Introduction
È necessaria l'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni genomiche quali la trascrizione e la regolazione epigenetica. Sebbene siano state sviluppate diverse tecniche per l'analisi biochimica di specifiche regioni genomiche 1-7, non sono ampiamente utilizzati in questa fase causa dei loro problemi intrinseci quali applicazione limitata (ad esempio, solo per numero alta copy loci o loci con ripetizioni) e troppo tempo e gli sforzi necessari.
Al fine di effettuare analisi biochimica di specifiche regioni genomiche facilmente, abbiamo sviluppato due tecnologie specifiche locus cromatina (chip), vale a dire inserzionale Chip (iChip) 8-13 e ingegnerizzato DNA-binding ChIP molecola-mediata (enChIP) 14-17 . In iChip, un luogo di interesse è contrassegnati con l'inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina di legame al DNA esogeno, come LexR. Il locus è quindi isolato da purificazione per affinità con la proteina DNA-binding tag. In enChIP, ingegnerizzati molecole che legano il DNA, come le proteine zinc-finger, (TAL) proteine attivatore-come trascrizione, e cluster brevi ripetizioni palindromiche regolarmente intervallati (CRISPR) complessi, vengono utilizzate per contrassegnare un luogo di interesse (Figura 1). Successivamente, la regione genomica è isolato dalla purificazione per affinità delle molecole DNA-binding targhetta.
Uno dei vantaggi di enChIP sopra iChip è che l'inserimento di sequenze di riconoscimento di una proteina legante il DNA esogeno-non è necessario. Targeting di loci usando complessi CRISPR costituiti da una forma cataliticamente inattiva di Cas9 (dCas9) e una guida RNA (gRNA) è molto più facile che prendere di mira di queste regioni a iChip o enChIP utilizzando TAL e zinco-finger proteine. Qui, descriviamo un protocollo step-by-step per enChIP combinata con spettrometria di massa e RNA sequencing (RNA-Seq) per identificare locus-Associaproteine e RNA ted, rispettivamente.
Protocol
1. Progettazione di Engineered molecole di DNA-binding Riconoscere il Target Locus
- Per enChIP utilizzando complessi CRISPR, utilizzare lo strumento web CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) per identificare sequenze candidato bersaglio gRNA nella regione genomica di interesse descritto come precedentemente 18. Questo strumento web riporta 23 bp siti genomici della forma 5'-N 20 NGG-3 'all'interno della regione di destinazione.
- Sintetizzare un gBlock compresa la sequenza del promotore U6 e la sequenza di 5'-N 20 in 5'-N 20 NGG-3 'utilizzando servizi commerciali (vedi Figura 2) 19,20. Ai fini subcloning, includere preposti per enzimi di restrizione al di fuori del gBlock.
- Inserire il gBlock in un vettore adeguato come descritto in precedenza 16. Diversi vettori retrovirali per gBlocks sono disponibili (vedi Materiali).
- Per enChIP utilizzando proteine TAL, progettare proteine TAL riconoscendo la target loci. Generare plasmidi che codificano per proteine TAL che utilizzano i servizi commerciali. Genera vettori di espressione contenenti le proteine TAL fusi con una o più variabili come 3 × FLAG come descritto in precedenza 15.
2. Istituzione di cellule per l'analisi enChIP
- Esprimere 3 × FLAG-dCas9 e il gRNA (procedura basata CRISPR-) oppure 3 × FLAG-TAL (TAL procedura a base di proteine) nelle cellule per essere analizzato come descritto in precedenza 14-17.
- Utilizzare trasfezione transiente se l'efficienza di trasfezione è alta. Un vettore di espressione contenente 3 × FLAG-dCas9 e il promotore CMV è disponibile (vedi Materiali).
- Considerare l'istituzione di trasformanti stabili con metodi convenzionali se l'efficienza di trasfezione transiente è bassa. In aggiunta ai suddetti vettori retrovirali per gBlock, vettori retrovirali di 3 × FLAG-dCas9 sono disponibili (vedi Materiali).
- Conferma espressione del gRNA dalla tecnica standard RT-PCR.
- Per l'identificazione quantitativa di proteine che interagiscono con la regione genomica di interesse, prendere in considerazione l'uso di un sistema di etichettatura isotopo stabile da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) analisi combinata con enChIP (enChIP-SILAC).
Nota: supporto per l'analisi SILAC possono essere acquistati da fornitori commerciali. SILAC è potente nel rilevare interazioni specifiche.- Cellule di coltura in SILAC medio pesante. Preparare cellule culturosso in mezzo luce SILAC come controllo negativo. Utilizzare almeno 5 × 10 7 cellule per mezzo SILAC (pesante o leggero). Per l'etichettatura efficiente, aggiungere sia L-lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 nei media SILAC pesanti. Nota: Almeno cinque divisioni cellulari sono necessari per le proteine di etichette.
- Per esempio, la cultura umana cellule fibrosarcoma HT1080 esprimono stabilmente 3xFLAG-dCas9 e un gRNA a 37 ° C e 5% di CO 2 in DMEM media per la SILAC e siero fetale bovino dializzato con lisina-2HCl più L-Arginina-HCl (medio chiaro) o 13 C 6 L-lisina-2HCl più 13 C 6 15 N 4 L-arginina-HCl (medio pesante) (vedi Materiali) 16. Aggiungere 50 mg di leggera o pesante L-lisina-2HCl e L-arginina-HCl in 500 ml di terreno.
- Cellule trypsinize e replate prima che diventino confluenti modo che le cellule mantengono growt esponenzialeh.
- Cellule di coltura in SILAC medio pesante. Preparare cellule culturosso in mezzo luce SILAC come controllo negativo. Utilizzare almeno 5 × 10 7 cellule per mezzo SILAC (pesante o leggero). Per l'etichettatura efficiente, aggiungere sia L-lisina-2HCl, 13 C 6 e L-Arginina-HCl, 13 C 6, 15 N 4 nei media SILAC pesanti. Nota: Almeno cinque divisioni cellulari sono necessari per le proteine di etichette.
Nota: L'espressione di queste proteine con tag può anche essere confermata mediante colorazione intracellulare con anticorpi anti-FLAG-FITC e una successiva analisi FACS. Un protocollo per la colorazione intracellulare può essere scaricato dal nostro sito internet (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. La reticolazione di Celle con formaldeide
- Per le cellule in coltura in sospensione, trasferimento 2 × 10 7 cellule che esprimono proteine 3xFLAG-TAL o 3xFLAG-dCas9 più gRNA e sospendere in 30 ml di terreno di coltura normale in una provetta da centrifuga da 50 ml. Quando si utilizzano più celle, aumentare i volumi e le quantità di reagenti proporzionalmente. Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule coltivate in terreno pesante o leggero medio (5 x 10 7 cellule ciascuno) e dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule.
- Aggiungere 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di sospensione cellulare (concentrazione finale 1%) e incubare a 37 ° C per 5 min. Per le cellule aderenti, correggere direttamente le cellule in coltura con l'aggiunta di 810 ml di formaldeide al 37% a 30 ml di terreno di coltura.
- Fermare la reticolazione con l'aggiunta di 3,1 ml di 1,25 M soluzione di glicina (concentrazione finale 127 mm), eincubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Raccogliere le cellule per centrifugazione (300 xg per 5 minuti a 4 ° C). Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in un flacone di scarico adeguato.
- Per le cellule aderenti, staccare le cellule con un raschietto cellulare e raccolto in un tubo da 50 ml, e raccogliere le cellule, come descritto in questo passaggio.
- Per gli esperimenti SILAC, mescolare le cellule staccate coltivati in terreno pesante o media luce (5 x 10 7 cellule ciascuno), dividere il totale di 1 x 10 8 cellule in 5 provette contenenti 2 x 10 7 cellule e raccogliere le cellule come descritto in questo passo.
- Lavare il pellet con 30 ml di PBS due volte per provetta. Eliminare attentamente il surnatante compresi formaldeide e conservarla in uno spreco appropriata bottle.Handle rifiuti formaldeide secondo le linee guida sulla sicurezza chimica. Le cellule fissate possono essere congelati e conservati a -80 ° C.
4. Preparazione di cromatina (per 2 x 107 cellule)
- Sospendere le cellule fissate in 10 ml di tampone di lisi cellulare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, e 1 × inibitori della proteasi) e incubare in ghiaccio per 10 min.
- Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante.
- Sospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi nucleare (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, 0,5% lauroylsarcosine, e inibitori della proteasi 1x). Incubare in ghiaccio per 10 minuti e vortice ogni 2-3 minuti.
- Centrifugare il campione (830 × ga 4 ° C per 8 min) e scartare con attenzione il surnatante.
- Lavare il pellet in 10 ml di PBS. Il pellet (frazione cromatina) può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido.
5. Sonicazione di cromatina (a 2 x 10 7 cellule)
- Sospendere la frazione cromatina in 800 ml dimodificato tampone di lisi 3 (10 mM Tris (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% sodio desossicolato, 0,1% SDS, e 1x inibitori delle proteasi) e trasferire in una provetta da 1,5 ml.
- Sonicare la cromatina utilizzando un sonicatore (vedi Materiali) e le seguenti condizioni: Uscita: 3; dovere: 100% (continuo); e il tempo libero. Eseguire 10-18 cicli di sonicazione per 10 sec e raffreddamento in ghiaccio per 20 sec. Per evitare un eccessivo riscaldamento, incubare i campioni in ghiaccio per 2 minuti ogni 5-6 cicli. Per evitare la formazione di schiuma, mantenere la posizione della punta della sonda sonicazione 0,5 cm sopra il fondo della provetta.
- Centrifugare il campione a (16.000 xg a 4 ° C per 10 min) e trasferire il surnatante in una provetta da 1,5 ml. La cromatina sonicato può essere conservato a -80 ° C dopo immediatamente congelati in azoto liquido.
6. Valutazione di cromatina frammentazione
- Mescolare 10 ml di cromatina frammentata con 85 ml di acqua distillata.
- Aggiungere 4 ml5 M di NaCl e incubare a 65 ° CO / N.
- Aggiungere 1 ml di 10 mg / ml RNasi A e incubare a 37 ° C per 45 min.
- Aggiungere 2 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ml di 1 M Tris (pH 6,8), e 1 ml di 20 mg / ml proteinasi K, e incubare a 45 ° C per 1,5 ore.
- Separati 10 microlitri del campione mediante elettroforesi in gel di agarosio all'1% che non contiene coloranti colorazione come SYBR Green.
- Macchia il gel per valutare la distribuzione delle lunghezze della cromatina frammentata. Le condizioni che generano una lunghezza media di 0,5-2 kbp (range di 0,2-4 kb) sono raccomandati.
- Purificare il DNA da campioni rimanenti mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato come DNA di ingresso per stimare le rese di analisi enChIP (vedi 8.11).
7. Preparazione di Dynabeads Coniugato con anticorpi (per 2 x 10 7 cellule)
- Prepare due provette da 1,5 ml, uno per pre-compensazione utilizzando IgG normale mouse e l'altra per l'incubazione con l'anticorpo anti-FLAG Ab. Aggiungere 150 ml di proteine sfere magnetiche G-coniugato (vedi Materiali) ad ogni provetta.
- Porre i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando.
- Sospendere le perline in 1 ml di PBS contenente 0,01% Tween-20 (PBS-T). Porre i tubi su un supporto magnetico e attendere per 2 min. Eliminare il surnatante pipettando, e quindi ripetere il passaggio.
- Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T contenente 0,1% BSA.
- Aggiungere 15 mg di IgG di topo normale o anti-FLAG Ab e ruotare a 4 ° CO / N.
- Spin down brevemente, quindi posizionare i tubi su un supporto magnete e attendere 3 minuti. Scartare il surnatante pipettando.
- Sospendere le perline in 1 ml di PBS-T. Invertire più volte campione e spin down brevemente. Porre i tubi su un supporto magnete e attendere per 3 minuti, poi scartare il surnatante pipettando. Ripetere il lavaggioaltre due volte con PBS-T (totale di tre fasi di lavaggio).
8. Immunoprecipitazione della cromatina (a 2 x 10 7 cellule)
- Mescolare la cromatina frammentata preparato in 5.3) (circa 800 ml) con un quinto del volume (circa 200 ml) di tampone di lisi 3 modificato contenente 5% Triton X-100 (concentrazione finale di 1% Triton X-100).
- Aggiungere la soluzione cromatina al tubo in cui proteine G-coniugati biglie magnetiche coniugate con IgG normale del mouse sono stati preparati. Ruotare a 4 ° C per 1 ora.
- Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min.
- Trasferire il surnatante nel tubo in cui proteine G-coniugati biglie magnetiche coniugati con anti-FLAG Ab sono stati preparati. Ruotare a 4 ° CO / N.
- Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando.
- Sospendere le perline in 1 ml di tampone salino basso (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) e ruotare a 4 ° C per 5 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Scartare il surnatante pipettando e ripetere la fase di lavaggio.
- Lavare le perline con tampone di sali (20 mM Tris (pH 8,0), EDTA 2 mM, NaCl 500 mM, 1% Triton X-100, 0,1% SDS inibitori della proteasi, e 1x) due volte.
- Lavare le perline con tampone LiCl (Tris 10 mM (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% sodio desossicolato, e inibitori della proteasi 1x) due volte.
- Lavare le perline con TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% inibitori IGEPAL CA-630, e 1x proteasi) una volta.
- Sospendere le perline in 200 ml di tampone di eluizione (Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, 0,1% IGEPAL CA-630, inibitori della proteasi 1x e 500 mcg / ml 3 × FLAG peptide) e incubare a 37 ° C per 20 min. Posizionare il tubo su un supporto magnete e attendere per 3 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e ripetere il Elution passo.
- Purificare DNA da piccola porzione (ad esempio, 5%) dell'eluato mediante estrazione con fenolo-cloroformio o usando un kit di estrazione del DNA (vedi Materiali). Il DNA purificato può essere utilizzato per PCR con primer specifici imposta per stimare le rese di enChIP analisi confrontando con DNA ingresso preparata al punto 6.7 come descritto in precedenza 14,16.
9. SDS-PAGE, colorazione, e analisi spettrometrica di massa
- Mescolare l'eluato (400 microlitri) con 1 ml di 2-propanolo, 50 ml di 3M acetato di sodio (pH 5,2), e 5 ml di 20 mg / ml di glicogeno. Precipitare la cromatina a -20 ° CO / N.
- Centrifugare il campione (16.000 xg a 4 ° C per 30 min) e scartare il surnatante. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70% e centrifugare di nuovo (16.000 xg a 4 ° C per 10 min). Eliminare il surnatante completamente pipettando.
- Sospendere il pellet in 40 ml di tampone 2x campione (125 mM Tris (pH 6,8), il 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% di saccarosio, e 0,004% blu di bromofenolo). Vortex per 5 minuti per sciogliere completamente il pellet, e poi incubare a 100 ° C per 30 minuti per denaturare le proteine e invertire la reticolazione.
- Per SDS-PAGE, eseguire 40 ml di campione sul gel finché il colorante raggiunge 1 cm sotto il pozzo. Nota: Usiamo solitamente 4-20 gel% di pendenza, ma altri gel% può essere utilizzato.
- Colorare il gel con Coomassie Brilliant Blue o macchia d'argento.
- Tagliare il gel in cinque pezzi (2 mm) di altezza.
- Eseguire la digestione gel e spettrometria di massa come descritto in precedenza 13-16.
- Per gli esperimenti SILAC con 5 x 10 7 cellule ciascuna (totale di 1 x 10 8 cellule), sospendere pellet dagli iniziali cinque tubi in 40 ml di tampone 2x campione (non è necessario scalare).
10. Purificazione di RNA e l'RNA-Seq Analisi
- Per purificare l'RNA dopo enChIP, aggiungere 5 U / ml di RNase Inhibitor (seMateriali e) a tutte le soluzioni tampone, tranne modificato lysis buffer 3 e il tampone di eluizione, a cui aggiungere 40 U / ml di RNasi Inhibitor.
- Mescolare l'eluato (400 ml) con 16 ml di NaCl 5 M e incubare a 65 ° C per 2 ore.
- Aggiungere 1 ml di reagente acido-guanidinio-base-fenolo (vedi Materiali) al campione. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 5-15 min. Centrifugare il campione per 15 minuti a 12.000 xg e RT.
- Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1,5 ml e aggiungere 5 ml di p-bromoanisole. Vortex per 15 secondi e poi incubare a temperatura ambiente per 3-5 minuti. Centrifugare il campione per 10 minuti a 12.000 xg e RT.
- Trasferire il surnatante (circa 1 ml) in un nuovo tubo 2 ml e aggiungere 1 ml di 2-propanolo. Capovolgere la provetta e incubare a temperatura ambiente per 10 min. Caricare il composto su una colonna in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali). Centrifugare colonna per 1 min a 12.000 × g e RT.
- lavaggiola colonna con 400 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali).
- Aggiungere 80 ml di DNasi I cocktail (miscela di 5 ml di DNasi I (1 U / ml), 8 ml di 10 × DNasi I tampone di reazione, 3 ml di acqua priva di RNasi DNase /, e 64 ml di RNA tampone di lavaggio in un kit di purificazione dell'RNA (vedi Materiali)) per la colonna. Incubare il campione a 37 ° C per 15 minuti, quindi si centrifuga per 30 sec a 12.000 xg e RT.
- Lavare la colonna con 400 ml di RNA prelavaggio tampone in un kit di purificazione di RNA (vedi Materiali) due volte.
- Eluire l'RNA con 50 ml di acqua / RNasi-free DNasi. L'RNA eluito può essere utilizzato per il sequenziamento RNA.
Representative Results
Complessivamente, 1-30% del bersaglio regioni genomiche può essere purificato usando enChIP. Figura 3 include dati rappresentativi che mostrano le rese di enChIP le analisi di targeting telomeri e il promotore del interferone (IFN) regolamentazione factor-1 (IRF-1) gene. Come esempi di risultati tipici, tabella 1 elenca le proteine associate al IRF-1 promotore in maniera IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC, Tabella 2 elenca le proteine-telomeri legame individuati dalla enChIP combinata con la spettrometria di massa (enChIP-MS) , e Tabella 3 elenca le RNA associati a telomeri identificate da enChIP-RNA-Seq.
Figura 1. Panoramica enChIP. enChIP utilizzando CRISPR (A, B) e TAL (C, D, E Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Sequenza di gBlock. Il promotore U6 (in nero), il G nucleotide brima la sequenza di guida (in blu), viene mostrata la sequenza di guida (gRNA distanziatore) (in rosso), la sequenza di ponteggio (in verde), e la sequenza di terminazione (in arancione).
Figura 3. I rendimenti di analisi enChIP rappresentante. Ingressi (A) percentuale per l'obiettivo di IRF-1 locus e la non bersaglio Sox2 locus. Ingressi (B) percentuali per i telomeri bersaglio e non bersaglio gamma-satelliti. Le cifre sono state adattate e modificato da precedenti pubblicazioni 15,16.
| Categorie | Proteine |
| Trascrizione | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo omologo, PURβ, attivato RNA polimerasi II trascrizionale attivatore p15, BTF3, Myb vincolanteproteina 1A |
| Histone deacetilazione, componenti corepressor | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| Acetiltrasferasi | Proteine arginina N-metiltransferasi 1 |
| DNA topoisomerasi | DNA topoisomerasi 2α |
| Istoni | Histone H2A.Z, istone H3.2 |
Tabella 1:. Esempi di proteine associate con la IRF-1 promotore umano in modo IFNγ specifica identificata dai enChIP-SILAC La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente 16.
| Categorie | Proteine |
| Proteine telomeri legame mammiferi | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| Telomere-biproteine nding nel lievito o altri organismi | IMP4 |
| Le proteine che interagiscono con telomeri vincolante proteine [proteina telomeri legame associato] | DNA polimerasi α (POLA1) [Cdc13p], ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1], exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1], exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT] |
| Le proteine localizzando a heterochromatin | BEND3 |
| Le proteine che regolano segnali epigenetici | KDM5C |
| Le proteine le cui mutazioni influenzare la funzione dei telomeri | Α DNA polimerasi (POLA1), hat1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutammato-cisteina ligasi, glutaredossina, SMRC1 |
Tabella 2:. Esempi di proteine associate con telomeri del mouse identificate da enChIP-MS La tabella è stata adapted da una pubblicazione precedente 15.
| Categorie | RNA |
| Componenti della telomerasi | TERC, RMRP |
| Telomeric RNA | Terras |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
Tabella 3: Esempi di RNA associati a telomeri del mouse identificate da enChIP-RNA-Seq La tavola è stato ricavato da una pubblicazione precedente 17..
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Takeda Science Foundation (TF); la Fondazione Asahi Glass; Memorial Foundation Uehara (HF); il Kurata Memorial Hitachi Fondazione Scienza e Tecnica (TF e HF); Grant-in-Aid per giovani scienziati (B) (# 25.830.131), Grant-in-Aid per la ricerca scientifica (C) (# 15K06895) (TF); e Grant-in-Aid per la ricerca scientifica su 'Trascrizione Cycle' settori innovativi (# 25.118.512 & # 15H01354), Grant-in-Aid per la ricerca scientifica (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid per la ricerca esplorativa ( # 26650059) e 'Genome Support' (# 221S0002) (HF) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia del Giappone.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
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