Introduction
De laatste jaren kolomtechnologie voor High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is sterk gevorderd; piekvermogens aanzienlijk toegenomen dankzij grotendeels het gebruik van kleinere deeltjes en een efficiënter kern schildeeltjes. Aangezien scheidingen algemeen efficiënter is een stroom-effect een toename van de gevoeligheid sinds pieken nu scherper en dus groter 1-8.
Niettemin radiale bed heterogeniteit is nog steeds een beperkende factor bij het uitvoeren van alle kolommen, maar dit is geen nieuw verhaal aangezien dit chromatographers zijn vele jaren bekend. Kolom bedden zijn heterogeen in zowel de radiale richting 9-12, en langs de kolomas 10,12-15. De wand-effect is vooral een belangrijke bijdrage aan het verlies van de scheiding prestaties 7,16-18. Shalliker en Ritchie 7 onlangs beoordeeld aspecten van de kolom bed heterogeniteit en dus dit hoeft niet discusse zijnd hier verder. Hoewel het volstaat om te zeggen, dat de variatie in kolom bed pakkingsdichtheid en de muur effecten leiden tot een verstoring van de opgeloste stof plug, zodanig dat bands elueren door de kolom in pluggen die lijken gedeeltelijk gevuld soepkommen in plaats van dunne platte massieve schijven 7 die meestal afgebeeld in de basis onderwijs teksten. Bij dergelijke experimenten werden uitgevoerd dat de opgeloste migratie door het bed kan worden gevisualiseerd de stekker profielen in de kolom waren gedeeltelijk hol en de staart deel van de band grotendeels wandcomponent van het monster plug. Het eindresultaat is dat het duurt veel meer platen om deze 'gedeeltelijk hol' pluggen dan nodig zou zijn als de schijven waren solide en platte 12,14,17 scheiden. De band verbreding kwesties in verband met wandeffecten en de variatie in radiale pakkingsdichtheid overwinnen, een nieuwe vorm van kolomtechnologie zogenaamde Active Flow Technology (AFT) is gemaakt 7,19. Het doel van dit ontwerp waswandeffecten heffen door de fysieke scheiding van oplosmiddel eluerende langs het wandgebied, dat van de mobiele fase elueren in het radiale centrale gebied van de kolom 19. Er zijn twee hoofdtypen van AFT kolommen; Parallel Gesegmenteerde Flow (PSF) kolommen en Curtain Flow (CF) kolommen 7. Aangezien dit protocol is gericht op het gebruik en de optimalisatie van de CF columns, PSF kolommen worden niet verder besproken.
Gordijn Flow (CF)
Gordijn Flow (CF) kolomnotatie gebruik AFT end-fitting aan zowel de inlaat als de uitlaat van de kolom. AFT end-armaturen bestaan uit een ringvormige frit zich in een multiport fitting. De frit bestaat uit drie delen: een poreus radiaal centraal gedeelte dat is uitgelijnd met de centrale poort van de eindfitting, een poreus buitengedeelte dat is uitgelijnd met de perifere poort (en) van het koppelstuk, en een ondoordringbare ring die scheidt de twee poreuze gedeelten voorkomen van kruis-Flow tussen de centrale en radiale buitengebieden van de frit 19. Figuur 1 illustreert het ontwerp van de AFT frit en figuur 2 illustreert het CF kolomformaat. In deze modus (CF) het monster wordt geïnjecteerd in de radiale centrale poort van de inlaatfitting, terwijl aanvullende mobiele fase wordt via de perifere poort van de inlaat 'gordijn' de migratie van opgeloste stoffen door de radiale centrale gebied van de kolom. Vandaar het monster komt het bed in de radiale centrale gebied van de kolom met het buitenste gebied van de kolom met mobiele fase alleen doorleiden. Studies hebben aangetoond dat een volumestroom verhouding van ongeveer 40:60 (CV: periferiepoort) voor het inlaateinde-fitting van een kolom 4,6 mm inwendige diameter (id) optimaal 6,7,16. De AFT uitlaat van de CF kolom maakt de aanpassing van de centrale en perifere stroom naar hun relatieve aandeel en kunnen worden gevarieerd om bijna elke gewenste ratio door de druk management. Het optimaliseren van een CF kolom kan een aanzienlijke verbetering verschillende functionele aspecten van de kolomtechnologie, zoals scheidend vermogen of detectiegevoeligheid. Op deze wijze wordt een 'wall-less', 'oneindige diameter "of kolom' virtueel 'is gevestigd 6,10,18,20. Doel van CF kolommen actief te beheren de migratie van monster door de kolom te voorkomen dat het monster van het wandgebied bereiken. Aldus wordt de concentratie opgeloste stof bij het verlaten van de detector gemaximaliseerd, verhogen van de gevoeligheid van ongeveer 2,5 maal groter dan de conventionele kolomindeling bij gebruik van ultraviolet (UV) detectie 16 en nog meer bij gebruik massaspectrale detectie 6.
CF kolommen zijn ideaal voor lage concentratie monsters, aangezien detectiegevoeligheid toeneemt. Verder zijn ze ideaal wanneer gekoppeld aan snelheid beperkt detectoren, zoals de massaspectrometer (MS) 6 stromen. een AFT kolom in een 4,6 mm ID formaat, kan bijvoorbeeld worden afgestemd op dezelfde volume oplosmiddel leveren aan een detector als een standaard 2,1 mm id format kolom wanneer bedreven bij dezelfde lineaire snelheden, door instelling verlaten middenuitstromer tot 21%. Ook de AFT kolom kan ook worden afgestemd op dezelfde volumebelasting leveren aan een detector als 3,0 mm id kolom, door instelling verlaten middenuitstromer tot 43%. In feite kon geen 'virtuele' kolom-formaat worden geproduceerd om de analytische eis 6,18,22 passen. Met deze speciaal ontworpen end-fitting aan de inlaat en de uitlaat, zodat een echte muur minder kolom vastgesteld.
Er zijn twee manieren om het opzetten van het oplosmiddel levering systeem om de centrale en perifere havens van de inlaat. Split-flow systeem 6 en twee pompsysteem 6,7 Figuur 3 toont elk van deze CF-systeem set-ups.
Split-flow-systeem
ikna stroomsplitsingsproces (zie figuur 3A) het pompdebiet waardoor de injector split pre-injector met een nul-dood volume T-stuk, waarbij een vloeistofstroom mobiele fase is verbonden met de injecteur, die vervolgens wordt verbonden met de centrale poort van het inlaateinde-fitting van de kolom. De tweede stroom stroom eluens met de injector-passeert en is verbonden met de perifere poort op de inlaat van de kolom. Tijdens de splitsing van de stroom, wordt de vloeistofstroom percentage ingesteld op 40:60 (midden: perifere) voor de leidingen zijn verbonden met de kolom, dwz van injector centrum en pomp perifere.
Twee pompsysteem
De CF kolom vereist twee stromen aan het inlaateinde-fitting van de kolom. Afhankelijk van het type autosampler / Injecteur volgens de HPLC instrument stroomsplitsingsproces zetten niet altijd mogelijk, en dus CF kan dan worden bereikt door 2 pompen (Figuur 3B 21). Elke pomp is verdeeld en aangesloten op het centrale of perifere poort en de stroomsnelheid is ingesteld op 40% van de stroom voor de centrale poort en 60% voor periferiepoort vertegenwoordigen. Als bijvoorbeeld de totale stroomsnelheid 1,0 ml min -1, de centrale pompdebiet wordt ingesteld op 0,4 ml min-1 en de perifere pomp is ingesteld op 0,6 ml min -1.
De keuze van de werkwijze is grotendeels afhankelijk van de HPLC instrumentatie en chromatografische werkwijze. Bijvoorbeeld in sommige autosamplers een verandering in druk tussen monster laadpositie en injecteer monster positie kan optreden verstoren van de stroomsplitsingsproces verhouding en dus in dit geval een dubbele pomp ingesteld voor optimale prestaties CF zou worden aanbevolen. Ongeacht het oplosmiddeltoevoersysteem opgezet gekozen voor de inlaat van de kolom CF, CF blijft de uitlaat optimalisatie hetzelfde. De uitlaat centrale poort van de kolom CF is bevestigd aan de Ultraviolet-Visible (UV-Vis) detector met de smalopdat volume mogelijk slang aan de effecten van post-kolom dode volume te minimaliseren. Aangezien CF kolommen emuleren nauwe boring kolommen dode volume tussen de kolomuitlaat en de detector is nadelig voor het scheidend vermogen van de kolom CF. Het is cruciaal om de kleinste hoeveelheid volume buis tussen de centrale poort en de UV-Vis detector om de effecten van dode volume zoals bandverbreding, rendementsverlies en gevoeligheid minimum wordt beperkt. Derhalve wordt het gebruik van smalle boring buis (0,1 mm id) aangeraden gemakkelijk druk aanpassingen mogelijk zonder toevoeging ongepaste dood volume. Slang is ook verbonden met de periferiepoort en gericht te verspillen. Bij de uitlaat van de kolom CF, kan de segmentering verhouding worden aangepast aan elke verhouding die het doel van de analist past. Wanneer een 4,6 mm id CF wordt gebruikt, bijvoorbeeld, is het vaak handig om de ratio of 43:57 of 21:79 (centrum: perifere) ingesteld op een "virtueel" 3,0 mm ID kolom of 2,1 mm kolom die emulerenrespectvol. Op die manier de scheiding prestaties is direct-bank gemarkeerd. De segmentatie verhouding wordt gemeten door wegen van de hoeveelheid stroom verlaten van de detector die is verbonden met de centrale poort en de stroom die uit de periferiepoort gedurende een periodetijd. Het percentage stroming door elke poort kan dan worden bepaald en de verhoudingen kunnen worden bijgesteld door het buisstuk bevestigd of via slangen met een andere inwendige diameter (id) heeft.
Deze video protocol beschrijft de procedures van een CF-column voor verbeterde chromatografische prestaties werking en optimalisatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor alle materialen en reagentia voor het gebruik (dwz, VIB voor methanol). Zorg ervoor dat het gebruik van alle nodige veiligheidsvoorschriften bij de omgang met oplosmiddelen en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eluent. Zorgen voor het juiste gebruik van technische controles van HPLC, analytische balans en de detector instrumentatie, en zorgen voor het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, volledige lengte broek en dichte schoenen).
Let op: Dit protocol bevat instructies over hoe je een CF column te gebruiken op een HPLC-systeem in combinatie met een UV-Vis detector. Het protocol is geschreven in de veronderstelling de lezer basiskennis en ervaring in de chromatografie.
1. Setup van HPLC Instrument
Opmerking: Dit gedeelte kan worden aangepast aan de analisten behoeften, dat wil zeggen aan te passen, de keuze van oplosmiddelen, golflengte detector en debiet datgeschikt zijn voor de steekproef van belang.
- Bereid de HPLC instrument 100% ultrazuiver water (bijvoorbeeld Milli-Q water) voor lijn A en 100% methanol gedurende lijn B als de mobiele fase en ontlucht de pompen volgens eis fabrikant.
- Stel de UV-Vis detector 254 nm.
- Kies ofwel een pre-injectie stroom split-modus van de set-up, of een dubbele pomp stroom set-up. Voor de split-flow-modus ga dan naar stap 2, voor de dubbele pomp mode verder met stap 3.
2. Split-flow System Setup
- Koppel de pomp lijn van de injector klep van de auto-sampler.
- Bevestig een T-stuk aan de pomp lijn.
- Bevestig een 15 cm stuk van 0,13 mm id slang aan op iedere haven van de T-stuk.
- Sluit één buis van het T-stuk op de afsluiter van de auto-sampler injector.
- Stel de pomp 1,0 ml min -1.
- Alvorens pompleidingen naar de inlaat van de kolom CF Stem de segmentatie verhouding van de stroom tot 40%: 6 0% (middellijn: perifere lijn) als volgt in stap 2.7.
- Tuning van CF inlaat verhouding op de split-flow-systeem
- Meet de massa van twee lege verzameling schepen met behulp van een analytische balans en label een collectie vat centraal en de andere perifere (één voor de lijn van de auto-sampler naar de haven en een centrum voor de lijn van het T-stuk aan perifere poort) .
- Gedurende 1,0 min, laat de uittredende mobiele fase uit de lijn vanuit de injector (op het punt dat wordt verbonden met de kolom) in het verzamelvat, waarvan de massa werd gemeten in 2.7.1.
- Re-wegen de collectie vaartuig op de analytische schaal en het bepalen van de massa van de mobiele fase verzameld.
- Herhaal stappen 2.7.2 tot 2.7.3 van het eluent verlaten van de lijn van het T-stuk dat moet worden aangesloten op de periferiepoort.
- Bepaal het percentage stroom (ml min -1) van elke lijn van stroom volgens de volgende vergelijkingen:
1 "src =" / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/> - Stel de stroom ratio tot 40%: 60% (± 2%) (lijn van injector naar het centrum van de haven: lijn van T-stuk aan perifere poort). Als de lijn van de injector naar de centrale poort Uitstroompercentage boven 40%, verhoging van de drukval door het verlagen van de inwendige diameter van de buis, of verhoging van de lengte. Indien de lijn injector centrale poort Uitstroompercentage minder dan 40%, verhoging binnendiameter van de buis of de lengte van de buis afnemen.
- Zodra de stroom verhoudingen zijn afgestemd draai het pompje uit.
- Sluit de lijn van de injector naar de centrale poort van de kolominlaat en de lijn van het T-stuk naar de periferiepoort van de kolominlaat.
- Oprit langzaam het debiet tot 1,0 ml min -1 bij 100% lijn B.
- Equilibreren van de kolom (4,6 mm ID x 100 mm lengte) doordat100% Methanol (lijn B) mobiele fase stroomt door de kolom bij 1,0 ml min-1 gedurende 10 min. Deze tijd wordt geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken.
- Voor de afstemming van de CF uitlaat gaat u naar Stap 4. "Tuning van CF uitlaat flow '.
3. Dual Pump System Setup
- Sluit het HPLC-systeem pomp naar de injector en sluit vervolgens de lijn van de injector naar de centrale inlaat van de kolom.
- Sluit de extra pomp rechtstreeks aan de inlaat periferiepoort van de kolom. Merk op dat deze tweede pomp by-passeert de injector.
- Ramp het debiet van de circulatiepomp aan de centrale poort 0,4 ml min-1 (representatief voor 40% van het totale debiet van 1,0 ml min-1) en 100% Methanol (lijn B).
- Op hetzelfde moment als stap 3,3, helling het debiet van de perifere pomp 0,6 ml min-1 (representatief voor 60% van het totale debiet van1,0 ml min -1) en 100% Methanol (lijn B).
- Equilibreren van de kolom (4,6 mm ID x 100 mm lengte) doordat 100% Methanol (lijn B) mobiele fase door de kolom te stromen bij 1,0 ml min-1 gedurende 10 min. Deze tijd wordt geschaald volgens de afmetingen van andere kolommen de gebruiker kan gebruiken.
- Voor de afstemming van de CF uitlaat gaat u naar Stap 4. "Tuning van CF uitlaat flow '.
4. Tuning van CF Outlet Flow
- Sluit de centrale uitlaatpoort aan de UV-Vis detector met behulp van een 15 cm stuk van 0,13 mm id slang.
- Sluit een 15 cm stuk van 0,13 mm id slang aan op de perifere uitlaatpoort van de kolom CF.
- Weeg de massa van twee lege collectie schepen op de analytische balans en label één vat centraal en de andere perifere.
- Voor 1,0 min, het verzamelen van de uittredende mobiele fase van de UV-Vis detector (centrale flow) in de collectie vat label centrale, waarvan de massa werd gemeten in 4.2.
- Re-wegen de collectie vat met de verzamelde eluens over de analytische schaal en het bepalen van de massa van de mobiele fase verzameld.
- Herhaal stap 4,4-4,5 voor de eluent verlaten van de lijn uit het perifere uitlaatpoort.
- Bepaal het percentage van de stroming van elke lijn van stroom volgens de volgende vergelijkingen:
- Stel de stroom ratio tot 21%: 79% (± 2%) (centrale uitlaat flow uit UV-Vis: perifere uitlaat stroom van lijn). Als de centrale stroom percentage van de UV-Vis is boven de 21%, verhoging van de drukval door verlaging van de inwendige diameter van de buis aan de uitgang van de UV-Vis detector, of verhoging van de lengte. Als de centrale Uitstroompercentage van de UV-Vis is dan 21%, verhoging binnendiameter van de buis aan de uitgang van de UV-Vis detector, of de lengte van de buis afnemen. Telkens wanneer het buisstuk is gewijzigd, herhaaltstappen 4,3-4,7.
Let op: De CF column in 'virtuele' 2,1 mm id-modus is klaar voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AFT kolommen werden ontwikkeld met behulp van een gespecialiseerde frit ontwerp (figuur 1) in de multipoort kolom end-fittingen aan de kolom bed heterogeniteit overwinnen en scheiding verbeteren. Een inter-laboratoriumonderzoek op de scheiding prestaties van CF chromatografiekolommen (figuur 2) werd uitgevoerd met een dubbele pomp opgezet (Figuur 3B), zoals beschreven in paragraaf 3 van dit protocol 23 uitgevoerd. Een drie componenten testmengsel werd geanalyseerd onder via een 'virtuele' 2,1 mm id waarbij 21% van de centrale afvoer stroom van de kolom CF was gericht naar de detector. De scheiding van een drie componenten testmengsel illustreert de verbeterde prestaties in termen van efficiëntie en gevoeligheid, van een CF-kolom ten opzichte van standaard columns. De drie componenten testmengsel bevatte phenetole, butylbenzeen en pentylbenzene en werd geanalyseerd op conventionele 4,6 en 2,1 mm id kolommen en een 4,6 CF mm id kolom met een segmentatie verhouding van 22:78 (midden: perifere) een 2,1 mm interne diameter (figuur 4) te emuleren. Scheidingsrendement werd geëvalueerd in termen van kiemgetal (N), en gevoeligheid. Het gebruik van CF kolom voor analyse toonde een onderste detectielimiet (figuur 5) en een stijging van de gevoeligheid (figuren 4 en 6) in vergelijking met conventionele analyses kolom. Er werd ook gevonden dat ongeacht het laboratorium of type HPLC systeem dat wordt gebruikt, het scheidingsrendement resultaat voor de kolom CF relatief hetzelfde, al wat resulteert in verbeterde prestaties scheiding bij toepassing CF chromatografiekolommen 23.
Figuur 1. Illustratie van Active Flow Technology column-end fitting frit design. oad / 53471 / 53471fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. AFT column -. CF kolom formaat Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Set up van CF kolominlaat stroming in (A) split-flow systeeminstellingen en (B) 2 pompsysteem setup. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
/53471fig4.jpg "/>
Figuur 4. Een typische scheiding van de drie componenten testmengsel verkregen met de Ultimate 3000 systeem. (A) Conventionele 4,6 mm id kolom, (b) Conventionele 2,1 mm id kolom (c) gordijnstroom kolom werkt met een 22% outlet segmentatie verhouding. Opgeloste stoffen: (i) phenetole, (ii) butylbenzeen en (iii) pentylbenzene. Dit cijfer is overgenomen uit 23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Elutie band profielen van butylbenzeen bij de detectielimiet op (a) de conventionele kolom en (b) de gordijnstroom kolomsysteem. Shimadzu bij 2,0 ml / min, 5 gl injectie, detectie bij 254 nm. Dit cijfer is gewonnen uit
Figuur 6. Vergelijking van de elutie profielen van butylbenzeen opgehaald op Ultimate 3000 systeem. (A) de gebruikelijke 4,6 mm id kolom, (b) de conventionele 2,1 mm id kolom, (c) de gordijnstroom kolom met een 22% outlet segmentatie verhouding. Dit cijfer is overgenomen uit 23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit onderzoek betrof de inter-laboratoriumanalyse van CF chromatografiekolommen de analytische prestaties in termen van efficiency en gevoeligheid te testen. De CF-kolom werd opgezet met een dubbele pompsysteem zoals beschreven in paragraaf "3. Dubbele pomp opgezet om een stroom van 40:60 bereiken (midden: perifere) aan de inlaatzijde van de kolom CF. Het 40:60 (centrum: perifere) stroomverhouding werd bereikt door het debiet van elke pomp naar de waarde die 40% en 60% van de totale stroomsnelheid, wat overeenkomt. De uitlaat CF kolom werd afgestemd op een 'virtuele' zuil met een id van 2,1 mm door de procedure te volgen in de rubriek 'beschreven 4. Tuning van CF uitlaat flow '. Een monster mengsel dat phenetole, butylbenzeen en pentylbenzene werd gebruikt als test standaard voor een scheidingsrendement vergelijking tussen een 4,6 mm id kolom CF (22:78) en conventionele 4,6 en 2,1 mm id kolom. Figuur 4 is een bekleding van de chromatographic scheiding van het testmengsel uitgevoerd via elk van de drie kolommen. Het belangrijkste verschil waargenomen in deze figuur is de aanzienlijke toename van signaalreactie voor de scheiding verkregen met de CF-kolom. Het signaal respons voor de 4,6 en 2,1 mm id conventionele kolommen waren bijna identiek zoals verwacht als chromatografische omstandigheden werden gemaakt voor het dwarsdoorsnedeoppervlak van de kolom passen.
Lineariteit en detectiegrenzen werden onderzocht tussen CF en conventionele werkwijzen, waarbij een reeks standaarden werden bereid en in duplo op verschillende HPLC systemen met verschillende stroomsnelheden geanalyseerd. Ongeacht de HPLC-systeem werd gebruikt en op welke stroomsnelheid het resultaat van de analyse was in wezen hetzelfde, waar het signaal respons voor CF was altijd aanzienlijk groter dan de andere conventionele kolommen. Signaalresponsie winsten waren typisch tussen 1,7 en 2,8 keer groter dan conventionele kolommen. Een 5-voudigeverbetering van de nauwkeurigheid van metingen (bijv relatieve standaardafwijking - RSD%) van de piekhoogte van de laagste standaardreeks werd waargenomen voor de CF werkwijze bij 22% in vergelijking met de gebruikelijke 2,1 mm id kolom. CF verbetert de nauwkeurigheid van metingen piek door de toename van de gevoeligheid die wordt verkregen door CF. Hoe groter de signaalreactie hoe lager de waarde RSD. Aldus als gevolg van verbeterde signaal responsiepiekversnelling precisie ook verbeterd, ook efficiency hoger, zodat bands staart minder en dus piekintegratie nauwkeuriger. De grenzen van de detentie en kwantificering met behulp van CF zuilen met een uitlaat segmentatie verhouding van 22:78 (midden: perifere). Ook werden verbeterd met maar liefst 2,3 keer dan de conventionele 2,1 mm id kolom 23 Figuur 5 illustreert de buurt detectielimiet respons voor butylbenzeen piek onder de CF-omstandigheden en de gebruikelijke omstandigheden.
Een belangrijk aspect van de comglasklomp tussen CF en conventionele kolommen die niet zichtbaar in figuur 4 is de vermindering in de piek volume voor de analyten in monsters die op grond CF omstandigheden. Figuur 4 toont de pieken in de tijd echter, aangezien CF modus een deel van de totale stroom wordt gebruikt, piekbreedte kan worden aangepast in volume. Figuur 6 vergelijkt het butylbenzeen elutieprofiel ten opzichte piekvolume CF (22:78) emuleren een 'virtuele' 2,1 mm id, een gebruikelijke 4,6 mm id kolom en een conventionele 2,1 mm id het volume piek tussen CF en de gebruikelijke 2,1 mm kolommen was bijna identiek, maar de piek volume van de gebruikelijke 4,6 mm kolom was ongeveer 5 keer groter dan zowel conventionele 2,1 mm en CF (22:78) . Belangrijk, was de vermindering in de piek volume CF modus niet tot een vermindering van signaalresponsie, maar een toename van bijna 3 keer dan dat van de conventionele kolommen regardless een inwendige diameter van 23. Hoewel een vermindering piekvolume niet belangrijk voor UV-VIS detectie kan worden, kan het niet worden gezegd voor detectie werkwijzen die stroomsnelheid afhankelijke of beperkt, bijvoorbeeld, massaspectrometer of verdampende lichtverstrooiingsdetector zijn.
Het nadeel van CF werkwijze zoals die smallere boring conventionele kolommen zijn gevoeligheid voor de invloed van post-kolom dood volume, die aanzienlijk kunnen verslechteren het scheidend vermogen door het veroorzaken bandverbreding en verval van de signaalintensiteit. Echter, het dode volume bij de inlaat minder belangrijk. Aldus ter bescherming van het na de kolom buizen is noodzakelijk voor een optimale CF scheidend vermogen. CF-chromatografie is een vrij nieuwe vorm van kolom technologie die een groot potentieel in de toekomst toepassingen heeft. Bijvoorbeeld, de injectie van een lage concentratie monster in het midden van de kolom CF, is "gordijn" van de wand (perifere) mobiele fase concentclass het monster in het midden van de kolom CF, en daarmee de signaalrespons maximaliseren. Bij de uitgang alleen de centrale stroom die de 'geconcentreerde' monster genomen naar de detector, die een verhoging van de gevoeligheid, ideaal voor snelle analyse met hoge stroomsnelheden op stroming beperkt detectors zoals MS 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
References
- Camenzuli, M., et al. The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates. Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).
- Kocic, D., et al. High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns. J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).
- Shellie, R., Haddad, P.
- Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).
- Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the "infinite diameter effect". J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).
- Miyabe, K., Guiochon, G. Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography. J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).
- Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity. J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).
- Gritti, F., Guiochon, G. Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results. J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).
- Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column. J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).
- Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds. AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).
- Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Foley, D., et al. Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography. Thermo Scientific. , (2013).
- Pravadali-Cekic, S. Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC. University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).
- Foley, D., et al. Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study. Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).
