帘流柱：效率与灵敏度的优化

摘要

本文介绍了一种在帘流（CF）模式下操作和优化活性流技术（AFT）色谱柱以提高分离性能的实验方案。

摘要

主动流技术（Active Flow Technology，AFT）是一种色谱柱技术，通过使用专门设计的多端口端盖装置，提升高效液相色谱柱的分离性能。幕流（Curtain Flow，CF）色谱柱属于AFT系列色谱柱，其设计特点是将样品注入色谱柱填料的径向中心区域，同时在溶质注入区域周围引入一层流动相的“幕流”，以阻止样品向柱壁发生径向扩散。该色谱柱可发挥“无限直径”色谱柱的功能。该设计旨在克服色谱柱填料的径向非均一性，同时最大化将样品载入色谱柱填料的径向中心区域，从而提高检测灵敏度。本文所述方案详细说明了系统与CF色谱柱的安装步骤，以及优化“无限直径”虚拟色谱柱性能的调节过程。

引言

近年来，高效液相色谱（HPLC）的色谱柱技术取得了显著进展；由于采用了更小的颗粒尺寸以及更高效的核壳型颗粒，色谱峰容量已大幅提升。由于分离效率普遍提高，随之而来的效应是检测灵敏度的提升，因为色谱峰变得更尖锐，因而更高^1-8。

然而，径向床层非均一性仍然是所有色谱柱性能的限制因素，但这并非新问题，因为色谱工作者多年来早已认识到这一点。色谱柱床层在径向^9-12和沿柱轴方向^10,12-15均存在非均一性。其中，壁面效应尤其显著，是导致分离性能下降的重要原因^7,16-18。Shalliker 和 Ritchie⁷ 近期已综述了色谱柱床层非均一性的相关方面，因此此处不再进一步讨论。但需指出的是，柱床填充密度的差异以及壁面效应会导致溶质塞的变形，使得溶质带在通过色谱柱时以类似部分中空的汤碗形状的塞状物出峰，而非基础教学资料中通常描绘的薄而平整的实心圆盘状⁷。当通过实验对溶质在床层中的迁移过程进行可视化观察时，发现柱内溶质塞的剖面呈部分中空状，且谱带拖尾部分主要来源于样品塞在柱壁区域的组分。最终结果是，分离这些“部分中空”的溶质塞所需的理论塔板数，远高于若溶质塞为实心且平整时所需的数量^12,14,17。为克服与壁面效应及径向填充密度变化相关的谱带展宽问题，一种名为主动流体技术（Active Flow Technology, AFT）的新型....

方案

注意：请在使用所有材料和试剂前查阅其材料安全数据表（MSDS）即， 甲醇的安全数据表（MSDS）。处理溶剂和高效液相色谱（HPLC）流动相时，应遵守所有适当的安全操作规程。确保正确使用HPLC的工程控制装置、分析天平和检测器仪器，并佩戴适当的个人防护装备（安全眼镜、手套、实验服、长裤和封闭式鞋履）。

注意：本方案包含如何在配备紫外-可见光检测器的高效液相色谱系统上使用CF柱的说明。编写本方案时假定读者已具备色谱分析的基本知识和实践经验。

1. 高效液相色谱仪的设置

注意：本部分可根据分析人员的需求进行调整， 即， 溶剂选择、检测波长和流速设置，需与目标样品相适应。

1. 使用100%超纯水对高效液相色谱仪进行准备例如，A通道使用Milli-Q水作为流动相，B通道使用100%甲醇作为流动相，并根据仪器制造商的要求冲洗泵。
2. 将紫外-可见光检测器设置为254 nm。
3. 选择预注射分流模式或双泵流动模式进行设置。若采用分流模式，请进入步骤2；若采用双泵模式，请进入步骤3。

2. 分流系统设置

1. 断开自动进样器的进样阀与泵管之间的连接。
2. 将三通接头连接至泵管....

结果

AFT 色谱柱采用专用的烧结设计制备（图1) 以克服色谱柱床的不均匀性并提高分离性能。关于CF色谱柱分离性能的实验室间研究（图2采用双泵系统进行图3B如本方案第3节所述²³通过“虚拟”2.1 mm 内径条件对三组分测试混合物进行了分析，其中CF柱中央出口流的21%被导向检测器。三组分测试混合物的分离结果表明，相较于标准色谱柱，CF柱在柱效和灵敏度方面性能更优。该三组分测试混合物包含苯乙醚、丁苯和戊苯，在常规4.6 mm和2.1 mm内径色谱柱，以及分段比为22:78（中心:外围）的4.6 mm内径CF柱上进行分析，以模拟2.1 mm内径条件图4）。分离效率以理论塔板数（N）和灵敏度进行评价。采用CF柱进行分析时，检测限较低（图5）以及敏感性的提高（图4 和 6相较于传统的柱分析方法，无论使用何种实验室或HPLC系统，.......

讨论

本研究对CF色谱柱进行了实验室间分析，以检测其在效率和灵敏度方面的分析性能。CF色谱柱采用双泵系统，如“3. 双泵系统设置”部分所述，在CF色谱柱入口处实现40:60（中心:外围）的流速比。通过将每台泵的流速分别设置为总流速的40%和60%，达到40:60（中心:外围）的流速比。CF色谱柱出口通过“4. CF出口流速调节”部分所述的步骤，调节至内径为2.1 mm的“虚拟”色谱柱。使用含有苯乙醚、丁基苯和戊基苯的混合样品作为测试标准品，比较内径为4.6 mm的CF色谱柱（22:78）与传统的4.6 mm和2.1 mm内径色谱柱的分离性能。图4展示了使用三种色谱柱分别对测试混合物进行色谱分离的叠加图。该图中观察到的主要差异是，使用CF色谱柱获得的分离信号响应显著增强。如预期，由于色谱条件已按色谱柱横截面积进行比例缩放，4.6 mm和2.1 mm内径传统色谱柱的信号响应几乎完全相同。

线性关系和检测限也在CF模式与常规操作模式之间进行了评估，其中在不同的高效液相色谱系统上，以不同的流速制备并分析了一系列标准品的重复样品。无论使用哪种高效液相色谱系统或何种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
高效液相色谱仪
附加泵			若使用双泵 Curtain Flow 系统配置，则必须配备。
Curtain Flow 高效液相色谱柱	Thermo Fisher Scientific	未定义	即将商业化
甲醇	任意品牌		色谱纯级
PEEK 管路	任意品牌		多种长度和内径
PEEK 管切割器	任意品牌
分析天平	任意品牌
秒表	任意品牌
洗脱液收集容器	任意品牌		可使用 1–2 ml 样品瓶作为洗脱液收集容器
三通接头	任意品牌