Sicherheitsvorkehrungen und Betriebsverfahren in einem (A) BSL-4-Labor: 2. Allgemeine Practices

Abstract

Die Arbeit in einem Biosicherheitsstufe 4 (BSL-4) Eindämmung Labor erfordert Zeit und viel Liebe zum Detail. Die gleiche Arbeit, die in einem BSL-2 Labor mit Nicht-Hoch Folge Krankheitserreger wird erheblich länger dauern in einem BSL-4-Einstellung erfolgt. Diese erhöhte Zeitbedarf ist aufgrund einer Vielzahl von Faktoren, die auf den Schutz der Forscher vom Labor erworbenen Infektionen, die Arbeitsumgebung vor möglichen Kontamination und der lokalen Gemeinschaft von möglichen Freisetzung von hoch Folge Krankheitserreger gerichtet sind. Innerhalb Labor wird die Bewegung durch Luftschläuche an die vorgeschriebene Sicherheitsanzüge Ganzkörper befestigt beschränkt. Zusätzlich Desinfektion von jedem Element, das von der Klasse II Biosicherheit Schränke (BSCs) entfernt wird, ist nicht erforderlich. Labor Spezialisten müssen in der Praxis der BSL-4 Labor geschult werden und eine hohe Kompetenz in den Fähigkeiten zeigen, müssen sie durchführen, sind. Der Schwerpunkt dieses Artikels ist die richtige Verfahren und Techniken zu umreißen Labor b, um sicherzustellen,iosafety und experimentelle Genauigkeit eines Standard viralen Plaque-Test als Beispiel Verfahren. Insbesondere arbeiten die richtigen Techniken sicher in einem BSL-4-Umgebung bei der Durchführung eines Experiments wird visuell hervorgehoben werden. Diese Techniken umfassen: die Einrichtung einer Klasse-II-BSC für Experimente, die richtige Reinigung der Klasse II BSC wenn Sie fertig sind Arbeiten, Abfallwirtschaft und sicheren Entsorgung von Abfällen in einem BSL-4 Labor erzeugt, und die Entfernung von inaktivierten Proben aus dem Inneren eines BSL- 4 Labor auf den BSL-2 Labor.

Introduction

Als Sicherheit von Hoch Folge Erregern Laborpersonal Handhabung (keine Infektion Prophylaxe noch existieren Behandlungsmöglichkeiten) an erster Stelle steht, hat das US Department of Health and Human Services Richtlinien festgelegt für Anlagenbau und Best Practices für die sichere Durchführung von Arbeiten mit Krankheitserregern in der biomedizinischen und klinische Laboratorien aus einer Biosicherheit Perspektive ^1. Durch Gesetze und Vorschriften, haben viele der Praktiken und Verfahren verbindlichen Anforderungen werden, die für die Arbeit mit diesen Erregern befolgt werden müssen. In den USA, Krankheitserreger, die sich leicht von Mensch zu Mensch übertragen werden, führen zu hohen Letalitätsraten und / oder das Potenzial für große öffentliche Gesundheit auswirken und Bioterrorismus haben, werden als National Institute of Health / National Institute of Allergy kategorisiert und Infektions Krankheit (NIH / NIAID) Priorität A Pathogene und oder Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Bioterrorismus Kategorie A Agents ^2. Zusätzlich hIGH-Folge Krankheitserreger werden als Tier - 1 - Agenten auswählen klassifiziert , wenn diese Erreger potenzielle Bioterrorismus Mittel sind, haben das Potenzial für Massenanfall von Verletzten oder verheerende Auswirkungen auf die Wirtschaft, die kritische Infrastruktur oder das Vertrauen der Öffentlichkeit ^3.

BSL-4-Operationen, einschließlich des Zugangs zu den Instituten mit BSL-4 Laboratorien sind höher gesteuert als BSL-2/3-Schaltungen. Zum Beispiel ist es wesentlich schwieriger, Zugang zu einem BSL-4 Labor zu gewinnen im Vergleich zu einem BSL-2 oder BSL-3 Labor aufgrund erheblicher Anzug Ausbildungsanforderungen, umfangreiche mentorship Anforderungen und zusätzliche medizinische Biosicherheit Voraussetzungen. Darüber hinaus gibt es typischerweise mehrere physische Sicherheitssperren in einem BSL-4 - Anlage im Vergleich zu einem BSL-2 oder BSL-3 - Anlage ^4-6. Wie bereits in unserem ersten Artikel über BSL-4 Ein- und Ausstieg beschriebenen Verfahren, durchlaufen Laborpersonal eine umfassende Ausbildung und psychologische Screening für den Eintritt in den BSL-4 Labor ⁷ zu qualifizieren. Within der BSL-4 Labor, Infektionsrisiko und Fehler werden vermieden oder durch folgende etablierten Verfahren gemildert. Die Forschung muss sorgfältig und bewusst mit minimaler Multitasking oder Ablenkungen gehen. Bücken im Überdruckanzüge ist schwierig, und der Gesichtsschutz Verfahren beschränken, wie Mikroskopie. Sperrige Handschuhe behindern die Leistung der Feinmotorik Aufgaben, wie Umgang mit kleinen Gegenständen oder Kennzeichnung Rohre. Zur Zeit verbrachte in BSL-4 Laboratorien zu minimieren, sollten Laborspezialisten Arbeitsabläufe überprüfen Schritte zu identifizieren, die vor uns in einem BSL-2 Labor durchgeführt werden kann und transportieren dann diese Materialien in die BSL-4 Labor für die Durchführung der Aufgabe (n). Wenn Materialien für die Weiterverarbeitung in BSL-2 Labor entfernen, werden die Materialien festgelegt und von der BSL-4-Labor in einem abgedichteten zweiten Behälter entfernt wird. Beispiele von Proben, die umfassen können entfernt werden müssen: Festplatten oder Rohre aus infiziertem Material, das durch enzyme-linked analysiert werden immunosorbent-Assay (ELISA), Immunfluoreszenztest (IFA), oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Neben der besseren physikalischen durch persönliche Schutzausrüstung auferlegten Beschränkungen erforderlich BSL-4 Laboratorien im Vergleich zu denen in BSL-2 Laboratorien, Verfahren zur Inaktivierung von Hoch Folge Pathogenen in Zellkulturplatten und Entsorgung sind strenger als die für weniger pathogenen Viren benötigt in einem BSL-2 Labor untersucht. Zumindest sollten diese Verfahren CDC Anforderung zu erfüllen. Beispielsweise kontaminierte Zellkulturplatten und anderen Materialien, können mit chemischen Reagenzien, wie neutral-gepuffertem Formalin inaktiviert werden. Behandelten Zellkulturplatten oder Rohre sind in Heißsiegelbeutel gelegt werden, die Formalin und entfernt vom Labor über einen dunk Tank mit einem flüssigen Desinfektionsmittel gefüllt ist. Abfall Eimer mit Desinfektionslösungen gefüllt und Spray Desinfektionsmittel eingesetzt werden zur vorübergehenden Abfall während des Experiments und für disi erzeugt Empfangnfecting Handschuhe, Reinigung Biosicherheitsschrank Flächen und Instrumenten sind. Quartären Ammoniumdesinfektionslösung in der Konzentration aufgeführt ist der Goldstandard für alle US-BSL-4 Laboratorien (Barr J, persönliche Mitteilung, 2015) betrachtet. Feste Abfälle aus einem Abfallbehälter autoklaviert Potential für Verunreinigung zu beseitigen.

In einer Anstrengung, um visuell den Arbeitsablauf und die Grenzen der allgemeinen BSL-4-Verfahren zu demonstrieren, verwendeten wir eine Standard viralen Plaque-Assay als ein Beispiel für eine häufig verwendete virale Verfahren. Während der viralen Assay-Verfahren im Allgemeinen beschrieben wird, betonen wir die Biosicherheit Verfahren Sicherheit des Laborpersonals in diesem Protokoll verwendet, um sicherzustellen. Bitte beziehen sich auf frühere klassische Plaque - Assay - Visualisierungen für zusätzliche Hintergrund auf dem Plaque - Assay - Technik ^8,9.

Die Verfahren präsentiert hier folgen Sie den BMBL umrissenen Spezifikationen von CDC ^1. Jedoch sind die vorgestellten Protokollespezifisch für das IRF-Frederick. Jede BSL-4-Anlage verfügt über verschiedene Standardarbeitsanweisungen (SOPs) und Methoden der Operation, die die Durchführung von Experimenten in der BSL-4 Labor auswirken. Alternative Verfahren für die Abfallstrom-Management und Durchführung von Plaque-Assays können auf die Verwaltung und den Betrieb dieser Labors, unterschiedlich sein. Dennoch wird ein allgemeines Verständnis für den Aufbau eines BSL-4-Anzug Labor und Verfahren für die Durchführung der Arbeit mit der Klasse II Schränke im Inneren des BSL-4-Umgebung den Wissenschaftlern helfen, die Einschränkungen und Auswirkungen auf die Sicherheit verstehen, wenn Studien mit hohem Risiko Krankheitserreger betrachten. Eine stärkere Sensibilisierung der externe Mitarbeiter der Schwierigkeiten in einem BSL-4 Labor umgebende Arbeit kann bei der Entwicklung von medizinischen Gegenmaßnahmen in der Forschungsgemeinschaft angepassten Erwartungen und größerer Leichtigkeit führen.

Protocol

1. Labor Eintrag

1. Sammeln Sie alle Lieferungen von einem BSL-2 Labor für das Experiment (zB Zellen, Medien und Verbrauchsmaterialien) vor dem Eintritt in das BSL-4 - Labor.
2. Füllen Sie das BSL-4 Eingabeprozedur (skizziert im Detail in Bezug auf ^7).

2. Herstellung einer Klasse II Biosicherheitswerkbank in der BSL-4-Labor

1. Einmal in der BSL-4 Labor, sorgen für die tägliche interne Checkliste (Abbildung 1) abgeschlossen ist. Füllen Sie die Checkliste, wenn die Checkliste wurde bisher nicht gefüllt worden und zeigen an, welche Viren verwendet werden. Hat der Prüfliste bereits abgeschlossen ist, fügen Sie Namen und das Virus wird in die Liste verwendet werden.
2. Reinigen der Klasse II BSC durch Besprühen der gesamten Innenseite des BSC unten (einschließlich des Flügels) mit 5% dual quartären Ammoniumdesinfektionslösung (beispielsweise n-alkyl Dimethyl benzyl - ammoniumchlorid, n-Alkyl - dimethyl benzyl ethyl AmmoniumChlorid oder andere Desinfektionsmittel geeignet für das Mittel verwendet wird) und wischen Sie mit Papierhandtüchern ^10,11. Spray 70% Ethanol-Lösung im Inneren des Gehäuses und der Flügel die klebrige Desinfektionslösung zu entfernen.
3. Wenn gesetzt, stellen Sie den Stuhl vor der Klasse II BSC in bequemer Höhe , um sicherzustellen , dass die Rückseite des Gehäuses erreicht werden kann und dass das Gesicht des Laborfach oberhalb der vorderen Öffnung (Abbildung 2) ¹¹ gelegen.
4. Bereiten Sie einen Abfallbehälter für die biologische Sicherheit Kabinett. Sicherzustellen, dass die Endkonzentration von dual quartären Ammoniumdesinfektionslösung in den Abfallbehälter ist nicht weniger als 5%. Entsprechend zu planen und machen eine 10% ige Lösung, zu der Abfälle hinzugefügt werden, dass das Desinfektionsmittel zu verdünnen. Darüber hinaus legen Sie eine Sprühflasche mit 5% Dual quartären Ammoniumdesinfektionslösung innerhalb der Klasse II BSC alle Elemente sprühen vor dem Entfernen und behandschuhten Hände während und nach Beendigung des Tests.
<li> Legen Sie die geeigneten Materialien für das gesamte Experiment in der Klasse II BSC benötigt als im Schrank wie möglich weit zurück ¹¹ wiederholt Material Einführungen in die Klasse II BSC und Störung des Luftstroms zu vermeiden.

3. Beispiel: Plaque-Assay

1. Abrufen von virushaltigen Proben und Kontrollvirus vom Lagerort von Hand und auftauen Materialien in einem Inkubator bei 37 ° C.
2. Beschriften Sie die Vertiefungen der 6-Well-Platten verwendet werden nach den Virus Verdünnungen geplant. Markieren Sie die Deckel und Körper der Platten erfolgreich geprüft, um sicherzustellen, wenn die Deckel und Körper getrennt sind.
3. Bringen Sie Materialien aus den Schritten 3.1-3.2 in die Klasse II BSC. Legen Sie alle Gegenstände, die nicht oder nicht in Kontakt kommen mit dem Virus auf einer Seite ( "sauberen Seite") und Abfall auf der anderen Seite haben ( "schmutzigen Seite"). Wenn möglich, "saubere Produkte" mindestens 30 cm von "schmutzigen Elemente" während der Aerosolschaffenden Tätigkeiten ¹1.
4. Arbeiten Sie so nahe an der Innen Mitte der Klasse II BSC wie möglich wird , da die Mitte der effektivste Position zu sein , ist entworfen , um sich schützen ^11.
5. Entfernen Sie 50 ul Virusprobe und Kontrollvirus aufnehmen und in 450 ul Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit 2% fötalem Rinderserum. Gehen Sie mit der Herstellung Reihenverdünnungen so weit als nötig (3A).
6. Während der Verdünnungen, mischen mindestens 5-mal die Virusproben mit einer Pipettenspitze langsam und vorsichtig beim Versuch, Luftblasenbildung in den Proben zu minimieren. Ändern Sie Pipettenspitzen nach jeder Zugabe zum Brunnen neben Verdünnung.
7. In der letzten Verdünnung, nachdem die Probe 5 mal Mischen verwerfen 50 ul Virusprobe in Abfallbehälter gleiche Volumina von Verdünnungen zu gewährleisten.
8. Wenn der Spitzen Entsorgung spülen jede Spitze mit Desinfektionslösung aus dem Abfallbehälter, die innerhalb und außerhalb der Spitze zu dekontaminieren, bevor Expelling Spitze in den Abfallbehälter.
9. Sobald die Verdünnungen hergestellt sind, stellen den Verdünnungs Vertiefungen zur Seite und beginnen Medien aus den Vertiefungen von Zellkulturplatten Ansaugen einer Platte mit 6 Vertiefungen in jeder Vertiefung 500 ul Medien verlassen.
10. Wenn mit der Pipettenspitze, aspirieren Desinfektionslösung aus dem Abfallbehälter an die Spitze der Pipette mit einem manuellen, einstellbare Lautstärke beendet, Tast- Pipettor, korrekte Dekontamination von der Innenseite der Pipette zu gewährleisten. Lassen Sie die Spitze in den Abfallbehälter bis zum Ende des Experiments.
11. Nachdem die Medien von den Platten entfernt wurden, werden 100 & mgr; l der richtigen Probe in die richtige gut in den voretikettierten Platten in doppelter Ausführung, Tipps jeweils für jede Probe zu ändern.
12. Nach Abschluss der Testimpfungen Plaque, abspritzen behandschuhten Hände mit der Desinfektionslösung und ein Papiertuch mit Desinfektionslösung, die außerhalb aller Platten angefeuchtetes zu wischen, bevor die Platten wieder in den Inkubator mit der Hand legen. ReTorf diesen Vorgang, bis alle Platten wieder in den Inkubator sind.
13. Schaukeln Sie die Platten in einer 8 Bewegung richtige Streuung der Probe über die Zellen für 1 Stunde alle 15 Minuten zu gewährleisten.
14. Nach Abschluss der Schwingplatten, Rückplatten in die Klasse II BSC zusammen mit einem Gemisch von 2 x Eagle minimal essential Medium und 1,6% Tragacanth, einer halbfesten Überlagerung, die als Agarose leichter zu handhaben ist, für die Überlagerung des Plaque-Assay verwendet.
15. 2 ml des Overlay-Mischung in jede Vertiefung in einer 6-Well-Platte und Rock wieder in einer Figur-8-Bewegung für eine gleichmäßige Verteilung des Overlay über die gesamte Oberfläche des Brunnens. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis auch jeder verwendet wird, mit dem Overlay Mischung überlagert.
16. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der serologischen Pipette keine Flüssigkeit in den Vertiefungen berührt eine Kreuzkontamination zu vermeiden, wenn das Overlay-Verfahren durchführen.

4. Entsorgung und Reinigung der Instrumente und die biologische Sicherheit Kabinett

<ol>

Völlig überschwemmen alle Abfallmaterial in 5% Desinfektionslösung in den Abfallbehälter für eine Kontaktzeit von mindestens 10 min. Desinfizieren Pipettenspitzen, serologischen Pipetten und andere Abfälle wie oben beschrieben. Darüber hinaus sprühen, um die Abfallbehälter (innen und außen) mit 5% Desinfektionslösung lassen Sie die Lösung bleiben in Kontakt mit dem Abfallbehälter für eine Kontaktzeit von 10 min.

Während der Kontaktzeit warten auf den Abfall verstreichen, ein Papiertuch mit 5% Desinfektionslösung einweichen, wischen Sie Instrumente wie Mikropipetten, und sie von der BSC zu entfernen. Spray behandschuhten Hände mit 5% Desinfektionslösung vor behandschuhten Händen aus der Klasse II BSC zu bringen.

1. Nachdem die Mikro von der BSC zu entfernen, wischen Sie sie mit einem separaten Papiertuch mit 70% Ethanollösung klebrigen Ablagerungen auf den Instrumenten zu vermeiden. Spray alle Instrumente, die nicht effektiv abgewischt werden unten mit 5% Desinfektionsmittel kann und in Kontakt mit der Lösung in der BSC für 10 Minuten verlassen.

Nach einer ausreichenden Kontaktzeit, entfernen Sie alle Elemente aus der BSC. Nehmen Sie Gegenstände, einschließlich Abfall Eimer mit Abfallmaterialien, zum Waschbecken. Spülen Sie Gegenstände, die Desinfektionsmittel Rückstände zu entfernen wiederverwendet werden kann. Zurück alle Einzelteile zu ihren Lagerplätzen.

Reinigen Sie die Klasse - II - Arbeitsfläche des BSC, Schrankseiten und zurück, alle Möbel aus Glas, und Flügel ¹ mit 5% Desinfektionslösung von 70% Ethanol - Lösung.

Herausziehen und entleeren Sie die serologischen Pipetten aus den Abfallbehälter und Ort oberflächen desinfiziert serologischen Pipetten in separate Pipettenschalen für Autoklaven (serologischen Pipetten eine sharps Gefahr darstellen kann und reißen kann durch den Müllsack. Legen Sie diese Pipetten in einem Hartschalenbehälter vor Autoklavierung).

Gießen Sie den Inhalt der Abfallbehälter in einem Sieb im Boden des Beckens platziert.

Bringen Sie ein Biohazard Abfallbehälter, die mit einem roten Biohazard-Tasche zum Waschbecken und Dump den Inhalt der straine ausgekleidetr in den roten biohazard Tasche. Nicht in das Sieb gelangen, um Mikropipettenspitzen zu entfernen, die an der Innenseite des Siebes haften. Hit das Sieb entlang der Innenseite des Abfallbehälters, bis alle Spitzen entfernt werden, oder eine Pinzette verwenden, um Tipps aus dem Sieb zu entfernen.

Spülen Sie den Abfallbehälter und den Ort aus auf dem Gestell neben dem Waschbecken zu trocknen.

5. Autoklavierung Abfall

1. Entfernen Sie die BIOHAZARD Beutel aus dem Biohazard Abfallbehälter und in einem Autoklaven Tablett auf einem Wagen.
2. Lassen Sie Biohazard Taschen öffnen und legen Sie ein Stück Autoklaven Klebeband über die Außenseite des Beutels, die Seiten des Autoklaven Tablett verbindet die Tasche in der Schale gesichert zu halten.
3. Legen Sie zwei Stücke von Autoklaven Klebeband auf der serologischen Schale für Pipettenspitzen und beschriften Sie sie mit eigenen Initialen und das Datum. Legen Sie die serologische Pipette Tablett auf dem Wagen mit dem Autoklaven Fach.
4. Öffnen Sie den Autoklaven. Schließen Sie das mitgelieferte Autoklaven Laden / Entladen cart in den Autoklaven und bringen die versenkbare Autoklaven Plattform auf dem Wagen zur Ruhe aus.
5. Entfernen Sie die Metallstange aus dem Autoklaven und oben offen. Legen Sie einen biologischen Indikator Fläschchen Sporen von Geobacillus stearothermophilus in den Metallstab enthält , um zu überprüfen , dass der Autoklav Sterilisationszyklus erfolgreich abgeschlossen wurde.
6. Platzieren Sie den Metallstab in die Mitte des Abfallbeutel im Autoklaven Fach aber sicher, dass die Metallstange noch leicht zugänglich ist.
7. Legen Autoklav Fach gefüllt mit Abfall und serologische Pipette Tablett auf den versenkbaren Autoklaven Plattform und schieben Sie es wieder in den Autoklaven.
8. Nehmen Sie den Autoklaven Laden / Entladen Wagen aus dem Autoklaven und schließen Sie den Autoklaven Tür.
9. Starten Sie den Autoklaven.
10. Sie nicht den Autoklaven verlassen, bis der Zyklus begonnen hat. Der Betriebsbildschirm des Autoklaven wird die verbleibende Zeit für diesen Lauf an.
11. Nachdem der Autoklav Lauf beendet ist, entfernen Sie die biologische indicator und auf Wachstum durch Erhitzen in einer angegebenen Inkubator bewerten. Wenn das Wachstum auf dem biologischen Indikator erkannt wird, wieder laufen, den Müll in den Autoklaven und zu beurteilen, neu Indikator. Wenn kein Wachstum festgestellt wird, entfernen Sie den Müll aus der Anlage.

6. Beispiel: Fixierung und Färbung von Plaque-Assays

1. Nach der entsprechenden Anzahl von Tagen (die auf das Virus abhängt verwendet) verstrichen ist, wieder zurück ins Labor und führen Sie die Schritte aus den Abschnitten 1 und 2 wieder.
2. Plaque-Assay-Platten aus dem in Schritt abgeschlossen Inkubator 3.1.2, aufnehmen und in der Klasse II BSC mit der Hand vorsichtig entfernen.
3. Pipette aus allen Medien und Overlay - Material und verzichtet in Desinfektionslösung Behälter und ersetzen mit einem Gemisch aus 10% neutral gepuffertem Formalin und 0,8% Kristallviolett ^12,13. Lassen Sie die Mischung auf den Platten für 30 min bleibt das Virus auf den Platten zu inaktivieren.
4. Nach der Inaktivierung entfernen Sie vorsichtig die neutralgepuffertem Formalin / Kristallviolett-Gemisch und in einem separaten Abfallbehälter werden vor der Entsorgung neutralisiert.
5. Spray behandschuhten Hände mit Desinfektionsmittel und wischen Sie die Außenseite der Platten vor ihnen aus der Klasse II BSC vorbei, wie oben beschrieben.
6. Fahren Sie mit dem Waschbecken, Spülen Sie die Platten überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und dann legen die Platten auf einem Wagen, um zu trocknen.
7. Sobald die Platten vollständig trocken sind, verwenden Sie eine Lichtbox die Plaques zu zählen. Aufzeichnen alle Zählungen und Virustiter aus der Standardgleichung (3B) berechnen.

7. Entnahme von Proben aus dem BSL-4-Labor

1. Inactivate alle Proben, die unter BSL-2 Laborbedingungen werden manipuliert werden. Folgen einem von zwei durch das interne Biosicherheit Büro anerkannten Methoden an der IRF-Frederick mit 10% neutral-gepuffertes Formalin (NBF) oder Trizol LS (phenol, Guanidinisothiocyanat, Ammoniumthiocyanat, Natriumacetat, Glycerol) ^1,14. Transfer samples auf ein neues sauberes Röhrchen oder Platte außerhalb der BSC vor der Verpackung zur Entnahme aus der BSL-4-Labor.
2. Heißsiegel inaktivierten Proben in Röhren oder Platten in Heißsiegel Beutel mit ausreichend 5% Desinfektionsmittel oder Fixierungslösung in das Innere des Beutels und die Außenseite der Probenröhrchen Übertragung aus dem Labor BSL-4 unterzogen zu desinfizieren. Dieses Beutel in einen anderen Beutel folgende gleiche Verfahren.
3. Verschließen Sie den zweiten Beutel und legen Sie die heißgesiegelten Beutel in einen dunk Tank mit 5% Desinfektionslösung für mindestens 10 Minuten, um die Außenseite des wärmeversiegelt Beutel zu desinfizieren.
4. Füllen Sie einen Dunk Tank Logbuch in das Labor aus, indem Sie die Anzahl und Größe der Rohre Abgrenzen, das Volumen in den Rohren, Mittel verwendet wird, Inaktivierungsverfahren verwendet, und Raum, wo Proben werden übertragen.
5. Koordinieren Sie sich mit einem Kollegen auf der Außenseite des BSL-4 Labor den Beutel aus dem dunk Tank zu holen und nehmen Proben an das BSL-2 Labor.

Representative Results

Nach korrekter Verfahren innerhalb der BSL-4 Labor sind von entscheidender Bedeutung für die sichere und effiziente Durchführung von Tests zu gewährleisten. Unter Bezugnahme auf die abgeschlossene tägliche interne Checkliste (Abbildung 1), sicherzustellen , Laborpersonal , dass das Gerät voll funktionsfähig ist. Die richtige Körperhaltung in der Mitte der BSC stellt sicher , dass das Experiment unter optimalen Luftströmungsbedingungen (Figur 2) durchgeführt wird. Die Virusprobe wird seriell verdünnt Platten zu erhalten , die 30 bis 300 Plaques pro Platte (3A) und um zu bestimmen Virustiter (3B) haben. Eine Reihe von Faktoren beeinflussen die Bildung von Plaques, einschließlich Virus Tropismus für Wirtszelllinien, Inokulation Technik, die Bedingungen für das Viruswachstum, geeignete Verdünnungsbereich und Overlay - Auswahl ^8. Abfall in der BSC während des Verfahrens erzeugt wird, ordnungsgemäß vor dem Entfernen von der BSC desinfiziert und wieder vor dem Autoklavierendie BSL-4-Umgebung zu verlassen. Durch die folgenden Verfahren, keine Labor erworbene Infektionen wurden bei BSL-4 Forschung an der IRF-Friedrich aufgezeichnet worden sind.

Abb . 1: Beispiel tägliche interne Systeme Checkliste Täglich Abschluss dieser Checkliste stellt sicher , dass das Laborpersonal Geräte innerhalb des Labors (vor allem die BSC) vor Beginn der Arbeit überprüft hat. Wenn der BSC gefunden außerhalb des kalibrierten Bereichs ist, muß diese BSC nicht verwendet werden, und die Wartung gemeldet werden soll. Alle BSCs sind ordnungsgemäß zu kalibrieren und funktionieren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zahl . 2: Rücken- und Seitenansicht eines Laborfach Pipettieren Proben in einer Klasse II Biosicherheitsschrank (A) Abfall Eimer gelb Desinfektionslösung und gebrauchte Pipetten enthalten , sind auf der rechten Seite der Well - Platten (B) und das Desinfektionsspray - Flasche ist zu das Recht der Abfallbehälter (A). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Berechnung der Virustiter von Proben Viral Titer als Plaque bildende Einheiten ausgedrückt wird (pfu) pro ml.. Um die viralen Titer zu berechnen, zählen die Anzahl der klar definierten Plaques (pfu) und Dividieren durch das Produkt aus dem Verdünnungsfaktor (d)-fache des Volumens des verdünnten Virus in die Vertiefung gegeben (V).d / 53600 / 53600fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die Arbeit in einem BSL-4 Labor erfordert viel Zeit und zusätzliche Aufmerksamkeit zum Detail. Jede Art von Arbeit in diesem Umfeld erfordert gut ausgebildete, gründlich und gewissenhaft Einzelpersonen. Die Standard-Virus-Plaque-Test liefert ein genaues Modell eines gemeinsamen Verfahrens für die mit hoher Folge Krankheitserregern in der BSL-4 Labor, wie der Test mehrere wichtige Konzepte beinhaltet, in dem Laborpersonal geschult werden müssen.

Die erste große Konzept ist die richtige Verwendung und Anwendung von sicheren Praktiken in der Klasse II BSC, die für hoch Folge Erreger als Primärsicherheitsfunktionen. Verstehen, wie eine Klasse-II-BSC-Funktionen Praktiken diktieren, die sich stark Expositionsrisiken für Personen begrenzen. Arbeitsablauf aus einem sauberen Bereich ( "sauberen Seite") zu einem kontaminierten Bereich ( "schmutzigen Seite") über die Arbeitszone in der Klasse II BSC hilft auch ¹¹ eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Saubere und kontaminierten Materialien und supplies sollte die Bewegung von kontaminierten Gegenständen über saubere Gegenstände zu begrenzen, getrennt werden.

Das zweite wichtige Konzept ist physikalischen und biologischen Abfallwirtschaft. Die richtige Schritte in beide Arten der Entsorgung von Abfällen sind von wesentlicher Bedeutung bei der Sicherstellung, dass die Labor-Spezialisten bleibt sicher und die Umwelt nicht kontaminiert ist. Schritte während eines Experiments sind so konzipiert, Krankheitserreger zu inaktivieren und zu zerstören, bevor Proben aus BSL-4 Labor gebracht. Beispiele für solche kritischen Schritte umfassen: Pipettieren Desinfektionsmittel in jeder Spitze, so dass mindestens 10 min Kontaktzeit von möglicherweise kontaminiertem Material mit Desinfektionsmitteln, Autoklavierung Abfall und Sterilität während Autoklavierungen validieren. Diese Schritte werden so konzipiert, dass redundante Zerstörung von Hoch Folge Pathogene zu gewährleisten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro-Chem Plus	National Chemical Laboratories	255
Ethanol	Fisher	BP2818500
2 ml 96-Deep Well Plates	Fisher	278743
10 ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11E
25 ml Serological Pipette	Fisher	13-678-11
6-well plates	Fisher	140675
Crystal Violet	Sigma	HT90132-1L
10% Neutral Buffered Formalin	Fisher	22-050-105
Tragacanth	Fisher	50-702-2000
20 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-550
200 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-561
1,000 μl Pipette Tips	Fisher	21-402-581
DMEM	Lonza	12-604Q
FBS	Sigma	F2442-500mL
Penicillin/Streptomycin	Lonza	17-602E
2x EMEM	Quality Biological	115-073-101
Pipettor	Drummond	4-000-101
1,000 μl Pipette	Rainin	L-1000XLS+
200 μl Pipette	Rainin	L-200XLS+
12-Well, Multichannel 200 μl Pipettor	Rainin	L12-200XLS+
8-Well, Multichannel 1,000 μl Pipettor	Rainin	LA8-1200XLS
Attest	Express Medical Supplies	MMM12192
Autoclave	Getinge	GEB 2404 AMB-2
Autoclave Bag	Fisher	01-828E
2,000 ml Beaker	Fisher	02-591-10H
Autoclave Tray	Fisher	13-359-20B
Pipette Tray	Fisher	13-361-5
37 °C Incubator	Fisher	WU-39321-00
Biohazard Can	Rubbermaid Commercial	FG614500 RED
Autoclave Tape	Fisher	15-903
Autoclave Rod	Made by IRF Facility	N/A
Light Box	Fisher	S11552
Heat Sealer	Fisher	NC9793612
Heat Seal Pouches	Fisher	01-812-25H
Biohazard Bag	Fisher	01-828E