Introduction
Igualdad de segregación del genoma durante la división celular requiere interacciones correctas entre el ADN y el huso microtúbulos replicados. Los microtúbulos interactuar físicamente con los cromosomas a través de un conjunto de proteínas que se reúne en centrómeros conocido como el cinetocoro 1. Distribución correcta de los cromosomas requiere que cinetocoros hermanos se biorientado, en el que cada hermana se asocia con los microtúbulos procedentes de polos del huso opuestas. Microtúbulos cinetocoro (kt-MT) archivos adjuntos que no están en la conformación biorientado se forma rápida y eficiente desestabilizó para proporcionar la oportunidad de establecer biorientación en un proceso conocido como la corrección de errores. Un ensayo de corrección de errores que se estableció previamente en células de mamífero requiere el montaje de los husillos 5 monopolares usando inhibidores de moléculas pequeñas reversibles contra Eg5 (kinesin-5). El tratamiento de la droga genera una multitud de archivos adjuntos syntelic erróneas en las que botcinetocoros h hermanas se unen al mismo polo del huso. Un lavado posterior de la droga permite la visualización del proceso de corrección de errores. El ensayo de corrección de errores se puede realizar en presencia de inhibidores de moléculas pequeñas o caídas para estudiar la contribución de las proteínas candidatas a corregir erróneas adjuntos kt-MT.
La capacidad de visualizar la corrección de errores en las células vivas es una poderosa herramienta para comprender mejor el mecanismo molecular implicado en este proceso complejo. Sin embargo, el gran número de cromosomas presentes en la mayoría de líneas celulares plantea un reto en la observación de los archivos adjuntos individuales kt-MT. Células Drosophila S2 serían ideales para aplicar el ensayo de corrección de errores, ya que contienen tan pocos como 4 cromosomas 6, pero inhibidores de molécula pequeña de kinesin 5 tales como S-tritil-L-cisteína (STLC) y monastrol 7-9 no afectan conjunto del husillo o la función motora kinesin-5 en células de Drosophila. Por lo tanto, génerosted una línea de células de Drosophila S2 expresando kinesin-5 humana bajo un promotor inducible que es sensible a los inhibidores de kinesina-5. Este protocolo se describe cómo la caída endógena Drosophila kinesin-5 homólogo, KLP61F, y el uso de esta línea celular en el ensayo de corrección de errores basado en células.
Protocol
1. transfectar células S2
- Desde un cultivadas previamente matraz de 25 cm 2, añadir células GFP-alfa-tubulina-expresión de S2 10 a un volumen final de 2 ml a 100% de confluencia, y les permiten semi-adherirse a la parte inferior de una 35 mm placa de cultivo de tejidos para aproximadamente 1 hr.
- Retire el soporte de la antena. Transfectar 2 g de la Eg5-mCherry construir 11 con 1 ml de medio de Schneider suplementado con 10% FBS (denominado en lo sucesivo como medios de Schneider) y reactivo de transfección, siguiendo el protocolo del fabricante. Sellar el plato con Parafilm y se incuban las células a 25 ° C durante 16-18 horas.
- Añadir 1 ml de medio de Schneider. Células Regreso a 25 ° C incubadora.
- El día 3 después de la transfección, transferir 500 l de células transfectadas en un nuevo 35 mm placa de cultivo de tejido que contiene 1,5 ml de medio de Schneider para una inducción de prueba. Inducir la expresión de Eg5-mCherry mediante la adición de CuSO 4
- Para hacer cubreobjetos A recubierto concanavalina, pipeta suficiente volumen de concanavalina Una solución (0,5 mg / ml disuelto en H 2 O) para cubrir un ácido lava cubreobjetos, eliminar el exceso, y permitir que el cubreobjetos se seque al aire.
- Colocar un 22 mm x 22 mm concanavalina A-recubierto cubreobjetos en un lugar limpio 35 mm placa de cultivo tisular, a continuación, las semillas 500 l en 100% de confluencia de las células inducidas en el cubreobjetos y permitir que las células se adhieran durante 1 hora a RT.
- Para comprobar si la expresión Eg5-mCherry, montar el cubreobjetos en una cámara de rosa (o embarcación de imagen apropiado) con los medios de comunicación para obtener imágenes a temperatura ambiente en un microscopio de fluorescencia. Utilice fuentes de luz adecuadas y conjuntos de filtros para visualizar las células. Por ejemplo, el microscopio usado en este estudio tiene una fuente de luz blanca LED y EGFP (FITC / Cy2) y DsRed (TRITC / Cy3) cubos de filtros. Eg5-mCherry localiza a los microtúbulos y se enriquece neapolos r husillo.
- Después de asegurarse de que las células están expresando tanto Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina, transferir el resto de las células no inducidas, transfectadas a un 25 cm 2 matraz de cultivo tisular que contiene 4 ml de medio de Schneider.
- Añadir Blasticidin S HCl a una concentración final de 25 mg / ml al matraz de células transfectadas y continuar la división en la presencia de / ml S HCl Blasticidin 25 g hasta la muerte celular deja de ser seguro de comprobar para la expresión de Eg5-mCherry periódicamente. Incubar líneas celulares en 25 ° C incubadora.
NOTA: El porcentaje de células que expresan los aumentos Eg5-mCherry lo largo del tiempo. - Una vez que las células son transfectadas de forma estable, continúe para dividir en ausencia de fármaco y congelar 12 células para uso futuro.
2. ARN de interferencia
- PCR amplificar una región pb ~ 500 de KLP61F de ADNc (LD15641) usando el cebador con adición de secuencia del promotor T7 (secuencia proporcionada en la Lista de Materiales) para serutilizado como una plantilla para la síntesis de dsRNA.
- Establecer cuatro reacciones de PCR, 50 l cada uno, conteniendo 100 ng de ADN plantilla, 25 mM de cada cebador, tampón apropiado, y la polimerasa. Ajuste el protocolo de PCR en el termociclador de acuerdo con el protocolo del fabricante de la polimerasa.
- Piscina y limpias cuatro reacciones de PCR utilizando una PCR limpiar kit de acuerdo con el protocolo del fabricante. Guarde la plantilla limpia a -20 ° C.
- Preparar RNA de doble hebra (dsRNA) de la plantilla utilizando un kit de transcripción de ARN T7, siguiendo las instrucciones del fabricante. Esperar ~ concentración de 5-15 mg / ml de ARN de doble cadena. Guarde dsRNA a -20 ° C.
- Para Knockdown KLP61F con dsRNA, permiten que las células S2 expresan Eg5-mCherry al 25% de confluencia semi-se adhieren a la parte inferior de una 35 mm placa de cultivo de tejido durante 1 hora.
- Quite el papel de los platos y añadir 5 g de dsRNA contra KLP61F (Drosophila kinesin-5) diluido en 1 ml de Schneider sin suero 's medios de comunicación.
- Incubar a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, añadir 1 ml de medio de Schneider con 10% de SFB. Se incuban las células a 25 ° C.
- 24 hr después del tratamiento dsRNA, inducir la expresión de Eg5-mCherry mediante la adición de CuSO 4 a una concentración final de 500 mM. Se incuban las células a 25 ° C durante otras 24 hr.
3. Imágenes de células vivas
- Coloque un 22 mm x 22 mm concanavalina A cubreobjetos recubierto en una limpia de 35 mm placa de cultivo de tejidos.
- Seed 500 l de las células que han sido tratadas con dsRNA e inducidos O / N a la concanavalina A cubreobjetos recubiertos y permitir que se adhieran durante aproximadamente 1 hr.
- Montar el cubreobjetos en una cámara de rosa (o recipiente apropiado) para obtener imágenes.
- Encuentra células mitóticas que expresan tanto Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina.
NOTA: Las células mitóticas que expresan sólo GFP-α-tubulina debe tener husos monopolares desde KLP61F, que se requiere para la bipolaridad husillo, es derribado 10,13. - Recoge imágenes time-lapse de husillos bipolares (por ejemplo, 1 cuadro por minuto) en las células que expresan tanto Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina.
- Si bien la imagen, retire el soporte de la cámara de color de rosa, y reemplazarlo con los medios de comunicación de Schneider contiene 1 M STLC más de 3 intercambios consecutivos medios (~ 5 ml en total) en la cámara para visualizar colapso husillo.
- Al lavado por la droga y revertir el colapso de husillo, retire con cuidado los medios de comunicación que contiene STLC-de la cámara de color de rosa, y lavar en medios de Schneider 4x (total de 6.8 ml) antes de rellenar la cámara de rosa por última vez con medio fresco. Continuar formación de imágenes.
4. Error Ensayo Corrección
- Coloque un 22 mm x 22 mm concanavalina A cubreobjetos revestidos en 35 mm placas de cultivo de tejidos limpios.
- Semilla de 500 l de células que han sido tratados con KLP61F dsRNA sobre la concanavalina A cubreobjetos recubiertos y permitir que se adhieran.
- Después las células son ADHERed, añadir 1,5 ml de medio de Schneider a cada plato para llevar el volumen final hasta 2 ml.
- Para detener las células en la mitosis, añadir MG132 a una concentración final de 10 mM a cada uno de los platos, y se incuba durante 1 hr.
- Añadir 1 M STLC e incubar durante 1 hora para permitir que los monopolos se formen.
- Lave la STLC enjuagando cubreobjetos 3 veces con 2 ml de medio de Schneider frescas cada vez.
- Incubar cubreobjetos con medios de Schneider, además de alguna droga farmacológicos (por ejemplo, inhibidores de quinasa Aurora) o DMSO como un control.
Nota: concentraciones de inhibidor varían y concentraciones finales apropiadas deben ser determinados por el experimentador. Las soluciones madre se hacen típicamente de tal manera que el inhibidor se diluye 1: 1000 en medios de comunicación. En este caso una dilución 1: 1000 de DMSO (o disolvente apropiado) sirve como el control del vehículo. Usamos el inhibidor de Aurora B Binucleine 2 a una concentración final de 40 mM. - Fijar las células en diferentes puntos de tiempo to observar la progresión de la formación del huso bipolar y para evaluar los estados de fijación cinetocoro. Arreglar:
- Rápidamente enjuagar los cubreobjetos con 2 ml de 1x BRB-80.
- Fijar las células mediante la adición de 2 ml de 10% de paraformaldehído diluidas en 1x BRB-80 durante 10 min. Pipet paraformaldehído cuidadosamente en una campana química.
- Permeabilizar las células con 2 ml de 1x PBS + 1% de Triton-X para 8 min.
- Lavar los portaobjetos 3x con 2 ml de 1x PBS + 0,1% de Triton-X.
- Transferencia cubreobjetos lado celular boca arriba sobre una lámina de Parafilm (use un marcador para etiquetar Parafilm apropiada para realizar un seguimiento de las diapositivas) en una placa de Petri de 150 mm.
- Cubrir los cubreobjetos con 150 l de suero de burro hervida (BDS) e incubar a temperatura ambiente durante 1 hr para bloquear anticuerpo unión no específica.
Nota: En este caso, el protocolo de fijación se puede detener a continuar en un momento posterior. Los cubreobjetos se pueden almacenar en una cámara de humedad a 4 ° C durante un máximo de 24 hr. Para hacer que la cámara de humedad, alinear el borde de un plato de 150 mmcon un laboratorio toallita húmeda y cubrir con el plato tapa Petri. - Eliminar bloque, e incubar los cubreobjetos durante 1 h a RT con 150 l de anticuerpos primarios diluidos apropiadamente en BDS a manchar para cinetocoros y los microtúbulos a concentraciones finales de 2 g / ml (o de acuerdo con las recomendaciones del fabricante) y 1 g / ml, respectivamente .
Nota: En este caso, el protocolo de fijación se puede detener a continuar en un momento posterior. Los cubreobjetos se pueden almacenar en una cámara de humedad a 4 ° C durante un máximo de 24 hr. - Wash cubreobjetos 3x con 500 l de 1x PBS + 0,1% de Triton-X.
- Incubar cubreobjetos durante 30-60 minutos a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado apropiadas diluidos en BDS.
- Wash cubreobjetos 3x con 500 l de 1x PBS + 0,1% de Triton-X.
- Incubar cubreobjetos con 150 l de BDS que contienen / ml DAPI concentración final 1 g durante 5 min.
- Lave cubreobjetos 2x con 1x PBS + 0,1% Triton-X, y montar coverslips células hacia abajo sobre un portaobjetos de 3x1 "con 8 l de medio de montaje. Pinte las esquinas con esmalte de uñas para inmovilizar los cubreobjetos en portaobjetos.
- Celdas de imagen con husillos bipolares que están expresando Eg5-mCherry. Tome una serie Z que consta de 30 aviones a 0.2 micras intervalos en todos los canales utilizando un objetivo de 100X. Analizar cuidadosamente los cinetocoros y los microtúbulos para determinar los estados de fijación (biorientado o accesorios syntelic).
Representative Results
KLP61F se requiere para formar husillos bipolares. El kinesin-5 humana, Eg5, puede rescatar la función de KLP61F en las células S2 de Drosophila (Figura 1A y D). Tras la adición de la quinesina-5 inhibidor (STLC), los niveles asociadas a los microtúbulos de la caída de motor (Figura 1B y E), y los colapsos de husillo, lo que resulta en un monopolo (Figura 1C y F) en las células que carecen endógeno KLP61F sobre RNAi éxito (película Suplementario 1). Es de destacar que los husillos bipolares colapsan tras la adición de STLC en las células S2 humanizados debido a kinesin-5 actividad no es necesaria para mantener la bipolaridad husillo en células humanas. Esta discrepancia interesante puede ser el resultado de diferencias en la superposición de microtúbulos interpolar y / o estabilidad en los dos sistemas modelo 14. Kinesin-5 la inhibición (Figura 2 A y E) se pueden Reve RSED lavando la droga y la recuperación de un huso bipolar se puede seguir a través del tiempo. Tras la eliminación del inhibidor (Figura 2B y F), Eg5-mCherry re-asocia con los microtúbulos como un bipolares ensambla husillo (Figura 2C y G), y las células puede progresar en una anafase bipolar (Figura 2D y H, película Suplementario 2 ).
Figura 1. La adición de 1 M STLC conduce a husos monopolares en células de Drosophila S2. Imágenes representativas de proyección de imagen de lapso de tiempo de una célula Drosophila S2 que expresan Eg5-mCherry (AC) y GFP-α-tubulina (DF) durante la adición de 1 M STLC. El inhibidor de Eg5 se añadió a 3 min. Barra de escala = 5 micras. Timestamp = min: seg. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. A bipolares reformas huso Al retirar STLC. Imágenes representativas de time-lapse de una célula Drosophila 2 expresando Eg5-mCherry (AD) y GFP-α-tubulina (EH) durante un experimento de lavado STLC. STLC se lavó a cabo a los 5 min. A bipolares reformas huso dentro de 1 hora de eliminar el STLC. Barra de escala = 5 micras. Marca de hora: min: seg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Película Suplementario 1. (clic derecho para descargar). imágenes de fluorescencia Widefield de un ejemplo representativo de una célula Drosophila S2 expresando Eg5-mCherry ( izquierda) y GFP-α-tubulina (derecha). 1 M STLC se añadió a 2 min, y las formas de husillo un monopolo dentro de 10 min después de la adición del inhibidor. Las imágenes fueron adquiridas cada 1 min y jugó a una velocidad de 10 fotogramas por segundo. La barra de escala = 5 micras.
Película Suplementario 2. (Haga clic derecho para descargar). Imágenes Widefield fluorescencia de un ejemplo representativo de una célula Drosophila S2 expresando Eg5-mCherry (izquierda) y GFP-α-tubulina (derecha). Los medios que contienen 1 mM STLC se retiró y seenjuagados en 5 min. A bipolares reformas huso dentro de 1 hora de eliminar el inhibidor. Las imágenes fueron adquiridas cada 1 min y jugaron a un ritmo de 10 fotogramas por segundo. Barra de escala = 5 micras.
Discussion
Visualización de corrección de errores es una técnica valiosa para estudiar los pasos implicados en esta importante y complejo proceso celular. Para ello, los archivos adjuntos erróneas se generan utilizando inhibidores reversibles, y corrección de errores se observa sobre lavado de la droga. Este ensayo fue desarrollado originalmente usando células de cultivo de tejidos de mamíferos 5. Sin embargo la presencia de gran número de cinetocoros en muchos tipos de células de mamíferos modelo plantea un desafío en la observación de eventos de corrección de errores individuales. Células Drosophila S2 poseen tan sólo 4 pares de cinetocoros, por lo que una línea celular más preferible para la observación de la corrección de errores. Sin embargo, un inconveniente importante es que muchos inhibidores son ineficaces en las células S2 de Drosophila. Por lo tanto, la capacidad de generar una línea celular humanizado Drosophila S2 humana que expresa kinesin-5 proporciona una valiosa herramienta para estudiar la corrección de errores.
Aunque las células S2 de Drosophila pueden ser unamejor línea de células para estudiar la corrección de errores, los múltiples pasos involucrados en la obtención de la línea celular y derribando genes esenciales plantea algunos retos para esta técnica. Por ejemplo, la eficacia de transfección puede ser muy baja. Si es menos de 20% de las células están expresando el Eg5-mCherry, la transfección se debe repetir el proceso de selección como se necesitará más tiempo. Además, el porcentaje de células que expresan ambas proteínas fluorescentes puede disminuir con el tiempo. Esto se puede superar mediante la división de las células en presencia de Blasticidin S HCl e higromicina B para seleccionar las células que expresan Eg5-mCherry y GFP-α-tubulina, respectivamente. También es importante tener en cuenta que las células S2 de Drosophila tienen orthologues a muchas proteínas humanas y; por lo tanto, es crítico para optimizar las condiciones desmontables para las proteínas endógenas. Las condiciones óptimas desmontables pueden variar en la cantidad de ARN de doble cadena y la duración del tratamiento. Teniendo en cuenta la aparición y la rápida mejora de CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, generación de una línea celular de Drosophila con el gen KLP61F sustituido por Eg5 humana presenta una poderosa alternativa que superar las limitaciones de la transfección y el enfoque de caída. Nuestro trabajo demuestra que volar-a humano sustitución de genes debe ser una opción viable en este caso, a pesar de los reactivos necesarios para hacerlo en las células S2 de Drosophila se están desarrollando actualmente.
Este procedimiento no se limita a Eg5, pero se puede aplicar para estudiar la función de otras proteínas de interés. Si el uso de inhibidores que han sido previamente establecidos para ser ineficaz en las células S2 de Drosophila, este protocolo puede ser modificado para estudiar el efecto directo de los inhibidores en células vivas sin preocupaciones sobre los efectos de destino fuera. La línea celular producida usando este protocolo también podría utilizarse en el cribado de alto rendimiento de los análisis para identificar potenciales fármacos dirigidos a proteínas implicadas en la corrección de errores.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Patricia Wadsworth por el don de la kinesin-5 construcción. Este trabajo fue apoyado por una subvención del NIH (5 R01 GM107026) a TJM y por Research Grant N º 5-FY13-205 de la Fundación March of Dimes a TJM, así como el apoyo de la Fundación Charles H. Hood, Inc., Boston, MA. a TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
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