Introduction
وتوسط في تبادل المواد الغذائية والغازات والنفايات أثناء الحمل eutherian عن طريق المشيمة. في الجهاز التناسلي للأنثى، وشرايين الرحم هي القنوات الرئيسية من الدم إلى الرحم. بعد الزرع، هذه الفروع إلى سفن متخصصة تسمى الشرايين الحلزونية التي فائف من خلال القاعدي الساقط نحو وحدة جنيني مشيمي. قطر ومرونة هذه الشرايين الحلزونية، التي تحيط بها الكريات البيض، وبخاصة القاتلة الطبيعية الرحم (UNK) الخلايا، تملي حجم وسرعة الدم المتاح للالمشيمة 1،2. تغييرات الدورة الدموية الصحيحة نتيجة لإعادة الشرايين الحلزونية هي حاسمة لنجاح الحمل.
في حين أن الآليات الكامنة وراء تختلف في التفاصيل بين الإنسان والحمل الفئران، والنتيجة النهائية لعملية إعادة عرض في كلا النوعين هي المتوسعة، وارتفاع الأوعية الدموية تصرف أن يفقد طبقة من العضلات الملساء. في الفئران، UNK الإنترفيرون الخلايا المشتقة من (IFN-) γ ضروري للحث على هذه التغييرات في حوالي منتصف الحمل 3-5. الفئران التي تفتقر إما خلايا NK أو مكونات IFN-γ يشير مسار تفشل للخضوع لهذه التغييرات وهذا يترافق مع انخفاض 6،7 نمو الجنين، مشددا على أهمية وجود تدفق الدم الكافي إلى وحدة جنيني مشيمي. خلال فترة الحمل البشري في وقت مبكر، وغزو الخلالي واللف من الأرومة الغاذية extravillous وتفاعلها مع الخلايا UNK مهمة لإحداث تغييرات الأوعية الدموية وتعزيز 10/8 نمو الجنين. خلايا UNK يمكن أن تنسق غزو الأرومة الغاذية البشري من خلال كيموكينات 11 والسيتوكينات مثل محببة بلعم - مستعمرة عامل تحفيز (GM-CSF) 12. ويرتبط غزو الأرومة الغاذية الضحلة مع انخفاض إعادة الشرايين ومضاعفات الحمل مثل تسمم الحمل 9.
ويستند هذا البروتوكول على العمل الرائد آن كروي الذي وصف مهمةدور جهاز المناعة، وبخاصة NK المستمدة من IFN-γ لنجاح إعادة الأوعية الدموية من خلال المناعية ونقل التجارب أنيقة 5،13. نحن هنا وصف طريقة سريعة واقتصادية لتقييم حالة إعادة الشرايين الحلزونية. على الرغم من مختبرنا يقيم هذا بشكل روتيني في منتصف الحمل (الحمل اليوم (GD) 9.5) 14، فإن عملية إعادة تجري بين gd8.5 و 12.5 15. ظهور الماسحات الضوئية الشريحة الآلي سهلت كثيرا عملية تقييم المناطق السفينة والتجويف من أقسام ووجدنا أن يكون نهجا أكثر استنساخه من قياس أقطار السفينة. إضافة كشف المناعى من SMA تسمح التحقق من صحة واضحة للنتائج التي تم الحصول عليها من تقييم stereological. كما هو الحال مع جميع التقنيات stereological، فمن المستحسن لأداء تقييم كتجربة أعمى من قبل اثنين على الأقل الممتحنين. تحقيقا لهذه الغاية، ويمكن إدخال خطوة العشوائي عندما اخترق متسلسلتينغ العينات بحيث المحققين تقييم الشرائح لا يعرفون من الذي المجموعة التجريبية العينات تأتي.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير أداة يمكن الاعتماد عليها لتقييم دقيق لإعادة الشرايين الحلزونية في الفئران مع تعريف الأنماط الجينية الأم والأب، في سياق نماذج الماوس لمضاعفات متعلقة بالحمل. النتائج تؤكد الاعتماد على الخلايا UNK من هذه العملية، وهو أمر ضروري لنمو الجنين الطبيعي.
Protocol
جميع الإجراءات التي تمت مناقشتها في هذه المخطوطة هي وفقا للوائح وزارة الداخلية في المملكة المتحدة والتي وافقت عليها لجنة المراجعة الأخلاقية كامبريدج.
1. جمع العينات
- إنشاء التزاوج توقيتها باستخدام 8-12 اسبوع الإناث C57BL / 6 الفئران مع الذكور البالغين (تصل إلى 2 الإناث في الذكور) في فترة ما بعد الظهر. تحقق من وجود المقابس المهبلية كعلامة على الجماع في الصباح في الأيام التالية في وقت مبكر. وجود سد العجز في gd0.5 علامات الصباح.
- على gd9.5، الموت ببطء الحيوانية خلع عنق الرحم وفتح تجويف البطن. لاحظ أن القتل الرحيم التي كتبها CO 2 قد تسبب توسع الأوعية.
- استخدام خيط تنظيف الأسنان لligate بلطف شرايين الرحم (الشكل 1، السهام متقطع). ربط الخيط حول الشرايين في طرف كل قرن الرحم، الأقرب إلى المبايض، وكذلك حول عنق الرحم.
ملاحظة: لا تمزق الأوعية لأن هذا قد يؤدي في الشرايين انهارت. <لى> تشريح الرحم بسرعة باستخدام مقص تشريح، استئصال الرحم كله بشكل أقصى للنقاط ربط ثلاثة على غيض من قرون الرحم وعنق الرحم. - وضع الرحم على قطعة البوليسترين استعداد بحيث يتم محاذاة كل من قرون على نفس المحور الطويل في اتجاهين متعاكسين من عنق الرحم. تمتد برفق ويعلقون في مكانها باستخدام 2-3 25 الإبر G.
- تزج البوليسترين إلى إعداد 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. أعلى تصل إلى 50 مل مع 10٪ من الفورمالين. إصلاح لمدة 5-6 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- تجاهل الحل الفورمالين واستبدالها مع 50 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 5 دقائق.
- استئصال قرني الرحم بشكل قريب إلى نقطة ربط في نهاية كل وقريب لعنق الرحم في وسط، وتقليم بعيدا أي الدهون الزائدة حول مواقع الزرع ويغسل مرتين في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لإزالة آثار الفورمالين.
- تخزين العينات في الايثانول 70٪ في 4 درجات مئوية (لمدة تصل إلى أسبوعين) حتى المعالجة.
تنبيه: إيثأنول غير قابلة للإشتعال. - استخدام نظام المعالجة الآلية باستخدام المعلمات مبين في الجدول 1. تضمين قرون فردي في البارافين بحيث يمكن قطع على طول الطائرة عمودي على محور طويل من الرحم. هذا يضمن أن المساحة القصوى من كل موقع زرع سوف يتعرض للتحليل في وسط كتلة (الشكل 2A).
اختياري: هذا هو نقطة زمنية مريحة للالتوزيع العشوائي للكتل إذا رغبت في ذلك. - باستخدام مشراح، وقطع الأجزاء المتسلسلة من 7 ميكرون من سماكة الكتل. وصمة عار قسم واحد في كل فاصل زمني 49 ميكرون مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E، انظر القسم 2.1). تخزين المقاطع المتبقية في درجة حرارة الغرفة لSMA تلطيخ والتطبيقات الإنتاجية الأخرى.
| حل | مرة | درجة الحرارة |
| 70٪ من الإيثانول | 1 ساعة | 40 ° C |
| الإيثانول بنسبة 100٪ | 1 ساعة | 40 ° C |
| الإيثانول بنسبة 100٪ | 1 ساعة | 40 ° C |
| الإيثانول بنسبة 100٪ | 1 ساعة | 40 ° C |
| الإيثانول بنسبة 100٪ | 1 ساعة | 40 ° C |
| الإيثانول بنسبة 100٪ | 1 ساعة | 40 ° C |
| الإيثانول بنسبة 100٪ | 1 ساعة | 40 ° C |
| 1 ساعة | 40 ° C | |
| زيلين | 1 ساعة | 40 ° C |
| زيلين | 1 ساعة | 40 ° C |
| البارافين | 1 ساعة | 63 ° C |
| البارافين | 1 ساعة | 63 ° C |
| البارافين | 1 ساعة | 63 ° C |
| البارافين | 1 ساعة | 63 ° C |
الجدول 1: إعدادات لمعالجة الأنسجة الآلي لمحة عامة عن الإعداد المستخدم لمعالجة أنسجة الرحم
2. خاءتقييم eological
- H & E تلطيخ
- Deparaffinize أقسام بغمر الشرائح التي شنت في رفوف الشريحة إلى 100٪ حمام الزيلين لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: الزيلين غير قابلة للاشتعال ومسرطنة يشتبه التي هي سامة من خلال الاتصال والاستنشاق. ويجب إجراء هذا العمل في غطاء الدخان، وذلك باستخدام معدات الوقاية الشخصية (PPE). - تزج الشرائح في حمام يحتوي على زيلين نظيفة لمدة 10 دقيقة أخرى.
- بالتتابع تزج الشرائح في الحمامات تحتوي على 100٪ من الإيثانول و 95٪ من الإيثانول و 70٪ من الإيثانول والماء النقي لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- تزج الشرائح في 50٪ جيل لا 3 الهيماتوكسيلين الحل، المخفف بالماء النقي لمدة 5 دقائق.
تنبيه: الهيماتوكسيلين هو ضار عن طريق الابتلاع أو الاتصال على العينين. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع. - تغسل الشرائح في حوض تلطيخ تحت الماء الجاري الصنبور لمدة 10 دقيقة.
- تزج الشرائح في 1٪ من محلول حمض / كحول (1٪ 10 M حمض الهيدروكلوريك في الايثانول 70٪) لمدة 10 ثانيةوتغسل في حوض تلطيخ تحت الماء الجاري الحنفية.
- تزج الشرائح في حل يوزين لمدة 30 ثانية، وأغسلها في حوض تلطيخ تحت الماء الجاري الصنبور لمدة 10 دقيقة.
- داخل غطاء الدخان، تزج بالتتابع الشرائح في الحمامات التي تحتوي على 70٪ من الإيثانول و 95٪ من الإيثانول و 100٪ من الإيثانول لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- تزج الشرائح في حمام تحتوي على الزيلين لمدة 10 دقيقة.
- جبل coverslips باستخدام المتوسطة المتزايدة على أساس زيلين. تجف أفقيا وبصورة شاملة في غطاء الدخان قبل تصور الشرائح تحت المجهر.
- Deparaffinize أقسام بغمر الشرائح التي شنت في رفوف الشريحة إلى 100٪ حمام الزيلين لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تقييم Stereological من سفينة الحجم وإعادة عرض الحالة
- لكل موقع الزرع، وتحديد المقاطع التي هي قريبة من نقطة السهمي النصفي. المرفق مشيمائي بين الجنين والمشيمة النامية بمثابة مؤشر جيد على نقطة السهمي النصفي.
- حدد 3 أقسام في 49 ميكرون فترات متقاربة لدرجة السهمي النصفي للتحليل. مسح الشرائح المحددة. من أجل تجنب المؤتمر الوطني العراقيluding الأوردة، والتي ثبت أن يكون موجودا أكثر محيطيا في مواقع غرس 16، وتقييد التحليل على وسط 2/4 من كل موقع زرع (الشكل 2A).
- لتقييم حجم التجويف، رسم حول الداخل من السفن وتسجيل مساحة هذا الشكل. بالنسبة إلى مجموع حجم السفينة، رسم حول الجدار الخارجي للسفينة، بما في ذلك الخلايا البطانية، pericytes والكريات البيض جماعية.
ملاحظة: نسبة من إجمالي حجم السفينة إلى التجويف هو وكيل لمركز إعادة السفينة. كما الأوعية فائف من خلال الطائرة التي تم قطع الجزء طول، قد يكون هناك عدة المقاطع العرضية من نفس الشريان في شريحة واحدة. تجنب قياس نفس الشريان عدة مرات. - تسجيل القياسات من 5 السفن في كل موقع زرع مع أكبر ومستدير شمعة. قياس كل موقع زرع في ثلاث نسخ (ثلاثة أقسام متباعدة 49 ميكرومتر بعيدا عن بعضها البعض). وتعني هذه القياسات 15 represeNTS قطر متوسط من أكبر السفن.
- لتجنب كثرة عدد السفن الأكبر حجما في بعض العينات، وقياس نفس العدد من السفن في كل موقع الزرع.
3. التقييم النوعي عن طريق المناعية
- Deparaffinization والإماهة
- Deparaffinize أقسام بغمر الشرائح التي شنت في رفوف الشريحة عازل للحرارة إلى 100٪ حمام الزيلين لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تزج الشرائح في حمام يحتوي على زيلين نظيفة لمدة 10 دقيقة أخرى.
- بالتتابع تزج الشرائح في الحمامات تحتوي على 100٪ من الإيثانول و 95٪ من الايثانول و 70٪ والماء النقي لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- مستضد استرجاع
- إعداد 10 ملي العازلة سيترات الصوديوم في الماء النقي وضبط درجة الحموضة إلى 6 باستخدام 10 M حمض الهيدروكلوريك.
- ملء وعاء عازل للحرارة التي يمكن أن تعقد 600 مل ب 400 مل الصوديوم العازلة سترات وضعها في طنجرة الضغط الداخلي الذي يحتوي وات كافيةإيه لغرق نصف الحاوية. نعلق فضفاضة غطاء طنجرة الضغط والحرارة حتى الغليان.
- وضعت من الانزلاق الى المنطقة العازلة سيترات الصوديوم وبإحكام إصلاح غطاء طنجرة الضغط. مرة واحدة الضغط، والسماح ليغلي لمدة 3 دقائق.
- أزال الضغط في طنجرة الضغط وإزالة الحاوية الداخلية. تسمح الشرائح لتبرد في المنطقة العازلة سيترات الصوديوم لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الشرائح في حمام يحتوي على ماء النقي لمدة 5 دقائق.
- تطويق الأقسام بمانع القلم مسعور.
- تغسل الشرائح عن طريق غمر في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- حجب الذاتية البيروكسيد وغير محددة وملزمة
- احتضان المقاطع مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين المخفف في الماء النقي في غرفة ترطيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تنبيه: بيروكسيد الهيدروجين هو مهيج جدا للعيون والجلد وعند الابتلاع. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - الاستفادة من فائض محلول بيروكسيد الهيدروجين وغسل سليقصر مرتين من قبل غمر في تريس مخزنة المالحة (TBS) لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- احتضان المقاطع مع الماوس المناعي حظر كاشف من الماوس على عدة الماوس أعدت وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- غسل الشرائح مرتين في TBS لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
- احتضان المقاطع مع 3٪ بيروكسيد الهيدروجين المخفف في الماء النقي في غرفة ترطيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- مناعي من السلس أكتين العضلات
- يعد حل مخفف الأجسام المضادة (المنصوص عليها في عدة)، واحتضان مع المقاطع لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، أو وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- تمييع 1: الأكتين العضلات الملساء 100 الماوس المضادة الإنسان (DAKO M0851) في محلول مخفف الأجسام المضادة. تمييع الماوس IgG2a isotype السيطرة في حل الضد مخفف، وضمان أن تركيز المناعي النهائي تعادل في كل الحلول.
- الاستفادة من حل الضد مخفف والغطاء أقسام الزائدة مع أي المخفف الأجسام المضادة أو نمط إسوي حلول التحكم. احتضان في غرفة مرطب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الشرائح مرتين في TBS ل2 دقيقة لكل منهما.
- تمييع المعقدة البيروكسيديز مكافحة فأر الضد الثانوية واحتضان أقسام لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أو وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
- غسل الشرائح مرة واحدة مع كل TBS وبرنامج تلفزيوني لمدة 2 دقيقة، على التوالي.
- إعداد 3،3'-Diaminobenzidine (DAB) الحل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تغطية الفروع مع حل DAB واحتضان لمدة تصل إلى 4 دقائق، وضمان مراقبة الفروع لتفادي اللون التنمية الزائدة.
تنبيه: DAB غير قابلة للاشتعال ومسرطنة يشتبه التي هي سامة من خلال الاتصال والاستنشاق. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع. - تزج الشرائح في الماء النقي مرة واحدة يتم التوصل إلى كثافة المطلوب من تلطيخ.
- مباين مع 50٪ جيل رقم 3 الهيماتوكسيلين لمدة 20 ثانية، وأغسلها في حوض تلطيخ تحت الماء الجاري الحنفية حتى يعمل الماء واضحة.
- الجفاف وتصاعد
- داخل غطاء الدخان، تزج بالتتابع الشرائح في الحمامات التي تحتوي على 70٪ ETHأنول، 95٪ من الإيثانول والإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- تزج الشرائح في حمام تحتوي على الزيلين لمدة 10 دقيقة.
- جبل coverslips باستخدام المتوسطة المتزايدة على أساس زيلين. تجف أفقيا وبصورة شاملة في غطاء الدخان قبل تصور الشرائح تحت المجهر
Representative Results
Rag2 - / - IL2rg - / - الفئران تفتقر إلى جميع الخلايا الليمفاوية ناضجة، بما في ذلك الخلايا NK 17، وفشل شرايين الرحم لتخضع لتغيرات الأوعية الدموية ينظر في wildtype مسانج C57BL / 6 (WT) الفئران في منتصف الحمل 5،14. ونتيجة لهذا خفض Rag2 إعادة عرض - / - IL2rg - / - أظهرت الفئران مناطق أصغر بكثير اللمعية السطح، مما يدل على السفن عموما الصغيرة التي يمكن تصور على أقسام H & E الملون وكميا stereologically (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، وسمك الجدار النسبي (سفينة إلى نسبة التجويف) هو أعلى في الشرايين الحلزونية في هذه الفئران، مما يشير إلى انخفاض حجم المعروض من الدم وارتفاع سرعة الدم.
وقد أكد هذا التقييم الكمي باستخدام كشف المناعى من SMA. ومن خصائص للفئران WT لتفقد أكثر من SMA في وسائل الاعلام الأوعية الدمويةالشرايين الحلزونية في منتصف الحمل. إذا لم هذه العملية يحركها الخلايا القاتلة الطبيعية تأخذ مكان، لا يزال المتوسط المتحرك في وسائل الإعلام من السفن، ويمكن أن يتم الكشف بسهولة immunohistochemically كما عصابات حول الأوعية الدموية (الشكل 3).
الشكل 1: الفأر الرحم في gd9.5، نظرة عامة التخطيطي الرسم تبين المواقع النسبية للقرون الرحم وعنق الرحم (الأزرق) وشرايين الرحم الرئيسية (الأحمر). وأشار هي محور طويل من قرون الرحم (الأسهم) ونقطة ربط (السهام متقطع). يتم قطع الفروع لالمناعية على طول الطائرة للعرض.
الشكل 2: تقييم Stereological من إعادة الشرايين في منتصف الحمل (A) مثال ASSEssment من اللمعية ومجموع المناطق السفينة على أقسام H & E الملون من الإناث WT في وسط 2/4 من القاعدي الساقط (رسمتها الأسود الرأسي الخطوط المتقطعة) في gd9.5. في السفن في أعلى التكبير، تحطمت على الخط الأحمر ترسم المساحة الإجمالية للسفينة، أصفر خط متقطع ترسم منطقة التجويف. بار = 500 ميكرون (يسار)، 50 ميكرون (يمين). المحور الطويل للرحم هو خط أفقي في هذا التوجه. (B) الكمي من المناطق اللمعية (اللوحة اليسرى) ونسبة المساحة اللمعية إلى مجموع مساحة الأوعية الدموية (اللوحة اليمنى) من WT (C57BL / 6) وRag2 - / - Il2rg - / - الفئران (على C57BL / 6 الخلفية). كل نقطة البيانات تمثل متوسط 15 القياسات (5 القياسات في القسم، 3 أقسام لكل موقع الزرع). الحانات تمثل يعني ن = 11-13 المواقع زرع من 4 حالات الحمل في الجماعة؛ ف قيمة من الذيل يومين، أونبايريد اختبار مان ويتني. WT: wildtype.
الرقم 3: كشف المناعى من الأكتين العضلات الملساء في القاعدي الساقط الممثل SMA تلطيخ على WT (أعلى) وRag2 - / - IL2rg - / - الفئران (على C57BL / 6 الخلفية، أسفل) في gd9.5. بار = 100 ميكرون. WT: wildtype.
Discussion
تم تصميم بروتوكول المعروضة هنا لتوفير طريقة استنساخه التي يمكن من خلالها تقييم التغيرات الأوعية الدموية والتي هي ضرورية لنجاح الحمل. حاسمة لنجاح هذا التقييم هو نوعية المقاطع الأنسجة. كل من تحديد دقيق لعمر الحمل من المواقع الزرع وكذلك ligating موثوق شرايين الرحم هي خطوات حاسمة. التغييرات في المعلمات مثل وقت التثبيت، وبروتوكول معالجة الأنسجة، وما إلى ذلك قد يؤثر أيضا على النتيجة. لتقييم stereological غير منحازة، فمن المهم لقياس نفس العدد من السفن في كل موقع الزرع. فمن المستحسن لقياس 5 سفن في موقع غرس وزرع كل موقع في ثلاث نسخ. وتعني هذه القياسات 15 يمثل حجم متوسط من أكبر 5 سفن.
وبالإضافة إلى البيانات من Rag2 alymphoid - / - IL2rg - / - الفئران المعروضة هنا، وجدنا هذا البروتوكول الاضافيocol مفيدا لعدد من نماذج عدم كفاية الوظيفة المناعية الأمهات، بما في ذلك واحد من الخلايا تحول دون NK 14. كما تبين وجود عيوب في إعادة الشرايين في نماذج من ضعاف غزو الأرومة الغاذية 18 و الأساليب المذكورة هنا قد تكون مفيدة لتقييم الأوعية الدموية في هذه الحالات. نحن الأمثل والتحقق من صحة هذا البروتوكول للتحقيق في ساقطي إعادة الأوعية الدموية في منتصف الحمل في الماوس، وإنما هو أيضا تصور للتكيف مع هذا البروتوكول للعمل في أنظمة أخرى نموذج (مثل الفئران) أو حتى في غيرها من الأجهزة. في حين نجد أن إعادة NK-تعتمد يمكن تقييمها بقوة في gd9.5، فإنه يجوز تعديل للحصول على نقاط زمنية أخرى مثل gd12.5، عندما يتم تشكيلها الأوعية الدموية الأمهات تماما. عند هذه النقطة الزمن، غزو الأرومة الغاذية اللف هو أعمق 16 و قد تكون هذه النقطة وقت أكثر مناسبة للتحقيق في دور الأرومة الغاذية للتغيرات في الأوعية الدموية. وإذا رغبت قراءات كمية إضافية،يمكن للمحققين أيضا أن يزيد من عدد الأقسام الملون لSMA وتقييم نسبة السفن تشكيلها جزئيا داخل كل موقع الزرع.
وجود قيود على هذا البروتوكول هو طبيعة وصفية الامتحانات النسيجية. المقايسات الفنية، ومع ذلك، يتم فقط أصبحت ببطء المتاحة (مثل دوبلر بالموجات فوق الصوتية 19). هذه التقنيات تتطلب خبرة فنية ونفقات أعلى بكثير للحصول على المعدات وصيانتها، ولكن لديها ميزة توفير طولية في الجسم الحي قراءات لتأثير التغيرات التي يمكن ملاحظتها تشريحيا. والعيب ممكن لجميع الامتحانات stereological هو الذاتية للمحققين. تحقيقا لهذه الغاية، وذلك باستخدام اثنين من الممتحنين مستقل لتحليل جميع العينات بشكل مستقل يمكن أن تساعد على تجنب هذه المشكلة. في حين أن البروتوكول المذكورة هنا يعطي نظرة ثاقبة كيف الكثير من الدماء يمكن أن تصل إلى واجهة الدم الجنيني للأم، قد يكون من المفيد أن الجمع بين ذلك مع مجمعات للنهج ementary تقييم المبلغ الإجمالي من الدم في أي وقت من الأوقات في الأوعية الدموية من خلال البلاستيك يلقي 16.
قوة من هذا البروتوكول هو أنه يجمع بين نهجين مستقلة. وأول تقييم التغيير الأوعية الدموية كميا بواسطة التجسيم ومن ثم يتم التحقق من صحة نتيجة نوعيا باستخدام المناعية. موثوقية النتائج التي يمكن زيادة تعزيز العشوائي للعينات. يمكن بسهولة العينات التي أعدت لهذا البروتوكول أن تستخدم أيضا للتحقيق في غيرها من المعالم الحمل مثل decidualisation والتنمية من مجموع اللمفاوية mesometrial من الحمل (MLAp) أو مناعي من خلايا الفائدة، لتقييم صارم النمط الظاهري الحمل في midgestation.
إعادة الشرياني هو خطوة حاسمة لحالات الحمل غير معقدة في النساء وفشل هذه التغييرات هي أساس المتلازمات كبيرة التوليد (السودانية)، وهي ما قبل تسمم الحمل، وتقييد نمو الجنين وولادة جنين ميت. نقدم هنا تقنيات لتقييم بعناية النمط الظاهري الحمل في نماذج الماوس التي تحاكي بعض خصائص الفيزيولوجيا المرضية لحكومة السودان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice (8-12 weeks old) | Charles River | ||
| Dental floss | |||
| Polystyrene | Used for holding tissue in place | ||
| Straight dissection scissors | EMS | 72940 | |
| 25 G needles | BD | 300600 | Used for holding tissue in place |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P3813-10PAK | |
| Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | |
| Paraffin | Sigma | 327204-1KG | |
| Xylene | Fisher Scientific | X/0250/17 | |
| Automated tissue processor | Sakura | 6032 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Slide rack | Sigma | Z710989 | |
| Coplin jar | Sigma | S5891 | |
| Purified water | |||
| Hematoxylin solution, Gill No. 3 | Sigma | GHS332-1L | |
| Eosin Y solution | Sigma | HT110116-500ML | |
| Fume hood | |||
| Xylene-based mounting media | VWR | 361254D | |
| Slide scanner | Hamamatsu | NanoZoomer | |
| Slide scanner software | Hamamatsu | NDP viewer | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma | 32320 | Make 10 mM solution and adjust pH to 6 |
| Pressure cooker | Used for antigen retrieval | ||
| Heating plate | Used for antigen retrieval | ||
| Hydrophobic barrier pen | Vector | H-4000 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H/1800/15 | |
| Tris buffered saline | Sigma | T6664-10PAK | |
| Mouse on mouse kit | Vector | BMK-2202 | Significantly reduces background |
| Mouse anti-human smooth muscle actin | DAKO | M0851 | Cross-reacts with mouse |
| IgG2a isotype control | DAKO | X0943 | |
| Humidified chamber | Sigma | H6644 | |
| 3,3’-Diaminobenzidine solution | Sigma | D4293-5SET | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | H/1050/PB17 |
References
- Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies. Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy. Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).
- Ashkar, A. A., Croy, B. A. Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy. Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).
- Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).
- Ashkar, A. A., et al. Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy. J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).
- Barber, E. M., Pollard, J. W. The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection. J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).
- Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. How does variability of immune system genes affect placentation. Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).
- Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I.
- Colucci, F., Kieckbusch, J. Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus. Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).
- Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
- Xiong, S., et al. Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation. J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).
- Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. Analysis of uterine natural killer cells in mice. Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).
- Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling. Nat Commun. 5, (2014).
- Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth. Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).
- Adamson, S. L., et al. Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta. Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).
- Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation. J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).
- Hu, D., Cross, J. C. Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta. Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).
- Zhang, J. H., Croy, B. A. Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice. Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).
