Introduction
Lik segregering av genomet under celledeling krever riktige samspillet mellom kopiert DNA og spindel mikrotubuli. Mikrotubuli fysisk samhandle med kromosomer gjennom et ensemble av proteiner som samler på sentromerer kjent som kinetochore en. Riktig fordeling av kromosomer krever at søster kinetochores er bioriented, der hver søster er assosiert med mikrotubuli som stammer fra motsatte spindel polene. Kinetochore microtubule (kt-MT) vedlegg som ikke er i bioriented konformasjon er raskt og effektivt destabilisert å gi mulighet til å etablere biorientation i en prosess som kalles feilretting. En feilkorreksjons assay som tidligere ble etablert i pattedyrceller 5 krever montering av monopolare spindler ved hjelp av reversible lavmolekylære inhibitorer mot EG5 (kinesin-5). Stoffet behandling genererer en rekke feilaktige syntelic vedlegg der both søster kinetochores feste til samme spindel pol. En etterfølgende utvasking av medikamentet tillater visualisering av feilkorreksjonsprosessen. Feilkorreksjons analysen kan utføres i nærvær av lavmolekylære inhibitorer eller knock-out for å studere bidraget av kandidat proteiner for å korrigere feilaktige kt-MT vedlegg.
Evnen til å visualisere feilkorreksjon i levende celler er et kraftig verktøy for ytterligere å forstå den molekylære mekanismen som er involvert i den komplekse prosessen. Men det store antall kromosomer til stede i de fleste cellelinjer er en utfordring i å observere individuelle kt-MT vedlegg. Drosophila S2-celler ville være ideelt for å anvende feilkorrigering assay som de inneholder så få som fire kromosomer 6, men lavmolekylære inhibitorer av kinesin 5 slik som S-trityl-L-cystein (STLC) og monastrol 7-9 påvirker ikke spindelenheten eller kinesin-5 motorisk funksjon i Drosophila celler. Vi har derfor generated et Drosophila S2-cellelinje som uttrykker humant kinesin-5 under en induserbar promoter som er følsom for kinesin-5 hemmere. Denne protokollen beskriver hvordan du knockdown den endogene Drosophila kinesin-5 homologue, Klp61F, og bruke denne cellelinjen i cellebasert feilretting analysen.
Protocol
1. trans S2 Cells
- Fra en på forhånd dyrket 25 cm2 kolbe, tilsett GFP-a-tubulin-uttrykk S2-celler 10 til et sluttvolum på 2 ml ved 100% konfluens, og tillate dem å semi-holde bunnen av en 35 mm vevskulturskål for omtrent 1 time.
- Fjern materialet fra fatet. Transfisere 2 mikrogram av EG5-mCherry konstruere 11 med en ml av Schneiders media supplert med 10% FBS (heretter kalt Schneiders media) og Transfeksjon Reagens, etter produsentens protokoll. Forsegle fatet med Parafilm og inkuber celler ved 25 ° C i 16-18 timer.
- Tilsett 1 ml av Schneiders medier. Returner celler til 25 ° C inkubator.
- På dag 3 etter transfeksjon, overfør 500 pl av transfekterte celler til en ny 35 mm vevskulturskål inneholdende 1,5 ml av Schneider medier for en test induksjon. Indusere uttrykk for EG5-mCherry ved å legge CuSO4
- For å gjøre concanavalin A-belagte dekkglass, pipette nok volum av concanavalin A-oppløsning (0,5 mg / ml oppløst i H2O) for å belegge dekkglass vasket en syre, fjerne overflødig, og at dekkglass for å lufttørke.
- Plasser en 22 mm x 22 mm concanavalin A-belagte dekkglass i en ren 35 mm vevskulturskål, deretter frø 500 pl til 100% konfluens av de induserte cellene på dekkglass og la cellene få feste seg i 1 time ved RT.
- For å se etter EG5-mCherry uttrykk, montere dekk inn en rose kammer (eller hensiktsmessig bildebehandling fartøy) med media for avbildning ved RT på en fluorescens mikroskop. Bruke egnede lyskilder og filtersett for å visualisere cellene. For eksempel, et mikroskop som brukes i denne undersøkelsen har en LED hvit lyskilde og EGFP (FITC / Cy2) og DsRed (TRITC / Cy3) filter kuber. EG5-mCherry lokaliserer til mikrotubuli og er beriket near spindel polene.
- Etter å sikre at cellene uttrykker både EG5-mCherry og GFP-α-tubulin, overfører resten av de transfekterte, ikke-induserte celler til en 25 cm2 vevskulturkolbe inneholdende 4 ml Schneider medier.
- Legg Blasticidin S HCL til en sluttkonsentrasjon på 25 ug / ml til kolben av transfekterte celler og videre splitting i nærvær av 25 ug / ml Blasticidin S HCl til celledød opphører å være sikker på å kontrollere om ekspresjonen av EG5-mCherry med jevne mellomrom. Inkuber cellelinjer i 25 ° C inkubator.
MERK: Prosentandelen av celler som uttrykker EG5-mCherry øker over tid. - Når cellene blir stabilt transfektert, fortsette å deles i fravær av medikament, og fryse 12-celler for fremtidig bruk.
2. RNA interferens
- PCR forsterke et ~ 500 bp regionen Klp61F fra cDNA (LD15641) bruker primer med ekstra T7 promotersekvens (rekkefølgen de er angitt i Materials List) for å væreanvendt som et templat for syntese dsRNA.
- Satt opp fire PCR-reaksjoner, 50 ul hver, inneholdende 100 ng templat-DNA, 25 pM av hver primer, passende buffer, og polymerase. Sett PCR-protokollen på thermocycler henhold til polymerase er produsentens protokoll.
- Basseng og rene fire PCR reaksjoner ved hjelp av en PCR rydde opp kit i henhold til produsentens protokoll. Oppbevar ren mal ved -20 ° C.
- Forbered dobbelttrådet RNA (dsRNA) fra mal ved hjelp av en T7 RNA transkripsjon kit, etter produsentens anvisninger. Forvent ~ 5-15 mg / ml konsentrasjon av dsRNA. Oppbevar dsrna ved -20 ° C.
- For å knockdown Klp61F med dsRNA, tillate S2-celler som uttrykker EG5 mCherry ved 25% konfluens i semi-holde bunnen av en 35 mm vevskulturskål i 1 time.
- Fjern media fra retter og tilsett 5 mikrogram dsrna mot Klp61F (Drosophila kinesin-5) fortynnet i 1 ml serum-free Schneider 's medier.
- Inkuberes ved romtemperatur i 1 time, deretter tilsett 1 ml av Schneiders media med 10% FBS. Inkuber cellene ved 25 ° C.
- 24 timer etter dsRNA-behandling, indusere ekspresjon av EG5-mCherry ved tilsetning CuSO4 til en sluttkonsentrasjon på 500 uM. Inkuber cellene ved 25 ° C i ytterligere 24 timer.
3. Live-Cell Imaging
- Plasser en 22 mm x 22 mm concanavalin A belagt dekkglass i en ren 35 mm vevskulturskål.
- Seed 500 ul av celler som er blitt behandlet med dsRNA og indusert O / N på concanavalin A belagte dekkglass, og tillater dem å følge i ca 1 time.
- Monter dekk inn en rose kammer (eller hensiktsmessig fartøy) for bildebehandling.
- Finn mitotiske celler som uttrykker både EG5-mCherry og GFP-α-tubulin.
MERK: Mitotiske celler uttrykker bare GFP-α-tubulin skal ha monopolare spindler siden Klp61F, som er nødvendig for spindel bipolariteten, blir slått ned 10,13. - Samle time-lapse bilder av bipolare spindler (f.eks en ramme per minutt) i celler som uttrykker både EG5-mCherry og GFP-α-tubulin.
- Mens bildebehandling, fjerne mediet fra rosen kammeret, og erstatte den med Schneiders medier som inneholder en iM STLC over 3 påfølgende medie børser (~ 5 ml totalt) inn i kammeret for å visualisere spindel kollaps.
- Til utvasking stoffet og reversere spindel kollaps, forsiktig fjerne STLC holdige medier fra rosen kammeret, og vask i Schneider medie 4x (6-8 ml totalt) før påfylling rosen kammeret en siste gang med friskt media. Fortsett bildebehandling.
4. Error Correction-analysen
- Plasser en 22 mm x 22 mm concanavalin en belagt Dekk til rene 35 mm vevskulturskåler.
- Seed 500 ul av celler som er blitt behandlet med Klp61F dsRNA på concanavalin A belagte dekkglass, og tillate dem å rette seg etter.
- Etter cellene er adhered, tilsett 1,5 ml av Schneiders media til hver rett til å bringe det endelige volumet opp til 2 ml.
- Å arrestere celler i mitose, legge MG132 til en sluttkonsentrasjon på 10 pM av hver av rettene, og inkuberes i en time.
- Tilsett 1 uM STLC og inkuberes i en time for å tillate monopoler å danne.
- Vaske ut STLC ved å skylle Dekk 3x med 2 ml av fersk Schneiders media hver gang.
- Inkuber Dekk med Schneiders medier i tillegg til eventuelle farmakologiske stoffer (f.eks Aurora kinase hemmere) eller DMSO som en kontroll.
Merk: inhibitorkonsentrasjoner variere og riktig sluttkonsentrasjoner må bestemmes av eksperimentator. Stock-løsninger er vanligvis laget slik at inhibitoren er fortynnet 1: 1000 i mediet. I dette tilfellet er en 1: 1000 fortynning av DMSO (eller passende løsningsmiddel) tjener som bærerkontroll. Vi bruker Aurora B inhibitor Binucleine 2 ved en sluttkonsentrasjon på 40 uM. - Fix cellene ved ulike tidspunkt to observere utviklingen av bipolar spindel formasjon og å vurdere kinetochore feste stater. Å fikse:
- Raskt skyll glassene med 2 ml 1x BRB-80.
- Fix-celler ved å tilsette 2 ml av 10% paraformaldehyd fortynnet i 1x BRB-80 ° C i 10 min. Pipette paraformaldehyde nøye i en kjemisk hette.
- Permeabilisere cellene med 2 ml av 1 x PBS + 1% Triton-X til 8 min.
- Vask glir 3 x med 2 ml av 1 x PBS + 0,1% Triton-X.
- Transfer Dekk celle-siden opp på et ark av Parafilm (bruk en markør for å merke Parafilm hensiktsmessig å holde styr på lysbildene) i en 150 mm petriskål.
- Dekk glassene med 150 ul esel kokt serum (BDS) og inkuber ved romtemperatur i 1 time for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding.
Merk: Her kan fiksering protokollen stoppes skal videreføres på et senere tidspunkt. Dekkglass kan lagres i et fuktkammer ved 4 ° C i opptil 24 timer. For å gjøre fuktighet kammer, linje kanten av en 150 mm tallerkenmed en våt laboratorium tørke og dekk med petriskål lokket. - Fjern blokk, og inkuber Dekk for en time ved RT med 150 ul primære antistoffer fortynnet hensiktsmessig i BDS å farge for kinetochores og mikrotubuli til sluttkonsentrasjoner på 2 mikrogram / ml (eller i henhold til produsentens anbefalinger) og 1 ng / ml, henholdsvis .
Merk: Her kan fiksering protokollen stoppes skal videreføres på et senere tidspunkt. Dekkglass kan lagres i et fuktkammer ved 4 ° C i opptil 24 timer. - Vask Dekk 3x med 500 mL av 1x PBS + 0,1% Triton-X.
- Inkuber Dekk i 30-60 min ved RT med passende fluoroforen-konjugerte sekundære antistoffer fortynnet i BDS.
- Vask Dekk 3x med 500 mL av 1x PBS + 0,1% Triton-X.
- Inkuber Dekkglass med 150 ul BDS inneholdende 1 pg / ml DAPI sluttkonsentrasjon i 5 min.
- Vask Dekk 2x med 1x PBS + 0,1% Triton-X, og montere coverslips celle side ned på en 3x1 "slide med 8 mL av montering media. Paint hjørnene med neglelakk å immobilisere glassene på lysbilder.
- Bilde celler med bipolare spindler som uttrykker EG5-mCherry. Ta en Z-serien som består av 30 fly på 0,2 mikrometer intervaller i alle kanaler som bruker en 100X objektiv. Analysere kinetochores og mikrotubuli nøye for å avgjøre feste statene (bioriented eller syntelic vedlegg).
Representative Results
Klp61F er nødvendig for å danne bipolare spindler. Det humane kinesin-5, EG5 kan redde funksjon Klp61F i Drosophila S2-celler (figur 1A og D). Ved tilsetning av kinesin-5 inhibitor (STLC), mikrotubul-assosiert nivåer av motorens slipp (figur 1 B og E), og spinde kollapser, noe som resulterer i en monopol (figur 1C og F) i celler som mangler endogen Klp61F etter vellykket RNAi (Opplysning film 1). Det er bemerkelsesverdig at bipolare spindlene kollapser ved tilsetning av STLC de humaniserte S2-celler fordi kinesin-5-aktivitet ikke er nødvendig for å opprettholde spindel bipolaritet i humane celler. Denne interessante avviket kan være et resultat av forskjeller i inter microtubule overlapp og / eller stabilitet i de to modellsystemer 14. Kinesin-5 hemming (figur 2A og E) kan Reve rsed ved utvasking av medikamentet og utvinning av en bipolar spindel kan følges over tid. Ved fjerning av inhibitor (figur 2B og F), EG5-mCherry re-kollegaer med mikrotubuli som en bipolar spindel monterer (figur 2C og G), og cellene kan utvikle seg til en bipolar anaphase (figur 2D og H, Opplysning film 2 ).
Figur 1. Tilsetting av 1fiM STLC fører til monopolare spindler i Drosophila S2 celler. Representative bilder fra time-lapse avbildning av et Drosophila S2 celle uttrykker EG5-mCherry (AC) og GFP-α-tubulin (DF) under tilsetning av 1 um STLC. Den EG5 inhibitor ble lagt på 3 min. Scale bar = 5 mikrometer. Timestamp = min: sek. w.jove.com/files/ftp_upload/53594/53594fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. En bipolar spindel reformer ved fjerning av STLC. Representative bilder fra time-lapse avbildning av et Drosophila to celle uttrykker EG5-mCherry (AD) og GFP-α-tubulin (EH) under et STLC utvasking eksperiment. STLC ble vasket ut på 5 min. En bipolar spindel reformer innen en time for å fjerne STLC. Scale bar = 5 mikrometer. Tidsstempel: min: sek. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ww.jove.com/files/ftp_upload/53594/addin.mov "target =" _ blank "> Opplysning Movie 1. (Høyreklikk for å laste ned). Widefield fluorescens avbildning av et representativt eksempel på en Drosophila S2 celle uttrykker EG5-mCherry ( venstre) og GFP-α-tubulin (til høyre). 1fiM STLC ble lagt på 2 min, og spindelen danner et monopol innen 10 min etter tilsetning av inhibitor. Bilder ble kjøpt hver 1 min og spilte med en hastighet på 10 bilder per sekund. Målestokk = 5 um.
Opplysning Movie 2. (Høyreklikk for å laste ned). Widefield fluorescens avbildning av et representativt eksempel på en Drosophila S2 celle uttrykker EG5-mCherry (til venstre) og GFP-α-tubulin (til høyre). Media inneholdende 1 pM STLC ble fjernet ogrenses ved 5 min. En bipolar spindel reformer innen en time for å fjerne inhibitoren. Bilder ble kjøpt hver 1 min og spilte med en hastighet på 10 bilder per sekund. Scale bar = 5 mikrometer.
Discussion
Visual feilretting er en verdifull teknikk for å studere trinnene involvert i denne viktige og komplekse cellulære prosessen. For å gjøre dette, er feilaktige vedlegg generert ved hjelp av reversible hemmere, og feilretting er observert ved utvasking av stoffet. Denne analysen ble opprinnelig utviklet ved hjelp av pattedyr vevskulturceller 5. Men tilstedeværelsen av store antall kinetochores i mange modellpattedyrcelletyper er en utfordring i å observere enkelte feilretting hendelser. Drosophila S2 celler har så få som fire par kinetochores, noe som gjør dem en mer å foretrekke cellelinje for å observere feilretting. Det er imidlertid en stor ulempe at mange inhibitorer er ineffektive i Drosophila S2-celler. Således er evnen til å generere et humanisert Drosophila S2-cellelinje som uttrykker humant kinesin-5 gir et verdifullt verktøy for å studere feilretting.
Selv Drosophila S2-celler kan være enbedre cellelinje for å studere feilretting, flere trinn involvert i å skaffe cellelinjen og slå ned viktige gener skaper noen utfordringer til denne teknikken. For eksempel kan transfeksjonseffektivitet være ganske lav. Dersom mindre enn 20% av cellene uttrykker den EG5-mCherry, bør transfeksjon gjentas som utvelgelsesprosessen vil ta lengre tid. Dessuten kan prosentandelen av celler som uttrykker begge fluorescerende proteiner reduseres over tid. Dette kan overvinnes ved å dele cellene i nærvær av Blasticidin S HCl og Hygromycin B for å selektere for celler som uttrykker EG5-mCherry og GFP-α-tubulin, respektivt. Det er også viktig å merke seg at Drosophila S2-celler har orthologues til mange humane proteiner og; Derfor er det viktig å optimalisere knockdown forholdene for de endogene proteiner. Optimale knockdown forholdene kan variere i mengden av dsRNA og lengden av behandlingen. Med tanke på fremveksten og rask forbedring av CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, presenterer generering av et Drosophila cellelinje med Klp61F genet erstattet med human EG5 et kraftig alternativ som ville overvinne begrensninger av transfeksjon og knockdown tilnærming. Vårt arbeid viser at fly-til-menneske genet erstatning bør være et levedyktig alternativ i dette tilfellet, selv om de nødvendige reagenser for å gjøre det i Drosophila S2 celler er under utvikling.
Denne fremgangsmåten er ikke begrenset til EG5, men kan anvendes for å studere funksjonen av andre proteiner av interesse. Hvis du bruker hemmere som tidligere har blitt etablert for å være ineffektive i Drosophila S2 celler, kan denne protokollen endres for å studere den direkte effekten av hemmere i levende celler uten bekymringer om målet effekter. Den cellelinje produsert ved bruk av denne protokollen kan også brukes i high-throughput screening-analyser for å identifisere potensielle medikamenter rettet mot proteiner som er involvert i feilkorrigerings.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Patricia Wadsworth for gaven av kinesin-5 konstruere. Dette arbeidet ble støttet av en NIH stipend (5 R01 GM107026) til TJM og av Research Grant No. 5-FY13-205 fra March of Dimes Foundation til TJM, samt støtte fra Charles H. Hood Foundation, Inc., Boston, MA. til TJM
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
| Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
| Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
| Copper(II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500 mM stock |
| S-trityl-L-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1 mM stock in DMSO |
| Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5 mg/ml stock in 1x PBS |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15 µg/µl |
| Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
| Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
| PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
| Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5 mg/ml solution made by dissolving in 1x PBS. |
| Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1x PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4 °C. |
| Mounting Media | 20 mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4 °C. | ||
| 1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
| White Light Source | Lumencor Inc | ||
| ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
| DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
| anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
| DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
| anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |
References
- Cheeseman, I. M., Desai, A.
- Maresca, T. J., Salmon, E. D. Welcome to a new kind of tension: translating kinetochore mechanics into a wait-anaphase signal. J Cell Sci. 123, 825-835 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146, 568-581 (2011).
- Cimini, D., Wan, X., Hirel, C. B., Salmon, E. D. Aurora kinase promotes turnover of kinetochore microtubules to reduce chromosome segregation errors. Curr Biol. 16, 1711-1718 (2006).
- Lampson, M. A., Renduchitala, K., Khodjakov, A., Kapoor, T. M. Correcting improper chromosome-spindle attachments during cell division. Nat Cell Biol. 6, 232-237 (2004).
- Schneider, I. Cell lines derived from late embryonic stages of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 27, 353-365 (1972).
- Learman, S. S., et al. NSC 622124 inhibits human Eg5 and other kinesins via interaction with the conserved microtubule-binding site. Biochemistry. 48, 1754-1762 (2009).
- Liu, L., Parameswaran, S., Liu, J., Kim, S., Wojcik, E. J. Loop 5-directed compounds inhibit chimeric kinesin-5 motors: implications for conserved allosteric mechanisms. J Biol Chem. 286, 6201-6210 (2011).
- Maliga, Z., Mitchison, T. J. Small-molecule and mutational analysis of allosteric Eg5 inhibition by monastrol. BMC Chem Biol. 6, 2 (2006).
- Goshima, G., Vale, R. D. The roles of microtubule-based motor proteins in mitosis: comprehensive RNAi analysis in the Drosophila S2 cell line. J Cell Biol. 162, 1003-1016 (2003).
- Salemi, J. D., McGilvray, P. T., Maresca, T. J. Development of a Drosophila cell-based error correction assay. Front Oncol. 3, 187 (2013).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nat Protoc. 3, 606-611 (2008).
- Sharp, D. J., Yu, K. R., Sisson, J. C., Sullivan, W., Scholey, J. M. Antagonistic microtubule-sliding motors position mitotic centrosomes in Drosophila early embryos. Nat Cell Biol. 1, 51-54 (1999).
- Kollu, S., Bakhoum, S. F., Compton, D. A. Interplay of microtubule dynamics and sliding during bipolar spindle formation in mammalian cells. Curr Biol. 19, 2108-2113 (2009).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
- Mali, P., Esvelt, K. M., Church, G. M. Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat Methods. 10, 957-963 (2013).
