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Immunology and Infection

विकास और श्वसन तरल पदार्थ में Equid herpesvirus -2 निदान के लिए एक मात्रात्मक पीसीआर विधि के मान्यकरण

Published: March 17, 2016 doi: 10.3791/53672
Automatic Translation
1,2,3, 1,3, 1, 1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1LABÉO Frank Duncombe, 2Unité de Risques Microbiens (U2RM, EA 4655), Normandy University, 3Hippolia Foundation

Introduction

Equid herpesvirus -2 (EHV-2) इस तरह के नाक मुक्ति, ग्रसनीशोथ और सूजन लिम्फ नोड्स 1-3 के रूप में संभावित नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ के साथ, एक रेस्पिरेटरी सिंड्रोम में शामिल है। यह वायरस भी घोड़ों की गरीब प्रदर्शन है, जो घोड़ा 2 उद्योग के लिए एक महत्वपूर्ण और नकारात्मक आर्थिक प्रभाव में हो सकता है के साथ जुड़े होने का संदेह है।

अब तक, गामा-EHV के लिए स्वर्ण मानक (γ-EHV) का पता लगाने सेल संस्कृति तरीका था। इस प्रक्रिया के पहले असुविधा EHV-2 और अन्य के बीच भेदभाव का अभाव था γ-EHV के (जैसे, EHV-5)। दूसरी असुविधा cytopathic प्रक्रिया है, जो 4,5 प्रकट करने के लिए 12 से 28 दिनों से लेता है की धीमी गति से विकास किया गया।

एक मान्य है और सामान्यीकृत मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन का विकास (QRT- पीसीआर) विधि तेजी से वायरस का पता लगाने के लिए, EHV -2 और EHV- के बीच भेदभाव करने में मदद मिलेगी5 और वायरल जीनोम लोड और मात्रा का ठहराव पहलू को रोग धन्यवाद बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) Mullis 6 द्वारा 1986 में पहली बार के लिए वर्णित किया गया था और के बारे में जैविक निदान (मानव, पर्यावरण और पशु चिकित्सा) के क्षेत्र के अधिकांश में नए सोने के मानक बन गया है। विशिष्टता, संवेदनशीलता और तेज़ी: इस विधि है, जो रोगाणुओं की जीनोम का एक हिस्सा के प्रवर्धन पर आधारित है, कई फायदे प्रस्तुत करता है। इसके अलावा, amplicon संक्रमण के जोखिम को QRT- पीसीआर के आगमन और गुणवत्ता आश्वासन के बाद 7 सिकुड़। फिर भी, एक नया स्वर्ण मानक पद्धति के रूप में पीसीआर की मान्यता सिर्फ बेहतर प्रदर्शन डेटा लेकिन यह भी समय के साथ प्रदर्शन की गिरावट के बिना पूरे विधि के विकास और सत्यापन के कदम के नियंत्रण के प्रदर्शन से भी अधिक जरूरी हो।

पहले आणविक का पता लगाने के लिए इस्तेमाल उपकरण EHV -2 थे समय गनेस्टेड पीसीआर के साथ onsuming और इसमें शामिल गैर विशिष्ट प्रवर्धन अनुक्रमण 8 द्वारा पीछा किया। दाद वायरस के लिए लक्षित जीन deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) पोलीमर्स और डीएनए पैकेजिंग 9 थे। हालांकि, नेस्टेड पीसीआर amplicons द्वारा संदूषण के एक उच्च जोखिम प्रस्तुत करता है। तब से, पारंपरिक पीसीआर परीक्षण इंटरल्यूकिन 10-जैसे जीन या ग्लाइकोप्रोटीन बी जीन, 2009 2 में समीक्षा बढ़ाना करने के लिए डिजाइन किया गया है। हाल ही में, वास्तविक समय पीसीआर विशेषताओं EHV-2 10 की मात्रा का ठहराव के लिए वर्णित किया गया लेकिन कोई डेटा उपलब्ध थे निकासी की प्रक्रिया सहित पूरे विधि के सत्यापन के विषय में।

इस प्रोटोकॉल में, विकास और सत्यापन प्रक्रियाओं घोड़े का श्वसन तरल पदार्थ में पता लगाने और एसोसिएशन Française de सामान्य बनाने के अनुसार EHV-2 डीएनए की मात्रा का ठहराव के लिए एक मात्रात्मक पीसीआर विधि के लिए वर्णित हैं (AFNOR) के आदर्श एनएफ U47-600 3,11,12, जिसमें फ्रेंच प्रतिनिधि हैअंतरराष्ट्रीय सामान्य बनाने समिति। यह आदर्श विवरण "आवश्यकताओं और कार्यान्वयन, विकास और पशुओं के स्वास्थ्य विश्लेषण विधि में पशु चिकित्सा पीसीआर के सत्यापन के लिए सिफारिशें" 11,12, एनएफ एन आईएसओ / CEI 17025, 2005 से 13 और OIE (पशु स्वास्थ्य के लिए विश्व संगठन) के अनुसार । (क) QRT- पीसीआर परख के विकास, (ख) QRT- पीसीआर परख के अकेले लक्षण और (ग) पूरे के लक्षण वर्णन: सिफारिशों, 2010 14 EHV-2 QRT- पीसीआर सत्यापन प्रोटोकॉल एक तीन भाग प्रक्रिया शामिल विश्लेषणात्मक विधि (पीसीआर विश्लेषण करने के लिए जैविक नमूने से न्यूक्लिक एसिड की निकासी से)।

पता लगाने (लोद) की सीमा और मात्रा का ठहराव की सीमा (LOQ): QRT- पीसीआर परख की और पूरे विश्लेषणात्मक विधि के लक्षण वर्णन के दो सीमाओं की परिभाषा में शामिल हैं। लोद 95% पीसीआर मात्रा प्रति इकाई न्यूक्लिक एसिड प्रतियां कि सभी कैस के 95% में पता लगाया जा सकता है की सबसे कम संख्या का प्रतिनिधित्व करता हैतों। LOQ 95% पीसीआर न्यूक्लिक एसिड प्रतियां कि खाते में अनिश्चितताओं लेने से निर्धारित किया जा सकता का सबसे कम मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है।

इस QRT- पीसीआर विधि सटीक पता लगाने और सांस तरल पदार्थ में EHV-2 के तेजी से मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। इसके अलावा, विधि एक मानकीकृत प्रक्रिया और अन्य नए QRT- पीसीआर assays के विकास के लिए सामान्य रूप में टेम्पलेट सुनिश्चित करने के लिए अन्य प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है।

Protocol

नोट: सभी विभिन्न चरणों कि चित्रा 1 में सचित्र हैं का संदर्भ लें।

1. न्यूक्लिक एसिड की निकासी

नोट: न्यूक्लिक एसिड के साथ एयरवे संदूषण को सीमित करने का एक धूआं हुड के तहत निष्कर्षण प्रदर्शन। DEPC इलाज पानी के साथ एक निष्कर्षण नकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं सुनिश्चित करने के लिए कि अभिकर्मकों से कोई भी अवांछित डीएनए के साथ दूषित कर रहे हैं।

  1. एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 15 और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार जैविक नमूने से न्यूक्लिक एसिड निकालें।
    1. सेल समाधान (एवीएल बफर) के 560 μl को जैविक नमूने के 140 μl जोड़ें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। इथेनॉल के 560 μl जोड़ें। एक सिलिका स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए इस समाधान (नमूना + सेल समाधान + इथेनॉल) के पहले 630 μl लागू करें।
    2. एक ही सिलिका स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए इस समाधान के शेष 630 μl लागू करें। फिर 500 μl के साथ स्तंभ धोने2 अलग धोने बफ़र्स (AW1 और AW2) के।
  2. क्षालन बफर (AVE बफर) के 50 μl के साथ न्यूक्लिक एसिड Elute और कमरे के तापमान को संतुलित करना। टोपी बंद और 1 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं। 1 मिनट के लिए 6,000 ग्राम पर अपकेंद्रित्र।

2. प्रवर्धन प्रक्रिया

  1. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के 22.5 μl तैयार करें। पीसीआर मास्टर मिश्रण, x 20 माइक्रोन के आगे प्राइमर के μl, 20 माइक्रोन के रिवर्स प्राइमर, के रूप में 22.5 μl तक पहुंचने की आवश्यकता ultrapure पानी μl 10 माइक्रोन जांच और जेड के y μl के एक्स μl के 12.5 μl जोड़ें (एक्स, वाई और जेड मात्रा में प्राप्त कर रहे हैं अनुमापन के बाद, धारा 3.2.3 और 3.2.6) देखें।
  2. अशेष अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए उचित प्रतिक्रिया मिश्रण के 22.5 μl।
    नोट: निकासी के लिए नकारात्मक नियंत्रण शामिल करें और पीसीआर के लिए सुनिश्चित करने के लिए अभिकर्मकों की है कि कोई अवांछित डीएनए के साथ दूषित कर रहे हैं।
  3. नमूने के 2.5 μl, निकासी negativ के 2.5 μl जोड़ेई नियंत्रण, पीसीआर नकारात्मक नियंत्रण के 2.5 μl और सकारात्मक नमूना (संदर्भ तनाव या प्लाज्मिड) अच्छी तरह से इसी प्रतिक्रिया के 2.5 μl। वितरण के बाद, एक चिपकने वाला प्लेट मुहर के साथ थाली को कवर किया। 6000 ग्राम से कम 10 सेकंड के लिए थाली अपकेंद्रित्र।
  4. एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली में थाली रखें। परख लेआउट के लिए टेम्पलेट का चयन करें और रन शुरू करते हैं। 95 डिग्री सेल्सियस पर 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट 15 सेकंड के 45 चक्रों के बाद और 60 डिग्री सेल्सियस (1 टेबल) पर 1 मिनट: पीसीआर कार्यक्रम सेटिंग का उपयोग करें।
  5. एक स्प्रेडशीट के लिए वास्तविक समय पीसीआर सिस्टम से कच्चे डेटा स्थानांतरण। आधारभूत ऊपर प्रवर्धन भूखंडों में सीमा निर्धारित करें और तेजी से विकास क्षेत्र के भीतर प्रत्येक नमूना के लिए सीमा चक्र प्राप्त करने के लिए। प्रत्येक बिंदु मानक एक मानक वक्र linearity प्राप्त करने के लिए के रूप में सेट प्लॉट। मानक वक्र के आधार पर अलग-अलग नमूने के लिए प्रतिलिपि संख्या की गणना।

3. मात्रात्मक आरटी पीसीआर का विकास

ध्यान दें: एक QRT- पीसीआर परीक्षण के विकास के संदर्भ में तनाव, एक विशिष्ट titrated प्लाज्मिड, और विभिन्न नियंत्रण की आवश्यकता और प्राइमरों और जांच की जरूरत पर जोर देता अनुमापन।

  1. प्रारंभिक परीक्षण
    1. डिजाइन प्राइमरों और पिछले सिफारिशों के अनुसार 16 विशेष सॉफ्टवेयर के साथ जांच।
    2. धारा 1 में वर्णित के रूप में संदर्भ उपभेदों निकालें।
    3. प्राइमरों के अंतिम एकाग्रता के लिए 900 एनएम और जांच के अंतिम एकाग्रता के लिए 250 एनएम के साथ धारा 2 में वर्णित के रूप बढ़ाना। संकेत का विश्लेषण अनुभाग 2.5 में वर्णित है।
    4. इसी समय, संदर्भ उपभेदों डीएनए के प्रवर्धन प्रदर्शन जांच के बिना (धारा 3.1.3 में वर्णित के रूप में)। Amplicons सेंगर विधि 17,18 द्वारा प्राप्त अनुक्रम। एक न्यूक्लियोटाइड बम विस्फोट 19 चलाने के द्वारा दृश्यों का विश्लेषण।
  2. प्राइमर और जांच के अनुमापन
    1. जांच के 250 एनएम अंतिम एकाग्रता के साथ और विभिन्न अंतिम concentr के साथ 3 अलग घोला जा सकता है तैयारआगे की ations और रिवर्स प्राइमरों (50 एनएम / 50 एनएम, 300 एनएम / 300 एनएम, 900 एनएम / 900 एनएम) सकारात्मक नमूना और एक नकारात्मक नियंत्रण के 3 प्रतिकृति के लिए। प्रत्येक मिश्रण के लिए, 20 माइक्रोन के आगे प्राइमर का एक ही उचित मात्रा और 20 माइक्रोन के रिवर्स प्राइमर (0.25 μl 50 एनएम अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 1.5 μl 300 एनएम अंतिम एकाग्रता या 4.5 μl प्राप्त करने के लिए 900 एनएम अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए) को जोड़ने पीसीआर मास्टर मिश्रण के 50 μl, आवश्यक के रूप में 10 माइक्रोन के जांच और ultrapure पानी की 2.5 μl 90 μl तक पहुंचने के लिए।
    2. धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन प्रक्रिया करते हैं।
    3. प्रवर्धन के उच्चतम स्तर को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छी हालत चुनें, जल्द से जल्द चक्र सीमा (सीटी) और 3 की स्थिति के बीच सबसे अच्छा repeatability। अच्छी एकाग्रता और इसी मात्रा एक्स आगे की μl निर्धारण और प्राइमरों रिवर्स।
    4. (और सकारात्मक नमूना के 3 प्रतिकृति एक नकारात्मक नियंत्रण) 4 नमूने के लिए 5 अलग अलग घोला जा सकता है तैयारजांच के 5 विभिन्न अंतिम सांद्रता (50 एनएम, 100 एनएम, 150 एनएम, 200 एनएम, 250 एनएम) के साथ। प्रत्येक मिश्रण के लिए, एक्स 20 माइक्रोन के आगे प्राइमर और एक्स μl के 20 माइक्रोन के रिवर्स प्राइमर के μl, 0.5 μl प्राप्त करने के लिए जोड़ (पहले से निर्धारित की धारा 3.2.3 में) पीसीआर मास्टर मिश्रण के 50 μl, 10 माइक्रोन के जांच की उचित मात्रा ( 50 एनएम एकाग्रता, 1 μl 100 एनएम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 1.5 μl 150 एनएम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए, 2 μl 200 एनएम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए या 2.5 μl 250 एनएम एकाग्रता) और ultrapure पानी प्राप्त करने के लिए के रूप में 90 μl तक पहुंचने के लिए जरूरी है।
    5. धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन प्रक्रिया करते हैं।
    6. प्रवर्धन के उच्चतम स्तर को प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छी हालत चुनें, जल्द से जल्द चक्र सीमा (सीटी) और 5 की स्थिति के बीच सबसे अच्छा repeatability। अच्छी एकाग्रता और जांच के लिए इसी मात्रा Y μl निर्धारित करते हैं।

4. मात्रात्मक वजह की विशेषताएल समय पीसीआर (QRT- पीसीआर)

नोट: के बाद विकास के कदम है और सबसे अच्छी स्थिति के निर्धारण का उपयोग करने के लिए, पीसीआर के लक्षण वर्णन कदम विशिष्टता, पता लगाने की सीमा, linearity रेंज और QRT- पीसीआर की मात्रा का ठहराव की सीमा भी शामिल है।

  1. तैयारी और प्लाज्मिड के अनुमापन
    1. डीएनए लक्ष्य जीन पीसीआर के लिए चुने गए प्रासंगिक टुकड़ा युक्त वाणिज्यिक प्लाज्मिड आदेश (इस प्रोटोकॉल में, न्यूक्लियोटाइड EHV-2 ग्लाइकोप्रोटीन बी जीन की 2081-2381, 1 टेबल देखें)।
      नोट: सिंथेटिक डीएनए के साथ एयरवे संक्रमण के जोखिम को सीमित करने के लिए, विकास और सत्यापन प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान एक अलग कमरे में एक धूआं हुड के तहत plasmids के धारावाहिक dilutions प्रदर्शन और पतला डीएनए के साथ काम करते हैं।
    2. पुनः निलंबित ultrapure पानी के साथ प्लाज्मिड 50 एनजी / एमएल पर एक शेयर समाधान तैयार करने के लिए। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षेप प्लाज्मिड शेयर समाधान।
      नोट: प्लाज्मिड एसटू के वास्तविक एकाग्रता का निर्धारणआदेश प्लाज्मिड की प्रतिलिपि संख्या की गणना करने के लिए फिर से निलंबन के बाद सी.के. समाधान।
    3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को प्लाज्मिड की 1 μl जोड़ें। 230 एनएम, 260 एनएम और 280 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) पढ़ें। स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सॉफ्टवेयर (आयुध डिपो, 260 एनएम) पर डीएनए एकाग्रता बंद पढ़ें।
    4. प्लाज्मिड Avogadro की संख्या (एन ए) और सूत्र का उपयोग कर की प्रतिलिपि संख्या की गणना:
      नकल संख्या / μl = (एन ए [एनजी में प्लाज्मिड / μl]) / (प्लाज्मिड लंबाई x 10 9 एक्स एक आधार जोड़ी का औसत वजन) = (6022 x 10 23 x [प्लाज्मिड]) / (प्लाज्मिड लंबाई x 10 9 एक्स 660)
  2. QRT- पीसीआर की विशिष्टता (inclusivity और विशिष्टता) परीक्षण
    1. पीसीआर प्रणाली के inclusivity का परीक्षण करें। EHV-2 चुनें सकारात्मक डीएनए नमूने, पहले अनुक्रमण की विशेषता (सकारात्मक स्थिति की स्थापना)।
    2. धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन प्रक्रिया करते हैं।
    3. विश्लेषणप्रत्येक नमूना के लिए पीसीआर डेटा के रूप में खंड 2.5 में वर्णित है। धारा 4.2.1 में चुना सभी नमूनों के लिए एक घातीय वक्र की उपस्थिति की जांच और पीसीआर की inclusivity की पुष्टि करें।
    4. (पीसीआर प्रणाली लक्षित करने के लिए आनुवंशिक समानता के साथ रोगजनकों से डीएनए के अर्क का उपयोग करने की विशिष्टता इस मामले में परीक्षण, ऐसे EHV-1, EHV-4, EHV-3, EHV -5 और गदहे herpesvirus -5 के रूप में अन्य equid herpesviruses वर्णित के रूप में तालिका 2) और अन्य रोगाणुओं (इस मामले में मेजबान की सांस की बीमारियों में शामिल में, घोड़े आर्टेराईटिस वायरस, घोड़े इन्फ्लूएंजा वायरस, Coxiella burnetii, Rhodococcus सम, स्ट्रेप्टोकोकस सम सम, स्ट्रेप्टोकोकस सम zooepidemicus, Chlamydophila abortus और क्लेबसिएला निमोनिया, 2 टेबल देखें)।
    5. धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन प्रक्रिया करते हैं।
    6. धारा 2.5 में वर्णित के रूप में प्रत्येक नमूना के लिए पीसीआर डेटा का विश्लेषण। एक घातीय वक्र के अभाव के लिए जाँच सभी नमूनों के लिए में चुनाखंड 4.2.4 पीसीआर की विशिष्टता की पुष्टि करें।
  3. QRT- पीसीआर का पता लगाने की सीमा
    1. 6 ट्यूबों में ultrapure पानी के 90 μl बांटना।
    2. कमी जोन (सीटी का पता लगाने के नुकसान) को लक्षित करने के लिए 6 प्लाज्मिड के दस गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। स्थानांतरण ultrapure पानी के 90 μl के साथ ट्यूब को कमजोर पड़ने से काम कर रहा प्लाज्मिड से 10 μl। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षिप्त ट्यूब। धारावाहिक कमजोर पड़ने में पिछले ट्यूब जब तक दोहराएँ कदम 4.3.2 प्लाज्मिड प्राप्त हुआ है।
    3. धारा 2 में वर्णित के रूप में प्लाज्मिड के 6 दस गुना धारावाहिक dilutions के प्रवर्धन प्रदर्शन करना।
    4. कमी क्षेत्र का निर्धारण: एक सकारात्मक संकेत है और पता लगाने के बिना पहली कमजोर पड़ने पेश प्लाज्मिड के अंतिम कमजोर पड़ने के बीच क्षेत्र (चित्रा 2 देखें)।
    5. 6 दो गुना धारावाहिक dilutions शुरू करने के लिए है, जो एक सकारात्मक संकेत (धारा 4.3.4 देखें) देता है प्लाज्मिड के अंतिम कमजोर पड़ने चुनें।
      नोट: 3 स्वतंत्र त्रिकोणीय प्रदर्शन करनाए एल एस QRT- पीसीआर (लोद 95% पीसीआर) का पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए
    6. 6 ट्यूबों में ultrapure पानी की 25 μl बांटना।
    7. 6 प्लाज्मिड की दो गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। स्थानांतरण ultrapure पानी की 25 μl के साथ ट्यूब के लिए, धारा 4.3.5 में निर्धारित के रूप में काम कर रहा प्लाज्मिड कमजोर पड़ने से 25 μl। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षिप्त ट्यूब। धारावाहिक कमजोर पड़ने में पिछले ट्यूब जब तक दोहराएँ कदम 4.3.7 प्लाज्मिड प्राप्त हुआ है।
    8. अनुभाग में वर्णित के रूप में प्लाज्मिड के 6 दो गुना धारावाहिक dilutions के प्रवर्धन प्रदर्शन करना 2. दोहराएँ कदम 4.3.7 दो बार 4.3.8 करने के लिए, 6 दस गुना से प्रत्येक के 8 प्रतिकृति (24 प्रतिकृति) के साथ 3 परीक्षण प्राप्त करने के लिए प्लाज्मिड के धारावाहिक dilutions।
      नोट: QRT- पीसीआर का पता लगाने (लोद 95% पीसीआर) की सीमा मात्रा इकाई द्वारा सबसे कम डीएनए प्रतियां संख्या है कि मामलों के 95% में पाया जाता है के रूप में परिभाषित किया गया है।
    9. प्लाज्मिड concentra के प्रत्येक स्तर के लिए 24 प्रतिकृति से बाहर सकारात्मक प्रतिकृति की संख्या की गणनाtion।
    10. लोद 95% पीसीआर निर्धारित करते हैं। लोद 95% पीसीआर स्तर जो 24 प्रतिकृति में से 23 में सकारात्मक प्रतिकृति का पता लगाने में यह परिणाम है।
  4. Linearity रेंज और QRT- पीसीआर की मात्रा की सीमा
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि श्रृंखला में प्रयोग किया सबसे कम एकाग्रता लोद 95% पीसीआर 4.3.10 में पहले से निर्धारित से मेल खाती है 6 प्लाज्मिड के दस गुना धारावाहिक dilutions के साथ 4 स्वतंत्र परीक्षणों को पूरा करें।
    1. 6 ट्यूबों में ultrapure पानी के 45 μl बांटना।
    2. प्लाज्मिड काम कर कमजोर पड़ने की एकाग्रता 10 7 लोद 95% पीसीआर को इसी के साथ 6 दस गुना धारावाहिक dilutions शुरू करो।
    3. 6 प्लाज्मिड के दस गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। स्थानांतरण प्लाज्मिड काम कर कमजोर पड़ने (धारा 4.4.2 में निर्धारित) ultrapure पानी के 45 μl के साथ ट्यूब से 5 μl। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षिप्त ट्यूब। धारावाहिक कमजोर पड़ने में पिछले ट्यूब जब तक दोहराएँ कदम 4.4.3 पी प्राप्त हुआ हैlasmid।
    4. धारा 2 में वर्णित के रूप में प्लाज्मिड के 6 दस गुना धारावाहिक dilutions बढ़ाना।
    5. ढलान और अवरोधन (चित्रा 3) के लिए बी के लिए एक साथ रेखीय प्रतिगमन y = कुल्हाड़ी + बी ट्रेस।
    6. मानक वक्र के ढलान एक से प्रवर्धन दक्षता (ई) की गणना (4.4.5 देखें) समीकरण का उपयोग:
      4.4.6 ।
      दोहराएँ 4.4.1 4.4.6 तीन बार करने के लिए कदम।
      नोट: प्रवर्धन दक्षता प्रत्येक चक्र के बाद पीसीआर उत्पाद वृद्धि की राशि का प्रतिनिधित्व करता है। एक आदर्श प्रतिक्रिया 100% के करीब दक्षता तक पहुँचता है। अभ्यास में, ई (%) 75% और 125% के बीच था। उच्चतर ई गैर विशिष्ट उत्पादों या धारावाहिक कमजोर पड़ने में एक pipetting त्रुटि के प्रवर्धन संकेत कर सकते हैं। लोअर ई भी धारावाहिक कमजोर पड़ने, गरीब प्राइमर डिजाइन या गैर इष्टतम स्थितियों की प्रतिक्रिया में एक pipetting त्रुटि इंगित कर सकते हैं।
    7. पूर्वाग्रह की गणना (तालिका3)। प्रत्येक प्लाज्मिड स्तर है कि पूर्ण पूर्वाग्रह मान गंभीर पूर्वाग्रह मूल्य (0.25 लॉग 10) की तुलना में कम है के लिए जाँच करें। मतलब पूर्वाग्रह और प्रत्येक प्लाज्मिड स्तर (3 टेबल) के लिए EHV-2 qPCR रेखीय प्रतिगमन के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए (चित्रा 4) के लिए linearity अनिश्चितताओं (यू Lini) निर्धारित करते हैं। यू Lini linearity प्रत्येक के लिए चुना गया अनिश्चितता मैं स्तर प्लाज्मिड गणना की है मानक विचलन (SD'i) और पूर्वाग्रह से मतलब है। निर्धारित बनाने के लिए संयुक्त linearity अनिश्चितता (यू लिन) EHV-2 qPCR के सूत्र द्वारा दिए गए:
      4.4.7
      नोट: पूर्वाग्रह की स्वीकृति प्रयोगशाला द्वारा निर्दिष्ट किया जाता है (सामान्य पूर्ण पूर्वाग्रह 0.25 लॉग 10 में) और सबसे कम मूल्य और 0.5 लॉग 10 के उच्चतम मूल्य (मात्रा लॉग 10 नकल संख्या में मापा जाता है) के बीच के अंतर के अनुरूप हैं। यू लिन
    8. QRT- पीसीआर (LOQ पीसीआर) की मात्रा का ठहराव की सीमा का निर्धारण करते हैं: LOQ पीसीआर एक पूर्वाग्रह 0.25 लॉग 10 linearity रेंज (3 टेबल) के लिए इस्तेमाल के साथ सबसे कम एकाग्रता है।

5. पूरे विश्लेषणात्मक पद्धति की विशेषता (डीएनए निष्कर्षण से QRT- पीसीआर परिणाम के लिए)

नोट: पूरे विधि के लक्षण वर्णन श्वसन नमूना से डीएनए की निकासी से, QRT- पीसीआर डेटा (यानी प्राप्त करने के लिए आवश्यक सभी कदम की मान्यता है (प्रवर्धन और लक्ष्य की मात्रा का ठहराव के लिए खंड 1) देखना (धारा 2 देखें ))।

  1. जमाओ पीसीआर प्रतिक्रिया में प्रतियों की संख्या और फार्मूले के साथ जैविक नमूने में प्रतियां संख्या वर्तमान के बीच पत्राचार:
    5.1-1 ।
    5.1-2 पीसीआर को जोड़ा गया नमूने की मात्रा प्रवर्धन के लिए मिश्रण है, 5.1-4 बफर AVE की मात्रा न्यूक्लिक एसिड elute करने के लिए प्रयोग किया जाता है और 5.1-5 निकाले गए नमूने की मात्रा है।
  2. संवेदनशीलता और पूरे विश्लेषणात्मक विधि की विशिष्टता का परीक्षण करें
    नोट: केवल नाम से जाना जाता EHV-2 सकारात्मक (या नकारात्मक) नमूने इस खंड में उपयोग किया जाता है।
    1. लक्ष्य (EHV-2) के लिए सकारात्मक नमूनों का विश्लेषण करके टेस्ट QRT- पीसीआर विधि के "संवेदनशीलता"।
      1. EHV-2 चुनें सकारात्मक डीएनए नमूने, पहले की विशेषता (सकारात्मक स्थिति)।
      2. खंड 1 में वर्णित के रूप में धारा 2 में वर्णित के रूप में एक प्रवर्धन कार्यविधि को पूरा न्यूक्लिक एसिड निकालें।
      3. वास्तविक सकारात्मक की संख्या (सकारात्मक नमूने निर्धारित बनाने के लिएइस आरटी पीसीआर) और झूठी नकारात्मक की संख्या (ज्ञात सकारात्मक नमूने जो इस आरटी पीसीआर के साथ नकारात्मक कर रहे हैं) के साथ सकारात्मक रहे हैं।
    2. नकारात्मक नमूनों का विश्लेषण करके टेस्ट QRT- पीसीआर विधि के 'विशिष्टता'
      1. EHV-2 चुनें नकारात्मक डीएनए नमूने (नकारात्मक स्थिति)।
      2. खंड 1 में वर्णित के रूप में धारा 2 में वर्णित के रूप में एक प्रवर्धन कार्यविधि को पूरा न्यूक्लिक एसिड निकालें।
      3. वास्तविक नकारात्मक (नकारात्मक नमूने जो इस आरटी पीसीआर के साथ नकारात्मक हो जाना जाता है) और झूठी सकारात्मक (ज्ञात नकारात्मक नमूने जो इस आरटी पीसीआर के साथ सकारात्मक हैं) की संख्या की संख्या निर्धारित करते हैं।
    3. इस प्रकार के रूप में "नैदानिक ​​संवेदनशीलता" (एसई) और "नैदानिक ​​विशिष्टता" पूरे विधि की (सपा) (तालिका 4) की गणना: Se = वास्तविक सकारात्मक की संख्या / और सपा = वास्तविक की संख्या (वास्तविक सकारात्मक + झूठी नकारात्मक की संख्या) नकारात्मक / (असली नकारात्मक की संख्याएस + झूठी सकारात्मक) (4 तालिका देखें)।
    4. गणना संवेदनशीलता और Greiner और गार्डनर संबंध 12,20 के फार्मूले के साथ पूरे विधि की विशिष्टता के लिए 95% विश्वास अंतराल:
      5.2.4
      जहां ई अनुमानित त्रुटि है, θ Se (या सपा) और एन विश्लेषण किया नमूनों की संख्या है।
      नोट: नमूने की एक छोटी संख्या के लिए, संवेदनशीलता और पूरे विधि की विशिष्टता के लिए 95% विश्वास अंतराल गणना करने के लिए आदर्श AFNOR 12 के अनुसार श्वार्ट्ज तालिका का उपयोग करें।
  3. पूरे विश्लेषणात्मक पद्धति की विशेषता के लिए नकारात्मक संसाधन सामग्री तैयार
    चेतावनी:, पता लगाने के लिए और पूरे विधि (लोद विधि और LOQ विधि) की मात्रा का ठहराव की सीमा निर्धारित करने के लिए जैविक नमूने मुक्त होने के लिए जाना जाता है के लिए प्लाज्मिड के ज्ञात सांद्रता जोड़नेलक्ष्य (EHV-2 इस मामले में) के। इन नमूनों, मात्रा निर्धारित प्लाज्मिड के साथ-साथ सकारात्मक मानकों के साथ जो निर्धारित करने के लिए लोद विधि और LOQ विधि का गठन।
    1. सकारात्मक मानकों का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल जैविक नमूने में लक्ष्य का अभाव (EHV -2) की पुष्टि करें।
      1. विभिन्न ज्ञात नकारात्मक जैविक नमूने का चयन करें।
      2. खंड 1 में वर्णित के रूप में धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन कार्यविधि को पूरा जैविक नमूने निकालें।
      3. इन नमूनों में पीसीआर संकेत के अभाव से लक्ष्य के अभाव की पुष्टि करें।
        नोट: 5.4 और 5.5 के बीच सभी चरणों के लिए एक ही नकारात्मक संसाधन सामग्री का प्रयोग करें।
    2. नकारात्मक संसाधन सामग्री (एक मात्रा पूरा सत्यापन के लिए आवश्यक) के 15 मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए अलग-अलग नकारात्मक नमूने पूल। 100 ट्यूबों में इस नकारात्मक संसाधन सामग्री के 135 μl बांटना। या 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों रखें लंबे समय तक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।
  4. Limiपूरे विश्लेषणात्मक विधि का पता लगाने के लिए टी
    1. पूरे विधि की कमी क्षेत्र का निर्धारण।
      1. 6 ट्यूबों में ultrapure पानी के 45 μl बांटना।
      2. 6 प्लाज्मिड के दस गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। स्थानांतरण प्लाज्मिड काम कर कमजोर पड़ने ultrapure पानी के 45 μl के साथ 10 7 लोद 95% पीसीआर के लिए इसी (धारा 4.3.10 में निर्धारित) ट्यूब से 5 μl। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षिप्त ट्यूब। धारावाहिक कमजोर पड़ने में पिछले ट्यूब जब तक दोहराएँ कदम 5.4.1.2 प्लाज्मिड प्राप्त हुआ है।
      3. स्थानांतरण नकारात्मक संसाधन सामग्री के 135 μl के साथ 2 ट्यूबों के लिए प्लाज्मिड के प्रत्येक कमजोर पड़ने से 5 μl 2 को प्राप्त करने के लिए 6 सकारात्मक मानकों के लिए दोहराता है। भंवर और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज।
      4. खंड 1 में वर्णित के रूप में धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन कार्यविधि को पूरा 6 सकारात्मक मानकों के लिए 2 प्रतिकृति की निकासी के प्रदर्शन करना।
      5. कमी क्षेत्र का निर्धारण: पिछले सान्द्र के बीच क्षेत्रएक सकारात्मक संकेत है और पहली एकाग्रता है कि कोई संकेत से पता चलता देने प्लाज्मिड के entration।
    2. विधि की जांच (लोद विधि) की सीमा 2 स्वतंत्र परीक्षणों द्वारा निर्धारित
      नोट: पूरे विधि (लोद विधि) का पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए 2 स्वतंत्र परीक्षणों को पूरा करें।
      1. प्लाज्मिड काम कर रहा है कि कमजोर पड़ने 4 गुना अधिक ध्यान केंद्रित किया है कि प्लाज्मिड कि एक सकारात्मक संकेत दिया के अंतिम एकाग्रता (खंड 5.4.1.5 देखें) के साथ 6 दो गुना धारावाहिक dilutions शुरू करो।
      2. 6 ट्यूबों में ultrapure पानी की 25 μl बांटना।
      3. 5 प्लाज्मिड की दो गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। स्थानांतरण ultrapure पानी की 25 μl के साथ ट्यूब के लिए काम कर रहा प्लाज्मिड कमजोर पड़ने से 25 μl (खंड 5.4.2.1 में निर्धारित रूप में)। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षिप्त ट्यूब। धारावाहिक कमजोर पड़ने में पिछले ट्यूब जब तक दोहराएँ कदम 5.4.2.3 प्लाज्मिड प्राप्त हुआ है।
      4. स्थानांतरण plasmi में से प्रत्येक के कमजोर पड़ने से 5 μlनकारात्मक संसाधन सामग्री के 135 μl के साथ 4 ट्यूबों के लिए डी 5 सकारात्मक मानकों के 4 प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए। भंवर और संक्षेप ट्यूबों अपकेंद्रित्र।
      5. खंड 1 में वर्णित के रूप में धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन कार्यविधि को पूरा 5 सकारात्मक मानकों के लिए 4 प्रतिकृति की निकासी के प्रदर्शन करना।
      6. दोहराएँ कदम 5.4.2.1 प्लाज्मिड एकाग्रता के प्रत्येक स्तर के लिए 8 प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए एक बार 5.4.2.5 करने के लिए।
      7. प्लाज्मिड एकाग्रता के प्रत्येक स्तर के लिए 8 प्रतिकृति से बाहर सकारात्मक प्रतिकृति की संख्या की गणना।
      8. निर्धारित बनाने के लिए लोद विधि। लोद विधि पिछले किस स्तर पर 8 (खंड 5.4.2.7 में वर्णित) बाहर के 8 प्रतिकृति सकारात्मक रहे हैं प्रतिकृति है।
  5. Linearity रेंज और पूरे विश्लेषणात्मक विधि की मात्रा की सीमा
    नोट: पूरे विधि (LOQ विधि) की मात्रा का ठहराव की सीमा निर्धारित करने के लिए, जैविक को प्लाज्मिड के ज्ञात सांद्रता जोड़नेनमूने है कि जाना जाता है लक्ष्य (EHV-2 इस मामले में) से मुक्त हो। इन नमूनों सकारात्मक मानकों का निर्धारण करने के LOQ विधि का गठन।
    1. 6 ट्यूबों में ultrapure पानी के 45 μl बांटना।
    2. 6 प्लाज्मिड के दस गुना धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। स्थानांतरण प्लाज्मिड काम कर कमजोर पड़ने 10 7 लोद विधि करने के लिए इसी ultrapure पानी के 45 μl के साथ ट्यूब के लिए (धारा 5.4.2.8 में निर्धारित रूप में) से 5 μl। भंवर और सेंट्रीफ्यूज संक्षिप्त ट्यूब। धारावाहिक कमजोर पड़ने में पिछले ट्यूब जब तक दोहराएँ कदम 5.5.2 प्लाज्मिड प्राप्त हुआ है।
    3. नकारात्मक जैविक संसाधन सामग्री के 135 μl के साथ 2 ट्यूबों के लिए प्लाज्मिड के प्रत्येक कमजोर पड़ने से स्थानांतरण 5 μl 6 सकारात्मक मानकों के 2 प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए। भंवर और संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज।
    4. अनुभाग में वर्णित के रूप में खंड 1 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन कार्यविधि को पूरा 6 सकारात्मक मानकों के लिए 2 प्रतिकृति की निष्कर्षण प्रदर्शन 2. दोहराएँ कदम 5.5.15.5.4 तीन बार करने के लिए।
    5. मूल्यांकन और विधि के मात्रात्मक प्रदर्शन को मान्य करने के क्रम में एक सटीकता प्रोफाइल को परिभाषित करें।
      1. प्रयोगशाला के लिए पूरे विधि की स्वीकार्यता सीमा को परिभाषित करें। इस प्रोटोकॉल में, स्वीकार्यता सीमा लेबियो द्वारा ± 0.75 के रूप में परिभाषित कर रहे हैं लॉग 10 फ्रैंक DUNCOMBE।
      2. एक परीक्षण के लिए, का पता लगाने के लिए पहली बार एक रेखीय प्रतिगमन y = कुल्हाड़ी + बी (एक ढलान है और ख अवरोधन है) सीटी मूल्यों में से एक को दोहराने के मानक की अवस्था में से प्रत्येक के अनुमानित मूल्य के लिए इसी के साथ। यह पहली रेखीय प्रतिगमन के साथ, यह पहली मानक वक्र के लिए इस्तेमाल सीटी मूल्यों की प्रतिकृति के लिए प्रतिलिपि संख्या की प्रयोगात्मक मूल्य की गणना। करने के लिए सीटी मूल्यों के दूसरे प्रतिकृति के साथ दोहराएँ कदम 5.5.5.2 एक दूसरे रेखीय प्रतिगमन प्राप्त की और सीटी मूल्यों के दूसरे प्रतिकृति दूसरी मानक वक्र के लिए इस्तेमाल के लिए नकल संख्या की प्रयोगात्मक मूल्य की गणना।
      3. एनएफ U47-600-2 12 के अनुसार प्रत्येक प्लाज्मिड स्तर के लिए सटीक, सच्चाई और सटीकता सीमा की गणना।
      4. एक स्प्रेडशीट बनाएं सभी मानक अंक (5.5.5.4) के लिए जानकारी संकलन और 5.5.5.1 में पहले से परिभाषित स्वीकार्यता की सीमा के साथ एक सटीकता प्रोफ़ाइल और साथ-साथ डेटा की सच्चाई बनाने के लिए निचले और ऊपरी सीमा सटीकता 5.5 में गणना के रूप में .5.4 (चित्रा 5)।
    6. निर्धारित बनाने के लिए LOQ विधि: के रूप में linearity रेंज 5.5.5.5 में गणना के लिए इस्तेमाल किया इस सच्चाई 0.75 लॉग 10 के साथ एक मानक वक्र की सबसे कम एकाग्रता से मेल खाती है।
  6. Repeatability और reproducibility का मूल्यांकन
    ध्यान दें: मानक विचलन के बीच का अनुपात और दोहराने माप (विभिन्नता का गुणांक, या CV = मानक विचलन का मतलब का उपयोग करके repeatability और reproducibility जाँचें /मतलब है)।
    1. 1 विश्लेषक द्वारा पूरे विधि के repeatability का मूल्यांकन:
      1. 3 अलग वायरल जीनोम भार (उदाहरण के लिए पहले से पीसीआर में परीक्षण) के साथ 3 जैविक नमूने का चयन करें।
      2. खंड 1 में वर्णित के रूप में धारा 2 में वर्णित के रूप में प्रवर्धन कार्यविधि को पूरा 3 नमूने के 8 प्रतिकृति निकालें।
      3. मतलब है और प्रत्येक नमूना के लिए एकत्र सीटी मूल्य के मानक विचलन की गणना।
      4. सूत्र सीवी = मानक विचलन का उपयोग कर इंट्रा-परख सीवी गणना / मतलब है।
    2. 3 विश्लेषकों द्वारा पूरे विधि के reproducibility का मूल्यांकन:
      1. 3 अलग वायरल जीनोम भार (उदाहरण के लिए पहले से पीसीआर में परीक्षण) के साथ 3 जैविक नमूने चुनें
      2. (खंड 1 में वर्णित) 5.6.2.1 में चुना 3 नमूने के 2 प्रतिकृति निकालें। 2 स्वतंत्र विश्लेषकों द्वारा खंड 2. दोहराएँ वर्णित के रूप में 5.6.2.2 कदम प्रवर्धन प्रक्रिया करते हैं।
      3. मतलब है और मानक विचलन की गणनाप्रत्येक नमूना के लिए एकत्र सीटी मूल्य की।
      4. सूत्र सीवी = मानक विचलन का उपयोग कर अंतर-परख सीवी गणना / मतलब है।

Representative Results

मात्रात्मक आरटी पीसीआर विधि, जैसा कि ऊपर वर्णित है, का पता लगाने और श्वसन तरल पदार्थ में equid herpesvirus -2 यों को लागू किया गया था। चित्रा 1 AFNOR आदर्श एनएफ के अनुसार विकास और एक मात्रात्मक आरटी पीसीआर विधि के सत्यापन के लिए एक योजनाबद्ध कार्यप्रवाह चार्ट दिखाता है U47-600। प्राइमरों और जांच की विशिष्टता पीसीआर की कदम-दर-कदम विकास के दौरान मान्य किया गया। केवल EHV-2 उपभेदों इस प्रणाली में परिलक्षित किया गया। बाद में, QRT- पीसीआर के प्रदर्शन की विशेषता जा सकता था।

सबसे पहले, लोद पीसीआर, अनुमान लगाने के लिए एक 6 दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने कमी जोन (चित्रा 2) स्थापित करने के लिए किया गया था। इस उदाहरण में, 6 दस गुना धारावाहिक dilutions लोद पीसीआर अनुमान लगाने के लिए (26,000 और 0.26 प्रतियां / 2.5 μl नमूना के बीच) 10 -5 और 10 -10 के बीच किए गए थे। कमी जोन एल(2.6 और 0.26 प्रतियां / 2.5 μl नमूना के बीच) 10 -9 और 10 -10 के dilutions के बीच एँ। इस मामले में लोद पीसीआर मूल्य का निर्धारण करने के लिए, 6 प्लाज्मिड की दो गुना धारावाहिक dilutions इस कमी के क्षेत्र में 5.2 और 0.16 प्रतियां / 2.5 μl नमूना के बीच किए गए थे। लोद पीसीआर मूल्य 2.6 प्रतियां / 2.5 μl नमूना था।

Linearity रेंज और LOQ पीसीआर का निर्धारण करने के लिए, लोद पीसीआर मूल्य 2.6 (लोद पीसीआर) और 260,000 प्रतियां / 2.5 μl नमूना के बीच, 6 दस गुना धारावाहिक dilutions की रेंज शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 3 EHV2 के लिए एक रेखीय प्रतिगमन दिखाता है एक परीक्षण से QRT- पीसीआर। रेखीय प्रतिगमन (चित्रा 4) के प्रदर्शन गणना तालिका 3 में वर्णित का उपयोग कर चार प्रतियों में मान्य हैं। गणना मापदंड के अनुसार linearity सीमा को परिभाषित करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं निरपेक्ष पूर्वाग्रह मैं वैलUE 10 प्रवेश करते है, जो कुछ भी प्लाज्मिड भार के स्तर मैं ≤0.25। इस मामले में, linearity 2.6 और 260,000 के बीच प्रतियां / 2.5 μl नमूना रखना सीमा होती है। LOQ पीसीआर linearity रेंज में सबसे कम एकाग्रता है (यानी, 2.6 प्रतियां / इस मामले में 2.5 μl नमूना)। यू लिन 2.6-260,000 प्रतियां / डीएनए के 2.5 μl रेंज में 0.12 लॉग 10 होने के लिए निर्धारित किया गया था।

विकास (चित्रा 1, नीला) और QRT- पीसीआर (चित्रा 1, पीला) के लक्षण वर्णन के बाद, AFNOR एनएफ U47-600 आदर्श QRT- पीसीआर (चित्रा 1, नारंगी) के लिए डीएनए निष्कर्षण से पूरे विश्लेषणात्मक विधि के लक्षण वर्णन की सिफारिश की। नैदानिक ​​संवेदनशीलता और विशिष्टता तालिका 4 में वर्णित के रूप में गणना की गई। QRT- पीसीआर पूरे विश्लेषणात्मक विधि के मात्रात्मक प्रदर्शन का मूल्यांकन किया गया था और मान्य शुद्धता के प्रोफाइल के साथ (

इस प्रोटोकॉल है, जो राज्य के-कला आणविक तकनीक का उपयोग करता है, हमें पता लगाने और EHV-2 172 नाक झाड़ू सांस की बीमारियों और / या संक्रमण के नैदानिक ​​संदेह की नजर से घोड़ों से प्राप्त नमूनों में वायरल जीनोम लोड यों की अनुमति दी। EHV -2 क्षेत्र (जैविक) के नमूनों से की घटनाओं में इस आबादी में 50% (86/172) था। मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला कि EHV-2 के वायरल जीनोम लोड युवा घोड़ों में काफी अधिक थे और वायरल जीनोम भार के पुनर्विभाजन उम्र (चित्रा 6) के साथ कम किया है। वर्तमान अध्ययन में, उच्चतम EHV-2 वायरल जीनोम लोड (1.9 x 10 11 प्रतियां / एमएल) foals (चित्रा 6) का पता चला था।

आकृति 1
चित्रा 1: विकास (नीला) के लिए कार्यप्रवाह चार्ट, मात्रात्मक आरटी पीसीआर के लक्षण वर्णन(पीला) और QRT- पीसीआर (नारंगी) के लिए डीएनए निष्कर्षण से पूरे विश्लेषणात्मक विधि के लक्षण वर्णन AFNOR आदर्श एनएफ U47-600-2 के अनुसार। कार्यप्रवाह चार्ट विकास के लिए विभिन्न चरणों शुरू, मात्रात्मक आरटी के लक्षण वर्णन -PCR और QRT- पीसीआर के लिए डीएनए निष्कर्षण से पूरे विश्लेषणात्मक पद्धति की विशेषता। प्रत्येक चरण के लिए, कार्यप्रवाह चार्ट आवश्यक रनों की संख्या को इंगित करता है, dilutions प्रदर्शन किए जाने की आवश्यकता होती है और विश्लेषकों की संख्या। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: वास्तविक समय पीसीआर 6 प्लाज्मिड के दस गुना धारावाहिक dilutions के साथ प्राप्त घटता से प्रतिनिधि परिणामों के साथ कमी क्षेत्र का निर्धारण। कमी क्षेत्र अनुमान लगाने के लिए, 6 दस गुना धारावाहिकdilutions (26,000 प्रतियां / 2.5 μl नमूना) और 10 -10 (0.26 प्रतियां / 2.5 μl नमूना) 10 -5 के बीच बना रहे हैं। कमी जोन (2.6 प्रतियां / 2.5 μl नमूना) और 10 -10 (0.26 प्रतियां / 2.5 μl नमूना) 10 -9 के dilutions के बीच स्थित है। इस मामले में, 6 प्लाज्मिड की दो गुना धारावाहिक dilutions इस कमी के क्षेत्र में किए गए थे लोद 95% पीसीआर निर्धारित करने के लिए, 5.2 और 0.16 प्रतियां / 2.5 μl नमूना के बीच। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। EHV2 qRT पीसीआर के लिए रेखीय प्रतिगमन मात्रात्मक परीक्षण के linearity परिणाम है जो लक्ष्य एक विशिष्ट श्रेणी में वर्तमान की एकाग्रता के लिए आनुपातिक हैं उत्पन्न करने की क्षमता है। इस से मॉडलिंग की जा सकती हैरेखीय प्रतिगमन (y = कुल्हाड़ी + ख) महत्वपूर्ण भूमिका निभाई प्रतिक्रिया (साइकिल सीमा या सीटी) और लक्ष्य की मात्रा के लघुगणक के बीच (लक्ष्य प्रतियां / 2.5 μl नमूना की संख्या)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 4
चित्रा 4:। EHV-2 qPCR के रेखीय प्रतिगमन का प्रदर्शन मतलब पूर्वाग्रह मापा प्लाज्मिड मात्रा के बीच अंतर मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं ( fig4-1 ) और सैद्धांतिक प्लाज्मिड मात्रा (एक्स 'i) प्रत्येक प्लाज्मिड स्तर के लिए। कार्यक्षेत्र सलाखों linearity अनिश्चितता (यू Lini) सूत्र द्वारा दिए गए प्रतिनिधित्व
fig4-2
जहां SD'i मानक विचलन ओ है एफ मापा प्लाज्मिड मात्रा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। EHV-2 QRT- पीसीआर विधि के सत्यापन के परिणामों के आधार पर सटीकता प्रोफाइल हरे रंग की लाइन (हलकों) के आंकड़ों के सच्चाई (व्यवस्थित त्रुटि, या पूर्वाग्रह) का प्रतिनिधित्व करता है। स्वीकार्यता सीमा प्रयोगशाला (धराशायी लाइनों) द्वारा पर ± 0.75 लॉग 10 परिभाषित कर रहे हैं। निचले और ऊपरी सीमा सटीकता विश्वसनीयता डेटा (लाल लाइनों) के दो बार मानक विचलन ± मतलब पूर्वाग्रह से प्रत्येक प्लाज्मिड लोड स्तर के लिए निर्धारित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 "> चित्रा 6
चित्रा 6:। EHV-2 साल की उम्र के अनुसार वायरल जीनोम लोड की मात्रा EHV-2 नाक झाड़ू नमूने में पाया की वायरल जीनोम लोड वितरण विभिन्न आयु समूहों के लिए प्रतिनिधित्व किया है। क्षैतिज लाइनों मानक विचलन (M = महीने) के भीतर मंझला मूल्यों का प्रतिनिधित्व। * गौरतलब न्यूमैन-Keuls पोस्ट अस्थायी परीक्षण (पी <0.05) के साथ एनोवा से अलग है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लक्ष्य जीन प्राइमरों, जांच और plasmide दृश्यों (5'-3 ') न्यूक्लियोटाइड स्थिति उत्पाद का आकार (न्यूक्लियोटाइड) संदर्भ
EHV2 gB
(HQ247755.1) 		फॉरवर्ड: GTGGCCAGCGGGGTGTTC 2113-2130 78 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट 1 1
रिवर्स: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA 2189-2170 95 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड 45 चक्र
जांच: परिवार-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB 2132-2157 60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट
प्लाज्मिड:
ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA
ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG
GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT
CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA
GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG
TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT
ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG
GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG
CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA
ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG 		2081-2381

तालिका 1:। प्राइमरों, जांच और सकारात्मक सिंथेटिक डीएनए नियंत्रण इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के दृश्यों प्लाज्मिड के अनुक्रम (सकारात्मक सिंथेटिक डीएनए) के पदों पर EHV2gB अनुक्रम (HQ247755.1) के 2081-2381 न्यूक्लियोटाइड से मेल खाती है। प्राइमरों और जांच इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की डिजाइन विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्राप्त किया गया था।

रोगजनकों संदर्भ (मूल) उपभेदों की संख्या परिणाम
EHV-2
EHV-2 VR701 (ATCC) सकारात्मक
20 नमूने (FDL संग्रह)
EHV-5 KD05 (Gerc) 20 नकारात्मक
20 नमूने (FDL संग्रह)
EHV -3 VR352 (ATCC) 2 नकारात्मक
T934 WSV (Gerc)
EHV-1 केंटकी तनाव Ky ए (ATCC) 3 नकारात्मक
2 नमूने (FDL संग्रह)
EHV-4 VR2230 (ATCC) 1 नकारात्मक
गदहे herpesvirus AHV5 FDL संग्रह 1 नकारात्मक
घोड़ाइन्फ्लूएंजा वायरस ए / घोड़ा / Jouars / 4/2006 (H3N8) 1 नकारात्मक
(परिग्रहण संख्या JX091752)
घोड़े का आर्टेराईटिस वायरस VR796 (ATCC) 2 नकारात्मक
Rhodococcus सम FDL संग्रह 1 नकारात्मक
स्ट्रेप्टोकोकस सम subsp। Zooepidemicus FDL संग्रह 1 नकारात्मक
स्ट्रेप्टोकोकस सम subsp। सम FDL संग्रह 1 नकारात्मक
Coxiella burnetii आदि- 142-100 (Adiagene) 1 नकारात्मक
Chlamydophila abortus आदि- 211-50 (Adiagene) 1 नकारात्मक
क्लेबसिएला टायरmoniae FDL संग्रह 1 नकारात्मक

तालिका 2: EHV-2 के लिए QRT- पीसीआर का विश्लेषणात्मक विशिष्टता।

टेबल तीन
तालिका 3: पूर्वाग्रह और linearity अनिश्चितता (एनएफ U47-600-2 12 से अनुकूलित) की गणना। प्रत्येक परीक्षण के लिए, रेखीय प्रतिगमन के प्रदर्शन (y = कुल्हाड़ी + ख) तालिका जहां y चक्र प्राप्त सीमा का उपयोग कर पुष्टि कर रहे हैं, एक ढलान प्राप्त है;। X प्लाज्मिड स्तर पर है और ख अवरोधन है मैं प्लाज्मिड है (जैसे, कश्मीर कश्मीर इस्तेमाल किया प्लाज्मिड स्तरों की संख्या है = 6 टी में; स्तर (मैं कश्मीर के स्तर के लिए 1 से भिन्न होता है)अपनी मेज); जम्मू (जम्मू मैं परीक्षण करने के लिए 1 से भिन्न होता है) परीक्षण है, मैं परीक्षणों की संख्या, जैसे मैं = 4 इस तालिका में) 3 और 6 परीक्षणों के बीच शामिल है (एक्स मैं प्रत्येक के लिए अनुमानित प्लाज्मिड मात्रा है। मैं स्तर प्लाज्मिड। x प्रत्येक स्तर मैं प्लाज्मिड के लिए मैं = लॉग 10 (एक्स i) 'मैं सैद्धांतिक प्लाज्मिड मात्रा के साथ समीकरण एक्स प्राप्त है'। प्रत्येक जम्मू परीक्षण के दौरान, चक्र सीमा प्रत्येक के लिए मैं प्राप्त प्लाज्मिड स्तर रेखीय प्रतिगमन के साथ गणना की जाती है y i, j = एक एक्स जे मैं, जम्मू + बी जे। table3-1 परीक्षण के दौरान मापा जम्मू प्लाज्मिड मात्रा है। पूर्वाग्रह मैं उप> अंतर मापा प्लाज्मिड मात्रा और प्रत्येक परीक्षण के लिए सैद्धांतिक प्लाज्मिड मात्रा और प्रत्येक प्लाज्मिड स्तर बीच मनाया जाता है। table3-2 का मतलब मूल्य है table3-3 प्रत्येक से मैं स्तर प्लाज्मिड, एसडी 'मैं मापा मात्रा के मानक विचलन है table3-4 प्रत्येक के लिए मैं प्लाज्मिड स्तर; पूर्वाग्रह मतलब पूर्वाग्रह मैं का मतलब है, यू Lini linearity प्रत्येक के लिए चुना गया अनिश्चितता मैं गणना SD'i से स्तर प्लाज्मिड और पूर्वाग्रह मतलब है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "के लिए: रखने के-साथ-next.within-पेज =" हमेशा "> नमूने की वास्तविक स्थिति सकारात्मक नकारात्मक परिणाम पूरे विधि के साथ प्राप्त सकारात्मक आरपी (वास्तविक सकारात्मक) एफपी (झूठी सकारात्मक) नकारात्मक एफ एन (झूठी नकारात्मक) आर.एन. (असली नकारात्मक) कुल आरपी + एफ एन एफपी + आर.एन. Se = आरपी / (आरपी ​​+ एफ एन) सपा = आर.एन. / (आर एन + एफपी)

सारणी 4:। पूरे विधि के निदान के प्रति संवेदनशीलता की गणना (एसई) और विशिष्टता (सपा) के एक श्वार्ट्ज तालिका confid गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया थासंवेदनशीलता और पूरे विधि एनएफ U47-600-2 में वर्णित के रूप में की विशिष्टता के 95% से कम खिलाडि़यों अंतराल।

Discussion

2000 के दशक के बाद से, वास्तविक समय पीसीआर प्रयोगशालाओं के एक बढ़ती हुई संख्या में सोने के मानक तकनीक (सेल संस्कृति और बैक्टीरिया संस्कृति तरीकों) की जगह दी गई है। तकनीक के कार्यान्वयन अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि प्रयोगशाला तरीकों का सत्यापन, सटीक repeatable और विश्वसनीय आंकड़े सुनिश्चित करने के लिए आणविक पता लगाने और रोगाणुओं की मात्रा का ठहराव के लिए आवश्यक है।

चूंकि निष्कर्षण कदम जैविक सामग्री के नुकसान का प्राथमिक स्रोत है, यह एक प्रोटोकॉल और एक अन्य के बीच मात्रा का ठहराव की त्रुटि का मुख्य स्रोत माना जा सकता है। जैसे, QRT- पीसीआर के दौरान डीएनए प्लाज्मिड के एक मानक वक्र, मुख्य रूप से साहित्य में सूचना के सृजन, वायरल जीनोम लोड संकेत है, लेकिन निकासी कदम खाते में नहीं ले करता है।

AFNOR आदर्श एनएफ U47-600-2 में एक पूरे विधि सत्यापन प्रक्रिया के लिए एक नए सिरे से रणनीति का विवरण इस क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है। में सचित्र के रूप मेंEHV-2 घोड़ों में इस कागज, या मधुमक्खियों 21 में दूसरों के द्वारा, इस विकास कदम और पीसीआर के लक्षण वर्णन और पूरे विधि के लक्षण वर्णन के साथ सत्यापन के कदम के बीच स्पष्ट भेदभाव जरूरी है। इस दिलचस्प दृष्टिकोण में एक सीमा है कि प्रोटोकॉल में कोई बदलाव दायित्व पूरी प्रक्रिया है जो बहुत महंगा हो सकता है revalidate करने में परिणाम होगा। यह सीमा भी सच है कि मात्रा का ठहराव के दायरे स्रोत है जो वायरस से निकाला जाता है (उदाहरण के लिए, श्वसन तरल पदार्थ, अंगों, खून या मूत्र) पर निर्भर द्वारा डाला गया था। वास्तव में, प्रत्येक मैट्रिक्स उनकी भौतिक-रसायन विज्ञान विशेषताओं में विभिन्न विशिष्टताओं प्रस्तुत करता है और यह स्वतंत्र रूप से एक अलग वायरल का पता लगाने और QRT- पीसीआर द्वारा मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया मैट्रिक्स को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, प्रत्येक जैविक नमूने के वायरल जीनोम लोड निकासी से अधिक ठीक मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। लक्षण वर्णन भी खाते thermocycler आधुनिक में ले जाता हैएल और जब एक पहले से अच्छी तरह से विशेषता विधि के प्रयोग (जैसे, EHV-2 qPCR विधि इस पत्र में वर्णित) मूल प्रयोगशाला से या किसी अन्य प्रयोगशाला में मशीन के एक नए प्रकार जरूरी है, एक है कि साधन के प्रदर्शन की पुष्टि करनी होगी। एक qPCR परख के प्रदर्शन की पुष्टि के लिए एक शर्त के लिए सभी परीक्षण एक प्रयोगशाला में लाना है। यह सामान्य रूप में जाना जाता गुणों के साथ एक संदर्भ नमूना विश्लेषण करके हासिल की है। इस तरह की एक जाँच के लिए एक शर्त और अनिवार्य माना जाता है के रूप में आदेश qPCR (लोद, LOQ दक्षता) के प्रदर्शन और पूरे विधि (लोद, LOQ) की मजबूती को मान्य करने में एनएफ 47-600-1 AFNOR के आदर्श से अनुरोध किया है। न केवल विकास और लक्षण चरणों के दौरान भी है लेकिन जब अनुसंधान के क्षेत्र में या नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है, जोखिम कारकों की पहचान की जा सकती है और अच्छी तरह से प्रोटोकॉल का मानकीकरण सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित किया। विशेष चिंता की पर्याप्त कर्मचारियों के प्रशिक्षण, उच्च योग्य कर्मियों, उपभोग्य सामग्रियों की गुणवत्ता नियंत्रण हैइस्तेमाल किया और उनके भंडारण, तत्काल पर्यावरण की स्थिति और metrological की स्थिति के बारे में जागरूकता है कि वैज्ञानिक परख में शामिल उपकरणों के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता का नियंत्रण। अंतर-प्रयोगशाला तुलना के लिए संदर्भ के नमूने का उपयोग भी अनिश्चितताओं नियंत्रित करने में मदद कर सकता है। इस तरीके में, प्रयोगशालाओं के बीच डेटा की तुलना की जा सकती है। दरअसल, अंतर-प्रयोगशाला दक्षता परीक्षण का मूल्यांकन करने और विधि के reproducibility पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं।

वायरल जीनोम लोड परिणामों का विश्लेषण किया जो जैविक मैट्रिक्स के अंतरराष्ट्रीय इकाइयों (आइयू) में व्यक्त कर रहे हैं (आइयू: तरल पदार्थ या प्रतियों के लिए प्रतियां / एमएल ऊतकों के लिए / छ) के क्रम में विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करने में उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं। LOQ ऊपर सभी परिणाम एक गैर मात्रात्मक सकारात्मक परिणाम के रूप में लिया जाता है प्रतियां / एमएल और लोद और LOQ के बीच एक परिणाम के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। इस तरह से जीनोम के quantificational आंकड़े पेश की प्रक्रिया को और अधिक ठीक अनुरूप हैविश्लेषण के एस (जीनोम के प्रवर्धन)। वास्तव में, सेल संस्कृति प्रयोगों में, TCID 50 से वायरल लोड की अभिव्यक्ति (मंझला टिशू कल्चर संक्रामक खुराक) कोशिकाओं और वायरस उपभेदों की प्रकृति पर निर्भर है। प्रत्येक तनाव लाइन के पास अपनी अनूठी संक्रमण कैनेटीक्स और EHV-2 की तरह कुछ वायरस कई दिन लग सकते हैं इससे पहले पहली कोशिकाविकृतिजनक प्रभाव स्पष्ट है।

अंत में, QRT- पीसीआर के लक्षण वर्णन की इस नई विधि डेटा प्रस्तुति और प्रयोगशालाओं के बीच व्याख्या के अनुरूप सुविधा चाहिए। यह संभावित नए उपस्थिति या रोगज़नक़ के अभाव के बजाय केवल रोग की स्थिति की घोषणा के लिए कट-ऑफ मूल्य की स्थापना की तरह भविष्य में QRT- पीसीआर के अनुप्रयोगों के लिए बहुत उपयोगी हो जाएगा।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate  Dutsher 16924
Adhesive film qPCR Absolute  Dutsher 16629 Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 ml microtubes, skirted, caps Dutsher 039258
Ethanol 98% Sodipro SAF322941000
Primers Eurofins Custom order
Probe Life Technologies Custom order
Plasmid Eurofins Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit
(containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes) 		 Qiagen 52906 AVL buffer: pre-warm 5 min at 72 °C
Sequencing by Sanger method Eurofins Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix Life Technologies 4364340
Tris-EDTA buffer solution Santa Cruz sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermoscientific ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems Life Technologies 4376600 pre-warm 15 min 

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 109 मात्रात्मक आरटी पीसीआर पीसीआर आदर्श अनुमापन पता लगाने की सीमा मात्रा का ठहराव linearity संवेदनशीलता विशिष्टता सत्यापन की सीमा equid herpesvirus -2 घोड़ा
विकास और श्वसन तरल पदार्थ में Equid herpesvirus -2 निदान के लिए एक मात्रात्मक पीसीआर विधि के मान्यकरण
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Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, … More

Hue, E. S., Fortier, C. I., Laurent, A. M., Quesnelle, Y. F., Fortier, G. D., Legrand, L. J., Pronost, S. L. Development and Validation of a Quantitative PCR Method for Equid Herpesvirus-2 Diagnostics in Respiratory Fluids. J. Vis. Exp. (109), e53672, doi:10.3791/53672 (2016).

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