiyon reaktifi hacmini hesaplar. Steril koşullar altında, 5 ml serum barındırmayan ortam içinde transfeksiyon reaktifi (PEI-TMC-25) seyreltin.
- Eklemek1 ml artışlarla, DNA çözeltisi içine transfeksiyon reaktifi karıştırmanın. Oluşturulması için reaktif DNA kompleksleri, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra damla damla bir tarzda hücreler üzerine çözeltisi ilave edilir.
- Transfekte hücreler 72-96 saat boyunca protein ifade etmek için izin verin. ~ 10% hacim Cell Boost günlük Media, ya da gerekli olan Supplement glikoz 400-600 mg / dl okumaya devam.
3. Arıtma
- Pelet hücreleri ve süpernatan toplamak için 1300 x g'de 20 dakika süre ile, bir santrifüj şişesi içine santrifüj kültürünün süzün. Gerekirse, ikinci bir kez spin ve / veya yüzer netleştirmek için 0.22 mikron filtre kullanın.
- % 10 hacim 10x Ni-NTA bağlayıcı tampon ekleme (1,5 M NaCl, 0,5 MK 2 HPO 4, 0.1 M Tris, pH 8.5, 50 mM imidazol).
- Bir kolon içinde Ni-NTA bulamacın 2 ml ilave edilmesi ve 1 x bağlanma tamponu 10 kolon hacminde (CV) ile dengeye bir yerçekimi sütunu hazırlayın. Mümkünse, 4 ° C odasındaki tüm sütun adımları. Alternatively, soğuk protein ve sütun safhasından önce buz üzerinde tüm tamponlar ve protein tutmak ve toplanan akış buz üzerinde.
Not: Ni-NTA bulamaç hacmi ile% 50 reçine ve üreticinin belirttiği bağlama kapasitesi 50 mg / ml'dir. Ni-NTA boncuklar çoklu kullanım için yeniden şarj edilebilir - Reçine üzerinde süpernatant akış ve flow-through toplamak. Bu adımı yineleyin.
- Yıkama tamponu, 10 CV ile yıkayın (300 mM NaCI, 50 mM K 2 HPO 4, 20 mM imidazol, pH 8).
- Elüsyon tampon çözeltiden 5 CV protein Zehir (300 mM NaCI, 50 mM K 2 HPO 4, 250 mM imidazol, pH 8).
- Eğer deglikosilasyon gereklidir:
- 0,5 ml'lik bir son hacim için, bir santrifüjleme konsantratör kullanılarak 0,43 ml elüat konsantre edilir. Çökeltiler için, 16.000 x g ve 4 ° C ısıda santrifüj ile pislikleri pelet.
- 500 mM Na-sitrat pH 5.5, 50 ul ekle.
- EndoHf (1 x 10 6 U / ml) 20 ul ekle. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Değile: Enzim konsantre proteini toplamak için neden olabilir, 37 ° C 'de en iyi şekilde çalışır. SDS-PAGE veya immunoblotting tarafından değerlendirilen deglikosilasyon, eksik ise, RT inkübasyon uzatın. Enzim 4 ° C'de aktivitesi bulunmamaktadır. - Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da nihai depolama tamponu içinde yıkayın Amiloz Reçine 3 kez: EndoHf kaldırın. 4 ° C'de 1 saat boyunca reçineyle protein inkübe edin. Boncuk pelet ve süpernatant toplamak için 1000 xg'de 5 dakika Spin.
- Uygun molekül ağırlıklı akış kesici santrifüj filtresi kullanılarak protein konsantre edin ve depolama tamponu (150 mM NaCI ve 20 mM HEPES pH 7.5) içine tampon değişimine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada miyeloid hücreler 2 (hTREM2, kalıntılar 19-132) ifade insan proteini tetikleme reseptöründen salgılanan 13 kDa immünoglobin (Ig) etki uygulandığında, bu sentezleme sisteminin sonuçlar izler. TREM2 iki disülfid bağları ve iki tane N-bağlantılı glikosilasyon sitesi olan tek bir hücre dışı Ig alanı içeren bir tip I transmembran proteindir. Birçok Ig proteinleri 8 farklı olarak, TREM2 bakteriyel inklüzyon cisimcikleri 9'dan yeniden katlama için uygun değildi. Daha sonraki mutagenez teyit N bağlantılı glıkanlar, uygun ekspresyon ve katlama için gerekmektedir. Yapısal ve işlevsel çalışmalar kolaylaştırmak için, TREM2 standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak bir C-terminal 6His-tag 7 pHLsec vektörü içine dahil edilmiştir. Kifunensine ile muamele HEK293F hücrelerinde geçici sentezleme (Şekil 1B, şerit 2) Ni-NTA kromatografisi ile arıtılmış protein verdi ve Numune daha sonra nati üretmek için deglikosillendif, homojen bir protein (Şekil 1B, kuşak 3), katlanan. TREM2 bölgesinin 293F sentezleme 5-10 mg / L (5-10μg / milyon transfekte edilmiş hücreler) üretildi. Tampon, depolama tamponu içinde alışverişi sonra, bu protein, (Şekil 1C) kristalize edilmiştir. Yaklaşık% 80 nihai saflıkta rağmen, bu kristaller güvenilir saptırılmış, yeniden, sadece TREM2 protein (Şekil 1D) içeren gümüş leke gösterilmiştir. Bu gözlem, proteinin biyokimyasal homojenlik göstermektedir (yani, bölme ve post-translasyonel modifikasyonlar), bazı durumlarda, kristalizasyon başarı için genel saflık daha önemli olabilir.
Kristalleştirme ek olarak, bu sistem, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için sağlam bir araç sunmaktadır. Bu doğal glikosile protein üretir ve boyut-dışlama kromatografisi (Şekil 1E, F) göre>% 95 saflık elde edilmesi için istifade edilir. Solutio göstermektedir Bu ek saflaştırma aşaması,protein n davranışı, aynı zamanda protein kalitesini izlemek için ideal bir yoldur. Saflaştırılmış protein moleküler ağırlığına karşılık gelen bir hacimde elüte olmalı ve numunedeki en yaygın tür olmalıdır. Anormal toplu proteinin büyük miktarda kararsız protein belirtmek ve protein üretimini ve saflaştırılması optimize etmek için ipuçları sağlayabilir. Bundan başka, bu son saflaştırılmış protein, dairesel dikroizm spektroskopisi, termal stabilite ve araştıran protein ligand etkileşimleri gibi nicel biyofiziksel deneylerde kullanılmak üzere daha üstündür. Son olarak, glikosilasyon kapsamını kontrol glıkanın bağımlı işlevleri incelemek için sağlam bir araç sağlar.
Şekil 1. Memeli İfade Sistemi: (A) Şema HEK 293F hücrelerinde kontrollü ya da nativ glikosilasyon proteinlerin memeli ekspresyonu için. ( B) Ninta saflaştırılmış hTREM2 SDS-PAGE (şerit 2) Daha önce gösterildiği kifunensine altında EndoHf ile (hat 3) Deglikosilasyondan sonra ifade edilmiştir. Ninta-saflaştırılmış ve deglikosile proteinden üretilen (C) kristaller. Kristalizasyon girişinin (D) gümüş lekesi (kulvar 1) ve hasat edilen kristaller (kulvarlar 2 ve 3) kristallerin sadece TREM2 ihtiva ortaya koymaktadır. TREM2 (E) daha fazla saflaştırma olmadan Kifunensine 293F hücrelerinde üretilen Ninta arıtılmış TREM2 büyüklük-dışlama kromatografisi kullanılarak elde edilmiştir. Yıldız (*) Moleküler ağırlık standartına elüsyon hacimleri gösterir. Proteinler, bir analitik S200 sütunu (GE) ile TBS içinde yıkanmıştır. (F) boyut dışlama saflaştırılmış TREM2 SDS-PAGE analizi: girdi proteini (şerit 2) ve katlanan pik (yol 3). Ne kadar dolu SDS-PAGE ile, geniş bir yayma ile daha yüksek bir görünür molekül ağırlığında çalıştırmak heterojen glıkanlar edin."nk> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
HEK 293F hücreleri post-translasyonel modifikasyonlar gerektiren proteinlerin üretimini sağlam sunuyoruz. Bu sistem disülfıdlere, glikosilasyon, aksi takdirde daha rutin ifade araçlarını kullanarak yokluğunda olacağını fosforilasyon içeren özgün katlanmış proteinlerin hızlı ve ölçeklenebilir bir ifade verir. Buna ek olarak, bu sistem, sadece birden fazla plazmidin birlikte transfeksiyonu ile ekspresyonu ve çoklu protein kompleksleri saflaştırılması için de kullanılabilir. TREM2 Bunun yanı sıra, bu sistem yoğun bir laboratuar 10,11 ilgi diğer proteinler ile fonksiyonel çalışmalar için kullanılmıştır. Memeli hücreleri, in vivo deneyler için ya da yapıya bağlı antikorların üretilmesi için doğal olarak katlanmış antigenlerin üretimi için endotoksin içermeyen protein ekspresyonu, optimal sunmaktadır.
Optimal hücre canlılığı ve transfeksiyon koşulları, verimli protein üretimi için en önemli olan. Daha iyi bir hücre canlılığı, düşük-geçiş hücre kültürleri boost edilirHücre kültürü takviyeleri ve büyüme ortamında antibiyotik konsantrasyonu ile indirgenir. Modifiye PEI-TMC-25 en proteinler ile uygun transection verimliliğine sahiptir; Ancak, artan transfeksiyon verimliliği ve düşük sitotoksisite sunuyoruz makul bir fiyata kullanılabilen diğer seçenekler vardır. Hype 5 (Oz Bioscience) gibi 293fectin gibi, daha pahalı transfeksiyon reaktifleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha düşük bir maliyetle, PEI veya diğer reaktiflere göre verimi artırır. Reaktif tipi ve DNA: reaktif oranları, bireysel ifadeler ve istenen deney ihtiyaçları için optimize edilebilir.
Burada tarif edilen yöntem, protein üretimi için diğer yöntemlere göre bazı avantajları vardır. Memeli hücreleri yerli hastabakıcı katlama ve bakteri ve maya kullanılamaz post-translasyonel modifikasyonlar sunuyoruz. Ortam maddelerinin kullanımı boyunca plazmid yapı ve hazırlanması için daha az zaman, doğrudan modifiye edilebilir pH, baculovir için üstün haleböcek hücrelerinde bize tabanlı üretim; ve son olarak, serumsuz ortam kolay ölçekleme (daha yüksek hücre yoğunluğu) ve yapışkan 293T hücrelerine elde edilemeyen saflaştırmayı sunmaktadır. Bu sistemin baş sınırlama sadece zaman ve bireysel araştırmacı protein ekspresyonu işlemek için yapabiliyor ölçek.
En sık karşılaşılan sorunlar için sorun giderme seçenekleri aşağıda dahildir.
Sorun giderme
Düşük protein ifadesi varsa, 2-3 ay daha uzun 293F hücrelerini Pasajlanması kaçının. Azalmış hücre sağlığı Uzamış Pasajlanması sonuçları yavaş katlama zamanlarda yansıyan ve önemli ölçüde protein ifadesini azalır. Hücre büyümesi günlük olarak takip edilmeli ve artık günlük iki katına kültürler atılmalıdır. Hücre canlılığı, hücreleri pasajlanarak Kültür, takviyeleri kullanarak geliştirilebilir. / Dl Hücre yoğunluğu, 2.000.000 / ml aşmamalıdır 400-600 mg bir kültür konsantrasyonunu temin etmek üzere glukoz izleme vehücre canlılığı, tripan mavi dışlama ≥98% olmalıdır. Ml 0.5 milyon / için yoğun hücreleri sulandırmak ve O / N transfeksiyon önce iki katına izin verir. (1 ug DNA aralığında: 1,5-6 ul reaktifi), DNA: transfeksiyon reaktifi farklı oranları kullanılarak transfeksiyon optimize. Bu 2 ml 6-çukurlu plaka içindeki kültürler ve immunoblotting ile ölçülen çıkış kullanılarak yapılabilir. Protein ifade ve hızla düşer olup olmadığını gösterebilir 12 saat zaman noktalarında yapıyor; Protein süpernatant fraksiyonu uyulmaması durumunda hücre lizat edin. Salgılanacak başarısız yanlış katlanmış proteinler, hala immunoblotting hücre lizatında anlaşılacaktır.
Ni-NTA tutma düşükse, yani, protein, kolondan akış bağlama sonrası kalır, taze reçine içerir. Bu, aynı zamanda spesifik olmayan bağlanmayı geliştirmek rağmen 8.5 numunenin pH arttırılması, daha güçlü bir reçineye bağlanması ile sonuçlanır. 4 ° / N reçine O bağlanma örnek ve toplu Yoğunlaştırmalı olmak Cön Ni-NTA saflaştırma elde protein ~ 5x artışa neden olabilir. 6His etiketi nedeniyle proteinin tersiyer yapısına ulaşılmaz ise, diğer terminalinde üzerinde klonlama deneyin. Seçenek olarak ise, His artığı için daha yüksek bir afiniteye sahip kobalt reçine kullanır.
Protein topakları gece boyunca ve / veya saflaştırma sırasında çökelir ise, Ni-NTA bir% 10 gliserol ilave yıkama ve elüsyon tamponları ile çözünürlüğünü arttırmak. ° C oda sıcaklığında yerine 4 nikel afinite sütunları çalıştırın. PH ve tuz / çözelti içinde protein stabilitesini arttıran katkı taranması için diferansiyel tarama florimetri 12 kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture Flasks | GeneMate | F-5909B | |
| 293 Freestyle Media | Gibco/Life Technologies | 12338-018 | |
| GlutaMAX | Gibco/Life Technologies | 35050-061 | Use in place of Glutamine |
| Hype 5 transfection reagent | Oz Biosciences | HY01500 | |
| 293fectin transfection reagent | Life Technologies | 12347019 | |
| PEI transfection reagent | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| Maxiprep Kit | Qiagen | 12162 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen | 30430 | |
| Endo Hf | NEB | P0703L | |
| Amylose Resin | NEB | E8021S | |
| Cell Boost R05.2 | HyClone | SH30584.02 | Cell Culture Supplement |
| GlucCell | CESCO Bioengineering | DG2032 | Glucose Monitoring System |
| Opti-MEM | Life Technologies | 519850.91 | Serum Free Medium for DNA transfection |
| Luria Broth (LB Media) | Life Technologies | 10855-001 | |
| GC10 Competent Cells | Sigma-Aldrich | G2919 |
References
- Meyer, S., et al. Multi-host expression system for recombinant production of challenging proteins. PLoS One. 8, e68674 (2013).
- Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem. Structure. 15, 267-273 (2007).
- Rich, J. R., Withers, S. G. Emerging methods for the production of homogeneous human glycoproteins. Nat Chem Biol. 5, 206-215 (2009).
- Wu, K., et al. TREM-2 promotes macrophage survival and lung disease after respiratory viral infection. J Exp Med. 212, 681-697 (2015).
- Yang, C., et al. Mitigated cytotoxicity and tremendously enhanced gene transfection efficiency of PEI through facile one-step carbamate modification. Adv Healthc Mater. 2, 1304-1308 (2013).
- Elbein, A. D. Glycosidase inhibitors: inhibitors of N-linked oligosaccharide processing. FASEB J. 5, 3055-3063 (1991).
- Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1243-1250 (2006).
- Kelker, M. S., Debler, E. W., Wilson, I. A. Crystal structure of mouse triggering receptor expressed on myeloid cells 1 (TREM-1) at 1.76 A. J Mol Biol. 344, 1175-1181 (2004).
- Kober, D. L., et al. Preparation, crystallization, and preliminary crystallographic analysis of wild-type and mutant human TREM-2 ectodomains linked to neurodegenerative and inflammatory diseases. Protein Expr Purif. 96, 32-38 (2014).
- Yurtsever, Z., et al. Self-cleavage of human CLCA1 protein by a novel internal metalloprotease domain controls calcium-activated chloride channel activation. J Biol Chem. 287, 42138-42149 (2012).
- Sala-Rabanal, M., Yurtsever, Z., Nichols, C. G., Brett, T. J. Secreted CLCA1 modulates TMEM16A to activate Ca-dependent chloride currents in human cells. Elife. 4, (2015).
- Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability. Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).
