Summary
Bioluminescens billeddannelse er en velkendt værktøj til lokalisering af tumorer og metastaser, men kvantificering af disse billeder kræver ofte komplicerede beregninger og bestemte instrumenter. Vi beskriver den nemme at bruge luminoscore metode, baseret på præcise betingelser erhvervelse, der kræver ingen beregninger, og gør det muligt for tumor byrde og behandlingsrespons skal overvåges i musemodeller.
Introduction
Tidlig opdagelse tumorceller fortsat en udfordring og er afgørende for at øge kræftbehandling effektivitet. In vivo bioluminescens imaging (BLI) er en meget følsom, noninvasive optisk teknik, i vid udstrækning anvendes til overvågning af tumorer i små dyr. Ildflueluciferase-udtrykkende celler anvendes almindeligvis til sådanne forsøg 1,2. Denne oxygenase oxiderer D-luciferin med molekylært oxygen men kræver to cofaktorer - Mg 2+ og adenosintriphosphat 3. Ildflueluciferase er mere egnet til in vivo-billeddannelse end renilla luciferase 4 fordi dens kvanteudbytte er højere.
Den oxiderede substrat - oxyluciferin - spontant udsender en foton at vende tilbage til dens grundlæggende tilstand og derefter bliver inaktiv. De udsendte fotoner har en maksimal bølgelængde omkring 530 nm. En høj følsomhed Kameraet kan registrere de luminescerende fotoner fra indersiden af et lille dyr og levere billeder, der gør det POSSsible at lokalisere tumorceller.
Evnen til at kvantificere tumorbelastning præcist ved fotontællinger kunne tjene som et effektivt og følsomt værktøj til kvantificering behandlingseffekt. Fordi behandlingseffekt kan påvises tidligere, kunne denne følsomhed gør det muligt at bestemme det nøjagtige tidspunkt, hvor en behandling bliver effektiv.
Absolut kvantificering af totale udsendte fotoner er meget kompleks. Antallet af fotoner indsamlet afhænger af dybden af tumoren og organer fotonerne udsendes igennem. Justeringskoefficienter baseret på væv absorptionskoefficienter kan beregnes 5, men den absolutte kvantificering af tumor celleantal kræver kende antallet af fotoner, der udsendes af hver tumor celle. Desuden luciferaseekspressionen, ligesom mange reportergener (fx., Fluorescerende proteiner) ikke er homogen, selv i en cellepopulation afledt af en enkelt klon 6. Antallet af luciferASE proteiner i cellerne kan ikke beregnes præcist. Etableringen af standardiserede forsøgsbetingelser synes derfor afgørende for en pålidelig semi-kvantitativ analyse.
Vi anvendte luminoscore metode til to forskellige mus lymfom modeller 7,8,9. I disse modeller er syngene tumorceller injiceres i øjet eller under huden for at opnå henholdsvis en primær intraokulær lymfom (Piol) model og en subkutan lymfom (SCL) model. I hvert af disse ortotopisk modeller, er behandlingen administreres in situ, syv dage efter inokulation af tumor for Piol og når tumoren har nået 0,5 til 0,7 cm i sin største diameter for SCL.
Vi brugte luminoscore metode til at overvåge virkningerne af in situ CpG terapi, tidligere vist sig at være effektiv 7,10,11. CpG er en oligonukleotidsekvens og en ligand af TLR9, som igen er en intracellulær receptor udtrykt ved talrige ceLLS i immunsystemet, herunder dendritiske celler, B-lymfocytter, monocytter og naturlige dræberceller. CpG-DNA er et 20-mer DNA-sekvens, der indeholder CpG (CG) immunstimulerende motiv; kontrollen (ODN-kontrol) er den samme 20-mer DNA-sekvens, bortset fra at det immunstimulerende CG-sekvensen er inverteret (GC). TLR9 engagement i den murine lymfom vi studerer inducerer apoptose 10, aktiverer immunforsvaret 12, og derved reducerer tumorbelastning 7,11 betydeligt.
Her beskriver vi en standardiseret metode til kvantificering tumor byrde og behandlingsrespons gennem selvlysende billeder. Denne metode bygger på forskellige aspekter af imaging procedure, fra køb til analyse, for at optimere pålidelighed, reproducerbarhed, ikke-brugeren afhængighed, og statistisk signifikans. En bioluminescens kvantificering indeks henføres til hvert mus; denne værdi, som vi kalder en luminoscore, kan sammenlignes ikke kun mellem dyr, men alså mellem eksperimenter.
I dette arbejde har vi fokus på den billeddannende procedure bioluminescens samt billedet kvantificering af luminoscore metoden. Vi viser effektiviteten af denne metode til kontrol af injektionen, overvågning tumor byrde, og vurdere effekten af in situ kræftbehandling. Hvert af disse punkter er illustreret i repræsentative resultater fra forsøg med forskellige musemodeller for at fremhæve tilpasningsevne luminoscore metode.
Protocol
Alle procedurer, der involverer mus overholdt EU-retningslinjer, fransk regler for dyreforsøg (landbrugsministeriet lov nr 2001-464, maj 2001), og retningslinjerne fra Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) Udvalget om Animal Research, og blev godkendt af den relevante lokale udvalg (Charles Darwin etiske komité for dyreforsøg, Paris, Frankrig, Permit Antal: p3 / 2009/004).
1. Cell Fremstilling
- Grow muse B lymfom cellelinie A20.IIA-luc2 i RPMI-1640 Glutamax medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 ug / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM natriumpyruvat, 50 uM 2-mercaptoethanol og 0,50 mg / ml hygromycin B.
- Oprethold cellekultur ved 37 ° C, 5% CO2 og ændre medium hver to til tre dage. Harvest 5 ml af cellesuspensionen med en pipette en dag efter at ændre mediet.
- Spin celler ved 3005; g i 10 minutter og suspendere cellerne i 3 ml sterilt phosphatbufret saltvand (PBS). Gentag dette trin to gange for at vaske cellerne.
- Bland 15 pi cellesuspension med 30 pi Trypan Blå mærkning, før du lægger en Malassez tællekammer. Beregne koncentrationen celle med formlen: Koncentration (celler / ml) = Antallet af celler i optællingen gitter * 3 * 1.000.
- Spin celler en gang mere ved 300 xg i 10 min. Fjern supernatanten med en pipette. Med C koncentrationen beregnet i trin 1.4), antallet af celler er N = C * 3.
- Beregn volumen sterilt PBS 1x kræves for at opnå cellesuspension A ved en koncentration på 5 x 10 7 celler / ml med den følgende formel: PBS Volume (ml) = N / (5 x 10 7). Cellepelletten suspenderes (fra trin 1.5)) i mængden af sterilt PBS 1x beregnet i foregående sætning. Cellesuspension A skal anvendes i SCL model (in vivo injicerede volumen er 100 pi: 5 x 10 6 cellers).
- Afpipetteres 10 pi cellesuspension A og tilføje 90 pi sterilt PBS i et 1,5 ml rør til opnåelse af 100 pi cellesuspension B med 5 x 10 6 celler pr. Cellesuspension B skal anvendes i Piol model (in vivo injicerede volumen er 2 pi: 1 x 10 4 celler).
2. Luciferin
- Fortynd 1 g D-luciferin kaliumsalt pulver i 30 ml sterilt PBS 1x i et 50 ml rør og omrystes i et par sekunder for at opløse aggregaterne.
BEMÆRK: Da luciferin er lysfølsom, forberede 500 pi alikvoter i mørke 1,5 ml mikrocentrifugerør. - Opbevar de afmålte mængder ved -20 ° C.
BEMÆRK: Portionerne kan opbevares i flere måneder.
Efter optøning skal portionerne ikke opbevares i mere end 1 dag ved + 4 ° C. Frysning-optøningscykler foretrækkes til opbevaring ved 4 ° C. - Injicer 100 pi D-luciferin kaliumsaltopløsning intraperitonealt for hver billeddannelse ASSAy.
BEMÆRK: Denne løsning svarer til 3,3 mg pr musen til en dosis på 150 mg / kg.
3. Anæstesi Blanding og bedøvelse
- Der laves en bedøvende opløsning ved blanding ketamin 120 mg / kg og xylazin 6 mg / kg i sterilt PBS 1x.
- Indsprøjtes 60 ul anæstesiblanding intraperitonealt for hver imaging assay med en 25 G nål. Til operation (med Piol eller SCL model), injiceres 80 pi af blandingen for at opnå en dybere anæstesi. Sæt musen tilbage i sit bur.
- Når musen synes immobil, fjerne det fra dets bur og forsigtigt klemme musens ben mellem fingrene. Hvis musen reagerer med en flugt refleks, vent adskillige minutter. Gentag handlingen, indtil musen ikke reagerer, som bekræfter tilfredsstillende bedøvelse.
- Placer musen på en varmeplade eller under en opvarmning lys.
- Påfør øjensalve at undgå øjet tørhed under bedøvelse for imaging assay eller til SCL kirurgi. Påførøjensalve efter operation for Piol model.
4. Kirurgi og Cell Podning
BEMÆRK: Udfør alle kirurgiske procedurer på en varmeplade eller under en opvarmning lys, i en type 1 mikrobiologiske sikkerhed kabinet i et dyr biosikkerhed niveau 2 facilitet. Alle kirurgiske værktøjer, der anvendes i dette afsnit blev autoklaveres før brug.
- Subkutan lymfom Model:
- Fremstilling af 100 pi af cellesuspensionen opnået i trin 1.6 i en 1 ml sprøjte med en 25 G nål. Forsigtigt klemme musen huden på flanken mellem fingrene, på injektionsstedet. Stik nålen præcist i folden huden. For at sikre subkutan injektion, skal du ikke placere nålen dybt ind i vævet.
- Injicere cellerne i skinfold. Observere, om lidt flydende kugle viser sig under huden for at bekræfte, at injektionen blev udført korrekt.
- Fremstilling af 100 pi af cellesuspensionen opnået i trin 1.6 i en 1 ml sprøjte med en 25 G nål. Forsigtigt klemme musen huden på flanken mellem fingrene, på injektionsstedet. Stik nålen præcist i folden huden. For at sikre subkutan injektion, skal du ikke placere nålen dybt ind i vævet.
- Piol model:
BEMÆRK: Denne proceduren kræver 2 operatører, der er nævnt her som operatør 1 og operatør 2.- Fjernelse af conjunctiva:
- Har Operatør 1 sted musen under et dissektionsmikroskop. Tryk forsigtigt med fingrene på hver side af øjet for at rydde det. Fastholde denne position.
- Har Operatør 2 l ook gennem dissektionsmikroskop. Grip bindehinden med en lille tang i den ene hånd; med den anden hånd, skære conjunctiva lige under tænger med et par små kirurgiske sakse.
- Har Operatør en frigivelse øjet af musen presset i trin 4.2.1.1)
- Cell injektion:
- Forbered en 10-pi stump præcision sprøjte. Vask det ved at pumpe sterilt deioniseret vand gennem det. Gentag to gange eller tre gange for at sikre, at der ikke er nogen bobler i sprøjten. Så forberede 2 pi celle suspension til injektion.
- Har Operatør 2 tryk forsigtigt med fingrene på dene hånd på hver side af øjet for at rydde det. Fastholde denne position.
- Har Operatør 1 greb kanten af øjet med en lille tang i den ene hånd og træk det forsigtigt tilbage for at strække vævet.
- Har Operatør 2 l ook gennem dissektionsmikroskop. Med den anden hånd, lave et lille hul i ringere øjeæblet af musen med en 32 G nål.
- Har Operatør 2 satte nålen og afhente (med samme hånd) præcision sprøjte og stik nålen ind i hullet i trin 4.2.2.4.
- Har Operatør 1 tryk på sprøjtens stempel med den anden hånd.
- Har Operator 2 v erify med dissektionsmikroskop at cellesuspensionen i sprøjten er blevet korrekt injiceret inde i øjeæblet (væskestrømmen er let observerbare).
- Har Operator 2 r eFlyt præcisionen sprøjten.
- Har Operatør 1 r Elease kanten af enimal eye grebet i trin 4.2.2.3)
- Har Operator 2 r Elease siderne af øjet der presses i trin 4.2.2.2)
- Påfør straks øjet salve.
BEMÆRK: Hvis der blev udført alle trin korrekt, bør musen ikke bløder på alle under denne procedure.
- Fjernelse af conjunctiva:
5. Bioluminescens Imaging - Dag 0
BEMÆRK: Alle produkter injiceret i musen skal være stuetemperatur før injektion. Efter tumorcellerne er blevet podet, og mens dyret stadig er bedøvet, fortsætte til disse trin for den billeddannelse.
- Tænd for imager og åbn erhvervelse software. Initialiser kameraet, etaperne, og linserne ved at klikke på knappen "Initialiser". Initialiseringen vil tage 10 til 15 minutter for at være komplet.
- Injicer 100 pi D-luciferin kaliumsaltopløsning intraperitonealt med en 25 G nål. Må ikke gives det intravenøst. Hvis intravenouadministration kræves en eller anden grund skal D-luciferin natriumsalt anvendes i stedet for D-luciferin kaliumsalt.
BEMÆRK: Luciferin er den overskydende reaktant ved denne koncentration; derfor bioluminescens signal når et plateau efter 3 til 7 minutter og fortsætter i mere end 30 min. - 10 min efter D-luciferin injektion 13, placere emnet musen i imager. Placer musen i sin naturlige position, ryggen mod kameraet, i så flad position som muligt. Denne position er naturligt og nemt reproducerbar.
- Marker funktionen auto-eksponering, og klik på Acquire at erhverve ryggen (posterior) billede af dyret, med funktionen auto-eksponering.
BEMÆRK: Funktionen Auto-eksponering optimerer eksponeringstid ved at beregne det fra en 1-sek eksponering billede. Hvis musens bioluminescens signal er negativ eller meget lav, kan den optimale eksponeringstid væreautomatisk til mere end 20 min. I dette tilfælde kan en eksponeringstid på 8 til 10 min være et godt kompromis. Eksponeringen kan indstilles manuelt, men billederne må ikke indeholde mættede pixels. - Vend musen på at blotlægge den forreste del af musen til kameraet. Forsøge at flade musen og sprede sine forreste lemmer, så de ikke blokerer brystet.
- Erhverve en forreste billede af dyret. Kontroller, at afkrydsningsfeltet auto-eksponering stadig er markeret, og klik igen på "Acquire" knappen.
BEMÆRK: Den forreste billede kan erhverves, før ryggen billede og vice versa. Eksponeringstid på forreste og bageste billeder kan være forskellige afhængigt af den relative intensitet af hver side af musen. Den beregnes automatisk, når du bruger funktionen auto-eksponering. Kvantificering bruger kun fotonflux (fotoner per sekund) og afhænger ikke af eksponeringstiden. - Placer musen på en opvarmning plate eller under en opvarmning lys, indtil den genindvinder fra bedøvelsen og derefter placere den tilbage i sit bur.
6. Bioluminescens Imaging - Efter dag 0
- Tænd for billeddanneren, initialisere kameraet, etaperne, og linserne som i trin 5.1).
- Bedøver musen med en intraperitoneal injektion af 60 pi af ketamin (120 mg / kg) / xylazin (6 mg / kg) blanding (se trin 3.1 til 3.5).
BEMÆRK: Denne metode bedøvelse tillader imaging hver 5 dage. For at udføre daglige billeddannelse, en metode, der bruger isofluran som bedøvelsesmiddel og en bioluminescens billeddanner egnet til anvendelse med denne bedøvelsesmiddel er påkrævet. - Anskaf og bagside billeder af dyret, ved hjælp af funktionen auto-eksponering, som i trin 5.5) og 5.6). Håndter musen som i trin 5.7).
7. Bioluminescens Kvantificering og billedanalyse
BEMÆRK: luminoscore Metoden er baseret på billedet analysis. Når billederne er erhvervet i henhold til ovenstående trin, kan kvantificering udføres til enhver tid (herunder umiddelbart efter overtagelsen), at knytte en luminoscore til hver mus på hvert tidspunkt.
- Vis "Tool Palette" ved at klikke på "Vis" menuen og derefter klikke på "Tool Palette", hvis ikke allerede er vist. Klik på "ROI Tool" fanen i værktøjspaletten. Vælg knappen "Contour", og derefter vælge "Free draw".
- Manuelt markere interesseområdet (ROI) omkring musen ved at følge kanter musen på front view. Luk konturen med et højreklik på computermus.
- Klik på menuen "Vis" og derefter "ROI målinger". Kontroller, at "Radiance (Fotoner)" er valgt i "Måling Types" rulle menuen nederst til venstre af "ROI Målinger" vinduet. Hvis ikke, skal du vælge det. Derefter måler foton flux (ph / s) ved at optage værdien i "Total Flux [p / s]" boksen.
BEMÆRK: Brug ikke Radiance eller anden enhed, der er i forhold til ROI overfladeareal. - Gentag trin 7.2) og 7.3) for den bagfra.
- Sum de to fotonflux værdier opnået fra forsiden og bagsiden visning. Resultatet er luminoscore.
- Sammenligne værdierne for hver gruppe anvendelse af en passende statistisk test (ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney-test, for eksempel) 14.
Representative Results
Den Luminoscore Method kan tjene til at Kontroller Tumor Cell Injection
I model involverer injektion af et lille antal tumorceller eller når injektionsstedet ikke tillader visuel kontrol af injektion, kan det være meget vanskeligt at sikre kvaliteten af injektionen. Den luminoscore metode fungerer som en hurtig og praktisk værktøj til at kontrollere kvaliteten af proceduren og konstatere hurtigt og ubesværet, at alt gik rigtigt. I begge modeller, tumoren kan detekteres så tidligt som 10 minutter efter injektion (figur 1A). Billederne selv tilstrækkelige at kontrollere, at tumorceller er til stede i den korrekte placering. Ikke desto mindre, kvantificere billederne giver et indtryk af heterogenitet af injektionen. Prikken plot (figur 1B) viser tydeligt en forskel mellem dyr, der modtog (sorte prikker) og ikke receive (rød linje) injektioner. Interessant nok opnået i SCL model signalet er 100 gange højere end i Piol model; dette fund er i overensstemmelse med antallet af celler injiceret (5 x 10 6 og 1 x 10 4 celler, henholdsvis).
Figur 1. Verifikation af Injektion i forskellige mus lymfom modeller. De luminoscores målt 10 min efter tumorcelleinokulering i forskellige lymfom modeller. (A) Repræsentative billeder af begge modeller. (B) Luminoscore af hvert dyr i de forskellige modeller. Den røde linje svarer til den gennemsnitlige baggrundsstøj målt på 10 dyr inden tumorcelleinokulering; de punkterede linier er gennemsnittet +/- standardafvigelsen. For hver model, kan alle dyrene skelnes fra baggrundsstøj. I Piol model, 1 x 10 4 celler inoculated i glaslegemet af det højre øje, og i SCL-modellen, 5 x 10 6 celler subkutant i hver flanke af musen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Overvågning Tumor Burden og behandlingsrespons
Den luminoscore er også et effektivt værktøj til at studere tumorvækst og behandlingseffekt. Figur 2A viser repræsentative billeder af overvågningen af tumorvækst i kontrollen og CpG behandlede Piol grupper. Musene blev inokuleret med 1 x 10 4 tumorceller hver, og behandling blev administreret in situ på dag 7. Billederne viser, at efter et tilstrækkeligt tidsrum (28 dage), begyndte metastaser vises i kontrolgruppen. Selv om den primære tumor ikke syntes følsom over for behandling, færremetastaser observeredes i CpG-behandlede gruppe (Tabel 1). Den kvantitative analyse af tumorbelastning i hver gruppe (figur 2B) viser, at CpG bremset tumorudvikling, der producerer en statistisk signifikant forskel mellem de behandlede og gruppen kontrol efter 28 dage (ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney-test p = 0,0079 ). Alligevel tumorerne voksede stadig i de behandlede mus, og ingen af dem overlevede (data ikke vist). Dette fund er i overensstemmelse med tidligere rapporter: CPG har ingen væsentlig indvirkning på primære okulære tumorer 10. Den signifikant effekt, at vi har her mellem ODN og CpG gruppen kommer fra metastaser væksthæmning.
Figur 2. Overvågning Tumor Burden og behandlingsrespons. (A) Repræsentative billeder af de to grupper (ODN-kontrol og CpG-behandlet) of Piol-bærende mus. (B) Overvågning tumor byrde med luminoscore. Som set på punktdiagram, virkningen af CpG på luminoscore er signifikant på dag 28. I disse to grupper, denne metode gjorde det muligt at overvåge tumorbyrde og måle let, men signifikant (p = 0,0079) virkninger af CPG DNA, som ikke kunne have opdaget billeder alene. klik her for at se en større version af dette tal.
| grupper | Mus | Tilstedeværelse af metastaser | Beliggenhed | Fotonflux (pH / s) |
| CpG | 1 | Ingen | X | X |
| 2 | Ja | 9.32E + 05 | ||
| 3 | Ingen | X | X | |
| 4 | Ingen | X | X | |
| 5 | Ja | Eye-drænende lymp node | 2.21E + 07 | |
| ODN | 1 | Ja | Eye-drænende lymp node | 1.06E + 07 |
| 2 | Ja | Eye-drænende lymp node | 7.25E + 07 | |
| 3 | Ja | Eye-drænende lymp node + kontralaterale | 7.64E + 08 | |
| 4 | Ja | Eye-drænende lymp node + kontralaterale | 1.74E + 09 | |
| 5 | Ja | Eye-drænende lymp node + kontralaterale | 9.76E + 07 |
Tabel 1. Than Luminoscore Method kan tilpasses forskellige tilgange
Den luminoscore metode er ikke begrænset til en enkelt type musemodel. Figur 3 viser, at det kan tilpasses forskellige musemodeller. I SCL-modellen to tumorer podet på hver side af musen. Behandlingen administreres in situ til en enkelt side på dag 0, og den kontralaterale tumor tjener som kontrollen (figur 3A). Derfor blev to ROI trukket pr mus: en for hver side (figur 3C). Forholdet mellem luminoscore på de behandlede og kontrol sider beskriver den relative forløb hver tumor. Dette forhold blev angivet til 1 på dag 0, når behandlingen blev administreret. Vi observerede et signifikant fald i dette forhold 13 dage efter behandling administration (figur 3D, ikke-parametrisk to-halet Mann-Whitney-test p = 0,004). Denne formindskelse viser, at den behandlede side tumorer blevet resorberet, som vist på de repræsentative bioluminescens billeder (figur 3B).
Figur 3. Tilpasning af Luminoscore metode til en model med to primær tumor steder. (A) Eksperimentel design af en SCL assay. Musene blev injiceret med to primære tumorer i hver flanke. Den ene side injiceres med enten CpG-DNA eller ODN-kontrol, og den anden side med PBS, for at tjene som kontrol. (B) Repræsentative billeder af CpG-behandlede mus og kontrolmus på dag 0 og dag 13. Behandlingen blev administreret på dag 0. Tumorvækst blev inhiberet på CpG-behandlede side af musen. (C) den manuelt markeret regioner af interesse per dyr til to primære tumorsteder. (D) forholdet mellem luminoscores af CpG-behandlede eller ODN-kontrol side og PBS-kontrol side er et indeks, derafspejler den relative vækst af hver tumor under det samme dyr. Dette forhold blev angivet til 1 på dag 0. På dag 13, havde forholdet mellem CpG-behandlede gruppe faldt signifikant (p = 0,004), afslørende hæmning af tumorvækst ved in situ administration af CpG-DNA. Venligst klik her for at vise en større version af denne figur.
Discussion
Lysabsorption organer og væv er fortsat en begrænsning af bioluminescens imaging, selv om denne begrænsning er uløseligt forbundet med enhver optisk billeddannelse modalitet. I forbindelse med vor strategi, forventes virkningerne af anatomiske strukturer på luminoscore at have lav variabilitet forudsat at undersøgelser udføres i en given model (placering og muse-streng), hvilket muliggør derefter sammenligninger. Bioluminescens behøver ikke excitationslys og dermed er mere tilpasset hele kroppen in vivo billeddannelse end fluorescens.
Rumlig opløsning er også en begrænsning af bioluminescens imaging, og præcis placering af orglet, hvorfra bioluminescens fotoner udsendes fortsat vanskelig. godt kendskab til modellen, kan imidlertid hjælpe i den kvalitative placering af tumor sites. Den eneste udgang i denne bioluminescens-baserede metode er luminoscore. Placering påvirker ikke luminoscore fordi den manuelle mark-up Region Interest (ROI) dækker hele mus. Endelig ildflueluciferase kræver oxygen. Følgelig bioluminescens billeddannelse sædvanligvis undervurderer nekrotiske tumorer. Endnu en gang er et godt kendskab til dette aspekt af modellen kræves.
I dette papir, er vi ikke det formål at vurdere effekten af CpG som et anti-tumor lægemiddel (som allerede er påvist 7,9,11), men for at beskrive en fremgangsmåde, der muliggør sammenligning af bioluminescens datasæt. Vi beskriver faktisk er en metode til at kvantificere tumorbelastning skal hjælpe standardisere erhvervelse protokol for sammenligning af forskellige assays på forskellige steder på forskellige tidspunkter og som ikke kræver computerberegninger. For at sikre reproducerbarhed og korrekt fotonflux kvantificering, skal den billeddannende enhed kalibreres med en let reference for hjemmelavede enheder eller som anbefalet af leverandøren til kommercielle enheder.
Vores protokol kræver omhyggelig opmærksomhed på flere kritiske points: (i) det første er kvaliteten af musen anæstesi er afgørende for at opnå klare billeder, især i tilfælde med tider lang eksponering. (Ii) Kvantificeringen Enheden skal altid være fotonflux fordi udstråling afhænger af overfladearealet af hver mus og kan være irrelevant for sammenligning af forskellige mus. (Iii) De bioluminescens billeder må ikke indeholde mættede pixels, fordi disse ville bias luminoscore. (iv) Ryg- og erhvervelse er forpligtet til at indsamle alle fotoner, der udsendes fra tumor (dvs. kan forreste erhvervelse ikke nødvendigvis afsløre fotoner fra bagsiden af tumor). Forskellige forskellige investeringsafkast tegninger blev testet under udviklingen af den luminoscore metoden. Kun den manuelle mark-up givet tilfredsstillende resultater, der er mere tilbøjelige til at være statistisk signifikant (data ikke vist).
Inoue et al. anbefaler en luciferin dosis på 75 mg / kg 13. Ved anvendelse af en dosis på 150 mg / kg i stedet, timingen af billeddannelse efterluciferin administration forbliver uændret, og vi sikrer, at plateauet varer hele en erhvervelse lang eksponering. Luciferin skal være den overskydende reaktant hele købsprocessen. Afhængigt af modellen, kan området af interesse tilpasses, som vi viste i SCL model, hvor vi trak to ROI pr dyr. I SCL model, er behandlingen injiceres når tumoren når 0,5 cm i sin største diameter for at begrænse variabilitet af transplantation. Afhængigt musene, kunne tumoren er vokset forskelligt. At standardisere og sammenlign mus, besluttede vi at bruge et forhold mellem behandlede og ikke-behandlede side, der afslører den relative vækst af begge flanker tumorer.
Hvis der ikke observeres signal fra en injiceret mus forventes at være positiv, enten (i) antallet af celler er meget lav, og signalet er under detektionsgrænsen; eller (ii) musen mangler oxygen og kræver øjeblikkelig behandling.
Flere af den kvantitative bioluminescdelse analyser beskrevet af forskellige forfattere kræver komplekse beregninger og instrumenter (f.eks 3D bioluminescens tomografi) at nærme sig den absolutte kvantificering af udsendes bioluminescens fotoner 5,15. Der er ikke enighed om en metode til kvantificering bioluminescens reproducerbart, især i tumormodeller, med en 2D-bioluminescens imager. Vores mål var at standardisere købet billedet protokollen til at begrænse brugeren afhængighed.
Injektionen af CpG in situ efter podning med tumoren reduceret tumorbelastning i begge modeller. Den luminoscore metode kan tjene som et værktøj til at overvåge tumor byrde i andre modeller af tumor immunterapier. Overvågning tumorbyrde giver en noninvasiv metode, der kan forbedre vores forståelse af tumorvækst og metastasering mekanismer uden at forstyrre tumor mikromiljø. Identifikationen af dyr, der gør, og ikke reagerer på behandling med denne metode forstærkes af verifikation af successful tumorcelleinjektion ved begyndelsen af eksperimentet.
Vi her viste tilpasningsevne luminoscore metoden i en SCL model ved hjælp af A20.IIA-luc2 celler. Imidlertid kan denne fremgangsmåde tilpasses til enhver anden tumormodel anvendelse af andre cellelinjer, forudsat at de udtrykker luciferase, eller i forbindelse med T-celle-undersøgelser (tumorspecifik cytotoksiske T-celler, regulatoriske T-celler, etc.). Overvågningen af in vivo-genoverførsel i forbindelse med genterapi af sjældne sygdomme kan også gøres ved hjælp af luminoscore metode.
Endelig viser de data, som bioluminescens-baserede luminoscore metode muliggør sammenligninger mellem eksperimenter, giver fleksibilitet og tilpasningsevne til specifikke eksperimentelle behov, og er et nyttigt værktøj til invasive langsgående prækliniske undersøgelser.
Acknowledgments
Vi takker dyret faciliteterne i Cordelier Research Center (CEF, Paris, Frankrig), Généthon (Evry, Frankrig) og Genopole (CERFE, Evry, Frankrig). Vi takker Jo Ann Cahn for hendes omhyggelig læsning af manuskriptet. Denne forskning blev støttet af Institut National de la Santé et de la Rechercher Médicale, Paris Descartes University, Pierre & Marie Curie Universitet, Foreningen pour la Recherche contre le Cancer, den tunesiske Direction Générale de la Recherche Scientifique, den fransk-tunesiske CMCU projekt, og de aktioner Thématiques Incitatives de Genopole (ATIGE) midler. JC blev støttet af Frontiers in Life Science ph.d. skole og et stipendium fra INCA (Institut National du Cancer). RBA var en modtager af tilskud fra DGRS-INSERM og CMCU. SD modtaget en bevilling fra Institut National du Cancer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CpG 1826 | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGACGTTCCTGACGTT Catalog number: tlrl-1826 |
|
| ODN 1826 control | Invivogen | Sequence: 5_-TCCATGAGCTTCCTGAGCTT Catalog number: tlrl-1826c |
|
| D-luciferin potassium salt | Interchim | Catalog number: FP-M1224D | |
| Ketamin | Virbac, France | ||
| Xylazin | Bayer Healthcare | Rompun 2% | |
| A20.IIA-luc2 cell line | A20.IIA transfected with pGL4.50[luc2/CMV/hygro]7 (Promega E1310) |
||
| Mice | Balb/cByj | Six-weeks old females from Charles River | |
| IVIS lumina Biolumienscence imager | Perkin Elmer | ||
| Living Image software | Perkin Elmer | Used for measuring photon flux on images and drawing ROIs | |
| R software (opensource) | R-project | Used for statistic tests | |
| Hamilton Precision Serynge 10 µl | Hamilton | Product number 7642-01100 | |
| Eye ointment | Lacrinorm | ||
| Dissecting microscope | ZEISS | Stemi 305 |
References
- Rehemtulla, A., et al. Rapid and Quantitative Assessment of Cancer Treatment Response Using In Vivo Bioluminescence Imaging. Neoplasia. 2 (6), New York, N.Y. 491-495 (2000).
- Edinger, M., et al. Advancing animal models of neoplasia through in vivo bioluminescence imaging. European Journal of Cancer. 38 (16), Oxford, England. 2128-2136 (2002).
- Hastings, J. W., Gibson, Q. H. The Role of Oxygen in the Photoexcited Luminescence of Bacterial Luciferase. Journal of Biological Chemistry. 242 (4), 720-726 (1967).
- Inouye, S., Shimomura, O. The Use of Renilla Luciferase, Oplophorus Luciferase, and Apoaequorin as Bioluminescent Reporter Protein in the Presence of Coelenterazine Analogues as Substrate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (2), 349-353 (1997).
- Pesnel, S., et al. Quantitation in Bioluminescence Imaging by Correction of Tissue Absorption for Experimental Oncology. Molecular Imaging and Biology. 13 (4), 646-652 (2010).
- Corre, G., et al. Stochastic Fluctuations and Distributed Control of Gene Expression Impact Cellular Memory. PLoS ONE. 9 (12), (2014).
- Ben Abdelwahed, R., et al. Lymphoma B-cell responsiveness to CpG-DNA depends on the tumor microenvironment. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research CR. 32 (1), 18 (2013).
- Abdelwahed, R. B., et al. Preclinical Study of Ublituximab, a Glycoengineered Anti-Human CD20 Antibody, in Murine Models of Primary Cerebral and Intraocular B-Cell Lymphomas. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (5), 3657-3665 (2013).
- Donnou, S., Galand, C., Touitou, V., Sautès-Fridman, C., Fabry, Z., Fisson, S. Murine Models of B-Cell Lymphomas: Promising Tools for Designing Cancer Therapies. Advances in Hematology. 2012, (2012).
- Qi, X. -F., et al. CpG oligodeoxynucleotide induces apoptosis and cell cycle arrest in A20 lymphoma cells via TLR9-mediated pathways. Molecular Immunology. 54 (3-4), 327-337 (2013).
- Houot, R., Levy, R. T-cell modulation combined with intratumoral CpG cures lymphoma in a mouse model without the need for chemotherapy. Blood. 113 (15), 3546-3552 (2009).
- Krieg, A. M. Toll-like receptor 9 (TLR9) agonists in the treatment of cancer. Oncogene. 27 (2), 161-167 (2008).
- Inoue, Y., Kiryu, S., Watanabe, M., Tojo, A., Ohtomo, K. Timing of Imaging after D-Luciferin Injection Affects the Longitudinal Assessment of Tumor Growth Using In Vivo Bioluminescence Imaging. International Journal of Biomedical Imaging. 2010, (2010).
- Mann, H. B., Whitney, D. R. On a Test of Whether one of Two Random Variables is Stochastically Larger than the Other. Annals of Mathematical Statistics. 18 (1), 50-60 (1947).
- Darne, C., Lu, Y., Sevick-Muraca, E. M. Small animal fluorescence and bioluminescence tomography: a review of approaches, algorithms and technology update. Physics in Medicine and Biology. 59 (1), 1 (2014).
