Introduction
Lika segregering av genomet under celldelningen kräver rätt växelverkan mellan replikerade DNA och spindel mikrotubuli. Mikrotubuli fysiskt interagera med kromosomer genom en ensemble av proteiner som monterar på centromerer kallas kinetochore 1. Korrekt fördelning av kromosomerna kräver att syster kinetokorer är biorienterad, där varje syster är associerad med mikrotubuli som härrör från motsatta spindel poler. Kinetochor mikrotubulus (kt-MT) bilagor som inte finns i biorienterad konforma snabbt och effektivt destabiliseras för att ge möjlighet att etablera biorientation i en process som kallas felkorrigering. Ett felkorrigering analys som tidigare grundades i däggdjursceller 5 kräver montering monopolära spindlar använder reversibla småmolekylinhibitorer mot Eg5 (kinesin-5). Läkemedelsbehandling genererar en mängd felaktiga syntelic bilagor i vilken both syster kinetokorer fäster vid samma spindel stolpe. En efterföljande uttvättning av läkemedlet medger visualisering av felkorrigeringsprocessen. Felkorrigering analysen kan göras i närvaro av små molekylhämmare eller knockdowns att studera bidraget av kandidatproteiner att korrigera felaktiga kt-MT bilagor.
Förmågan att visualisera felkorrigering i levande celler är ett kraftfullt verktyg för att ytterligare förstå den molekylära mekanism som är involverad i denna komplicerade process. Det stora antalet kromosomer närvarande i de flesta cellinjer är en utmaning i att observera individuella kt-MT bilagor. Drosophila S2-celler skulle vara perfekt för applicering av felkorrigering analysen, eftersom de innehåller så få som fyra kromosomer 6, men småmolekylära hämmare av kinesin 5 såsom S-trityl-L-cystein (STLC) och monastrol 7-9 påverkar inte spindelenhet eller kinesin-5 motorisk funktion i Drosophila-celler. Vi har därför släktented en Drosophila S2 cellinje som uttrycker human kinesin-5 under en inducerbar promotor som är känslig för kinesin-5-hämmare. Detta protokoll beskriver hur man VÄLDIGANDE den endogena Drosophila kinesin-5 homolog, Klp61F och använda denna cellinje i cellbaserade felkorrigering analys.
Protocol
1. transfektera S2-celler
- Från en tidigare odlad 25 cm 2 kolv, till GFP-a-tubulin-uttryckande S2-celler 10 till en slutlig volym av 2 ml vid 100% konfluens, och tillåta dem att halv vidhäfta till botten av en 35 mm vävnadsodlingsplatta för ca 1 timme.
- Ta bort materialet från skålen. Transfektera 2 pg av Eg5-mCherry konstruera 11 med 1 ml Schneiders media kompletterade med 10% FBS (nedan kallad Schneiders media) och transfektion reagens, enligt tillverkarens protokoll. Täta skålen med Parafilm och inkubera cellerna vid 25 ° C under 16-18 h.
- Tillsätt 1 ml av Schneiders media. Återgå celler till 25 ° C inkubator.
- På dag 3 efter transfektion, överför 500 pl av transfekterade celler i en ny 35 mm vävnadsodlingsskål innehållande 1,5 ml Schneiders medium för ett test induktion. Inducera uttryck av Eg5-mCherry genom tillsats CUSO4
- För att göra konkanavalin A-belagda täckglas, pipett nog volym av Concanavalin A-lösning (0,5 mg / ml löst i H2O) för att belägga en syra tvättades täckglas, ta bort överskott, och göra det möjligt för täckglas lufttorka.
- Placera en 22 mm x 22 mm konkanavalin A-belagda täckglas i en ren 35 mm vävnadsodlingsskål, därefter ympa 500 ^ vid 100% konfluens av de inducerade cellerna på täckglas och låta cellerna vidhäfta under 1 timme vid RT.
- För att kontrollera om Eg5-mCherry uttryck, montera täck in en ros kammare (eller lämplig avbildnings kärl) med media för avbildning vid RT på ett fluorescensmikroskop. Använd lämpliga ljuskällor och filteruppsättningar för att visualisera celler. Till exempel, mikroskop användes i denna studie har en LED vit ljuskälla och EGFP (FITC / Cy2) och dsRed (TRITC / Cy3) filter kuber. Eg5-mCherry lokaliseras till mikrotubuli och berikas near spindel stolpar.
- När du har kontrollerat att cellerna uttrycker både Eg5-mCherry och GFP-α-tubulin, överföra resten av de transfekterade, icke-inducerade celler till en 25 cm 2 vävnadsodlingskolv innehållande 4 ml Schneiders media.
- Lägg Blasticidin S HCL vid en slutlig koncentration av 25 | ig / ml till kolven av transfekterade celler och fortsätta klyvning i närvaro av 25 | ig / ml Blasticidin S HCl till celldöd upphör att vara noga med att kontrollera för uttryck av Eg5-mCherry periodvis. Inkubera cellinjer i 25 ° C inkubator.
OBS: Den procentuella andelen celler som uttrycker Eg5-mCherry ökar med tiden. - När celler transfekteras stabilt, fortsätta att dela upp i frånvaro av läkemedlet och frysa 12-celler för framtida användning.
2. RNA-interferens
- PCR amplifiera en bp region ~ 500 av Klp61F från cDNA (LD15641) med hjälp av primer med tillsatt T7-promotorsekvensen (sekvens tillhandahålls i Materials List) att varaanvänds som en mall för dsRNA syntes.
- Inrätta fyra PCR-reaktioner, 50 pl vardera, innehållande 100 ng mall-DNA, 25 | iM av varje primer, lämplig buffert och polymeras. Ställ PCR-protokollet på termocykler enligt polymeraset s tillverkarens protokoll.
- Pool och rena fyra PCR-reaktioner med användning av en PCR städa upp kit enligt tillverkarens protokoll. Förvara rena mallen vid -20 ° C.
- Förbered dubbelsträngat RNA (dsRNA) från templat med användning av en T7-RNA-transkription kit, enligt tillverkarens instruktioner. Räkna ~ 5-15 mg / ml koncentration av dsRNA. Förvara dsRNA vid -20 ° C.
- För att knockdown Klp61F med dsRNA, tillåta S2-celler som uttrycker Eg5-mCherry vid 25% konfluens till semi-vidhäfta till botten av en 35 mm vävnadsodlingsskål under 1 h.
- Ta bort media från skålarna och tillsätt 5 mikrogram av dsRNA mot Klp61F (Drosophila kinesin-5) utspädd i 1 ml serumfritt Schneider "s medier.
- Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme, tillsätt sedan 1 ml Schneiders media med 10% FBS. Inkubera cellerna vid 25 ° C.
- 24 timmar efter dsRNA behandling, inducerar expression av Eg5-mCherry genom tillsats CUSO4 till en slutlig koncentration av 500 | iM. Inkubera cellerna vid 25 ° C under ytterligare 24 timmar.
3. Levande cell imaging
- Placera en 22 mm x 22 mm concanavalin A belagd täck i en ren 35 mm vävnadsodlingsskål.
- Seed 500 fil av de celler som har behandlats med dsRNA och inducerade O / N på konkanavalin A belagda täckglas och tillåter dem att vidhäfta under ca 1 timme.
- Montera täck in en ros kammare (eller lämpligt kärl) för avbildning.
- Hitta mitotiska celler som uttrycker både Eg5-mCherry och GFP-α-tubulin.
OBS: Mitotiska celler som uttrycker endast GFP-α-tubulin bör ha monopolära spindlar sedan Klp61F, vilket krävs för spindel bipolaritet, slås ned 10,13. - Samla tidsförlopp bilder av bipolära spindlar (t.ex. en ram per minut) i celler som uttrycker både Eg5-mCherry och GFP-α-tubulin.
- Medan avbildning, ta bort media från rosenkammaren, och ersätta den med Schneiders medium innehållande 1 | iM STLC över 3 på varandra följande medier börser (~ 5 ml totalt) in i kammaren för att visualisera spindel kollaps.
- Att washout läkemedlet och vända spindel kollaps, försiktigt bort STLC innehåller material från rosenkammaren, och tvätta i Schneiders media 4x (6-8 ml totalt) innan påfyllning av rosenkammaren en sista gång med färskt medium. Fortsätt avbildning.
4. Error Correction analys
- Placera en 22 mm x 22 mm konkanavalin A belagda täck i ren 35 mm vävnadsodlingsskålar.
- Seed 500 il celler som har behandlats med Klp61F dsRNA på konkanavalin A belagda täckglas och ger dem möjlighet att ansluta sig.
- Efter celler är adhered, tillsätt 1,5 ml av Schneiders media till varje maträtt att bringa den slutliga volymen upp till 2 ml.
- För att stoppa celler i mitos, lägga MG132 till en slutlig koncentration av 10 | iM till var och av de rätter, och inkubera i 1 timme.
- Lägg ett iM STLC och inkubera under 1 timme för att låta monopoler för att bilda.
- Tvätta ut STLC genom att skölja täck 3x med 2 ml färskt Schneiders media varje gång.
- Inkubera täck med Schneiders media utöver de farmakologiska läkemedel (t.ex. Aurora kinashämmare) eller DMSO som kontroll.
Obs: inhibitorkoncentrationer varierar och korrekt slut Halterna måste bestämmas av försöksledaren. Stamlösningar är oftast gjorda så att hämmaren späds 1: 1000 i media. I detta fall är en 1: 1000 spädning av DMSO (eller lämpligt lösningsmedel) tjänar som vehikelkontroll. Vi använder Aurora B-hämmare Binucleine 2 vid en slutlig koncentration av 40 ^ M. - Fix celler vid olika tidpunkter to observera utvecklingen av bipolär spindelbildning och bedöma kinetochor fästtillstånd. Att fixa:
- Snabbt skölja täck med 2 ml 1x BRB-80.
- Fix celler genom att tillsätta 2 ml av 10% paraformaldehyd utspädd i 1x BRB-80 under 10 min. Pipet paraformaldehyd försiktigt i en kemisk huva.
- Permeabilize celler med 2 ml 1x PBS + 1% Triton-X för 8 min.
- Tvätta objektglasen 3x med 2 ml 1 x PBS + 0,1% Triton-X.
- Överföring täckcellsidan uppåt på ett ark av Parafilm (använd en markör att märka Parafilm lämpligt att hålla reda på bilderna) i en 150 mm petriskål.
- Täck täckglas med 150 | j, l kokt åsna serum (BDS) och inkubera vid rumstemperatur under 1 timme för att blockera icke-specifik antikroppsbindning.
Obs: Här kan fixeringsprotokoll stoppas skall fortsätta vid ett senare tillfälle. Täckglas kan lagras i en fuktkammare vid 4 ° C i upp till 24 timmar. För att göra fuktkammaren, linje kanten av en 150 mm skålmed en våt laboratorium torka och täck med skålen locket Petri. - Avlägsna blocket, och inkubera täckglasen under 1 h vid RT med 150 pl primära antikroppar utspädda på lämpligt sätt i BDS att färga för kinetokorer och mikrotubuli till slutkoncentrationer av 2 ug / ml (eller enligt tillverkarens rekommendationer) och 1 ^ g / ml, respektive .
Obs: Här kan fixeringsprotokoll stoppas skall fortsätta vid ett senare tillfälle. Täckglas kan lagras i en fuktkammare vid 4 ° C i upp till 24 timmar. - Tvätta täck 3x med 500 mikroliter 1X PBS + 0,1% Triton-X.
- Inkubera täck för 30-60 minuter vid RT med lämpliga fluoroforen-konjugerade sekundära antikroppar utspädda i BDS.
- Tvätta täck 3x med 500 mikroliter 1X PBS + 0,1% Triton-X.
- Inkubera täckglas med 150 pl BDS innehållande 1 | ig / ml DAPI slutlig koncentration under 5 min.
- Tvätta täck 2x med 1x PBS + 0,1% Triton-X, och montera coverslips cell nedåt på en 3x1 "slide med 8 il montering media. Måla hörn med nagellack för att immobilisera täck på bilderna.
- Bildceller med bipolära spindlar som uttrycker Eg5-mCherry. Ta en Z-serien består av 30 plan på 0,2 um intervall i alla kanaler med hjälp av en 100X mål. Noggrant analysera kinetokorer och mikrotubuli för att fastställa fäst stater (biorienterade eller syntelic bilagor).
Representative Results
Klp61F krävs för att bilda bipolära spindlar. Den humana kinesin-5, Eg5, kan rädda funktionen av Klp61F i Drosophila S2-celler (Figur 1A och D). Vid tillsats av kinesin-5-inhibitor (STLC), mikrotubuli-associerade nivåer av motorfallet (figur 1B och E), och spindel kollapsar, vilket resulterar i en enpolig (Figur 1C och F) i celler som saknar endogen Klp61F vid lyckad RNAi (Supplemental filmen 1). Det är anmärkningsvärt att bipolära spindlar kollapsa vid tillsättning av STLC i humaniserade S2-celler eftersom kinesin-5 aktivitet inte är skyldig att hålla spindel bipolaritet i humana celler. Denna intressanta diskrepans kan vara ett resultat av skillnader i interpolar mikrotubuli överlappning och / eller stabilitet i de två modellsystem 14. Kinesin-5 inhibering (figur 2A och E) kan Rêve rsed genom uttvättning läkemedlet och återvinning av en bipolär spindel kan följas över tiden. Vid avlägsnande av inhibitorn (fig 2B och F), Eg5-mCherry re-associerar med mikrotubuli som en bipolär spindel monterar (Figur 2C och G), och celler kan utvecklas till en bipolär anafas (figur 2D och H, Supple film 2 ).
Figur 1. Tillsats av 1 iM STLC leder till monopolära spindlar i Drosophila S2-celler. Bilderna är från tidsförlopp avbildning av en Drosophila S2 cell som uttrycker Eg5-mCherry (AC) och GFP-α-tubulin (DF) vid tillsättning av 1 iM STLC. Den Eg5 inhibitor tillsattes vid 3 min. Skalstreck = 5 | j, m. Timestamp = min: sek. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. En bipolär spindel reformer vid avlägsnande av STLC. Bilderna är från tidsförlopp avbildning av en Drosophila 2 cell som uttrycker Eg5-mCherry (AD) och GFP-α-tubulin (EH) under en STLC washout experiment. STLC tvättades ut på 5 minuter. En bipolär spindel reformer inom en timme att ta bort STLC. Skalstreck = 5 | j, m. Tidsstämpel: min: sek. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Kompletterande Film 1. (Högerklicka för att ladda ner). Widefield fluorescens avbildning av ett representativt exempel på en Drosophila S2 cell som uttrycker Eg5-mCherry ( vänster) och GFP-α-tubulin (höger). 1 ^ M STLC tillsattes vid 2 min och spindel bildar en enpolig inom 10 min efter tillsats av hämmaren. Bilder förvärvades varje 1 min och spelade med en hastighet på 10 bildrutor per sekund. Skalstreck = 5 | j, m.
Kompletterande Movie 2. (Högerklicka för att ladda ner). Widefield fluorescens avbildning av ett representativt exempel på en Drosophila S2 cell som uttrycker Eg5-mCherry (vänster) och GFP-α-tubulin (höger). Medium innehållande 1 | iM STLC avlägsnades ochsköljdes vid 5 min. En bipolär spindel reformer inom en timme att ta bort hämmare. Bilder förvärvades varje 1 min och spelade med en hastighet av 10 bilder per sekund. Skalstreck = 5 | j, m.
Discussion
Visualisera felkorrigering är en värdefull teknik för att studera de olika stegen i denna viktiga och komplexa cellulär process. För att göra detta, är felaktiga bilagor genereras med hjälp reversibla inhibitorer, och felkorrigering observeras vid uttvättning av läkemedlet. Denna analys var ursprungligen utvecklats med hjälp av däggdjursvävnadsodlingsceller 5. Emellertid närvaron av stora antal av kinetokorer i många modelldäggdjurscelltyper utgör en utmaning i att observera individuella felkorrigering händelser. Drosophila S2-celler har så få som fyra par av kinetokorer, vilket gör dem en mer föredragen cellinje för att observera felkorrigering. Emellertid är en stor nackdel att många inhibitorer är ineffektiva i Drosophila S2-celler. Således, ger möjlighet att skapa en humaniserad Drosophila S2 cellinje som uttrycker human kinesin-5 ett värdefullt verktyg för att studera felkorrigering.
Även om Drosophila S2-celler kan vara enbättre cellinje för att studera felkorrigering, de många stegen i att erhålla cellinje och knackar ner essentiella gener innebär vissa utmaningar för denna teknik. Till exempel kan transfektionseffektiviteten vara ganska låg. Om mindre än 20% av cellerna uttrycker Eg5-mCherry, bör transfektion upprepas så urvalsprocessen tar längre tid. Dessutom kan den procentuella andelen celler som uttrycker båda fluorescerande proteiner minska med tiden. Detta kan övervinnas genom att dela celler i närvaro av Blasticidin S HCl och hygromycin B för att välja med avseende på celler som uttrycker Eg5-mCherry och GFP-α-tubulin, respektive. Det är också viktigt att notera att Drosophila S2-celler har ortologer till många humana proteiner och; Därför, är det viktigt att optimera de knockdown villkoren för de endogena proteinerna. Optimala knockdown förhållanden kan variera i mängd dsRNA och längden av behandlingen. Med tanke på uppkomsten och snabb förbättring av crispr-Cas9 Technoes 15-17, generering av en Drosophila-cellinje med Klp61F genen ersatts med humant Eg5 presenteras ett kraftfullt alternativ som skulle övervinna begränsningarna hos transfektionen och knockdown tillvägagångssätt. Vårt arbete visar att fly till människa genutbyte ska vara ett hållbart alternativ i det här fallet, även om de nödvändiga reagens för att göra det i Drosophila S2-celler utvecklas för närvarande.
Detta förfarande är inte begränsat till Eg5, utan kan tillämpas för att studera funktionen av andra proteiner av intresse. Om du använder inhibitorer som tidigare har inrättats för att vara ineffektiva i Drosophila S2-celler, kan detta protokoll ändras för att studera den direkta effekten av inhibitorer i levande celler utan oro från målet effekter. Cellinjen produceras med användning av detta protokoll kan också användas i high-throughput screening-analyser för att identifiera potentiella läkemedel riktade proteiner involverade i felkorrigering.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Patricia Wadsworth för gåvan av kinesin-5 konstruktionen. Detta arbete stöddes av en NIH bidrag (5 R01 GM107026) till TJM och av Research Grant nr 5-FY13-205 från March of Dimes Foundation till TJM, samt stöd från Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. till TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
- Cheeseman, I. M., Desai, A.
- Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
- Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
- Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
- Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
- Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).
- Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
- Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187 (2013).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).
