Introduction
Arenavirussen zijn een familie van omhulde, enkelstrengs RNA-virussen die voornamelijk gevoerd knaagdieren aard 1-3. Hoewel deze virussen meestal vast een asymptomatische, aanhoudende infectie bij knaagdieren reservoirs 1,2, kunnen ze ernstige ziekte bij de mens veroorzaken 3. Belangrijke pathogene soorten zijn de Nieuwe Wereld Junin virus (JUNV) 4 en de Oude Wereld Lassa virus 5, waarbij de etiologische agenten van de Argentijnse hemorragische koorts in Zuid-Amerika en Lassa koorts in Afrika, respectievelijk. Lymfocytische choriomeningitisvirus (LCMV), het prototype virus van de familie 6, heeft een wereldwijde verspreiding en is verantwoordelijk voor een aantal ziektetoestanden waaronder aseptische meningitis bij immuuncompetente individuen 6, ernstige aangeboren afwijkingen bij de foetus 7 of hoge letaliteit immunosuppressieve individuen na solide-orgaantransplantatie 8,9. Het ontbreken van Verenigde StatenFood and Drug Administration (FDA) -goedgekeurd vaccins of effectieve antivirale middelen om deze virussen te bestrijden wijst op de absolute noodzaak om nieuwe strategieën voor het therapeutisch deze opkomende / re-opkomende ziekteverwekkers te ontwikkelen.
De arenavirus genoom bestaat uit twee enkelstrengige RNA-segmenten, de grote (L) (~ 7,2 kb) en klein (S) (~ 3,6 kb) segmenten 10. De S-segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en envelop glycoproteïne (GP), terwijl de L-segment codeert voor het virale polymerase (L) en matrix eiwit (Z). De SL en genomische RNA segmenten (vRNA's) worden verpakt in virions 10-12. De eerste stap van arenavirus infectie hechting van virale partikels aan gastheercellen via een interactie tussen de virale huisarts en de bijbehorende gastheercel receptoren die voor JUNV, omvat de menselijke transferrinereceptor 1 (hTfR1) 13,14. Na bevestiging worden JUNV deeltjes in de cel genomen via clathrine-gemedieerde endocytose 15.Deeltjes dan verkeer naar de late endosoom waar de lage pH van dit compartiment het startsein voor de activering van GP 16,17. Eenmaal geactiveerd, de GP-gecodeerde fusiepeptide inserts in de endosomale membraan, het initiëren van fusie tussen de virale en endosomale membranen. Succesvolle combinatie resulteert in het vrijkomen van het virion verpakt vRNA's in het cytoplasma, waar ze dienen als matrijzen voor genomische replicatie en transcriptie. Wanneer voldoende hoeveelheden virale structurele proteïnen en vRNA's worden gegenereerd, nieuwe deeltjes monteren en de knop van de geïnfecteerde cel naar de levenscyclus 18 ronden.
Tot de ontdekking van nieuwe strategieën vergemakkelijken het therapeutisch pathogene arenavirussen, heeft onze fractie gericht op de identificatie van gastheer factoren die kritiek zijn voor viruspropagatie, maar overbodig voor de gastheer. In dit verband vaststellen van de precieze fase (n) van de virale levenscyclus worden gecontroleerd door deze gastheerfactoren moet de leidraadontwikkeling van antivirale strategieën. Hierin beschrijven we een kwantitatief (q) RT-PCR gebaseerde bepaling die kan worden gebruikt om arenavirus-celhechting voor de identificatie of geselecteerde gastheer- en / of antivirale moleculen beïnvloeden deze eerste fase van virale ingang 19 meten. Alternatieve benaderingen arenavirus-celhechting te meten hebben gekenmerkt virionen gelabeld met biotine 20, fluorescerende kleurstoffen 21, of radioactieve isotopen 22. Nadelen van deze methoden kan de vereiste grote hoeveelheden toegevoegd virus (bijvoorbeeld hoge multipliciteit van infectie (MOI)), het gebruik van radioactiviteit en / of aanvullende behandelingsstappen aan toegevoegd virus (bijvoorbeeld concentratie en / of het etiket van virus) te bereiden omvatten . Met name het gebruik van hoge MOI maakt het moeilijk om onderscheid te maken productief versus niet-productieve gehechtheid gebeurtenissen 15,23. De qRT-PCR-gebaseerde test die hier beschreven kunnen attachment gebeurtenissen detecteren met behulp van zo weinig als 20 plaque voorming eenheden (PVE) virus, wat zich vertaalt in een MOI van 0,0004 voor een 48-wells plaat. Daarom is de sterke gevoeligheid van de test overwint de behoefte aan hoog traagheidsmoment en virussen etikettering of concentratiestappen. Verder kan de assay i) ingericht om virion endocytose meten en afgifte van virusgenoom in het cytoplasma volgende fusie en ii) aangepast zijn voor andere virussen door de ontwikkeling van virus-specifieke qRT-PCR reagentia (voor voorbeelden zie 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Let op: Het is essentieel dat de beschreven protocol worden uitgevoerd met strikte pre-PCR-techniek (zie 28 voor een uitstekend overzicht over hoe het opzetten van een pre-PCR laboratorium en hoe experimenten uit te voeren met behulp van een goede pre-PCR-techniek). Het is absoluut noodzakelijk dat alle reagentia en apparatuur zijn vrij van versterkte DNA dat de qPCR doelsequentie en dat er passende controles zijn om een dergelijke besmetting op te sporen. Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1.
1. Bereid Media en Seed cellen in 48-well platen
- Bereid 500 ml compleet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat 10% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine, en 1% HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethaansulfonzuur) buffer door toevoeging van 50 ml warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en 5 ml van een 100x penicilline-streptomycine en 100x HEPES bufferoplossing een flesje 500 ml DMEM. Deze oplossing kan worden bewaard bij 476, C maanden.
- Zaad 2,5 x 10 4 Vero E6-cellen per putje in een 48-well weefselkweekplaat in een eindvolume van 500 pl compleet DMEM. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 10-18 uur.
- Zaad de plaat aan het einde van de werkdag. Test elk virus monster in een van beide dubbele of drievoudige putjes.
Opmerking: Terwijl een 48-well-platform voor deze assay wordt beschreven, moet het mogelijk zijn om de test die voor gebruik in schalen met 96 of 384 putjes.
- Zaad de plaat aan het einde van de werkdag. Test elk virus monster in een van beide dubbele of drievoudige putjes.
2. Carry Out Virus-cel Attachment
Opmerking: Het virus gebruikt in dit protocol, JUNV stam Spontaan # 1 (C # 1), is met succes gebruikt als een levend verzwakt vaccin voor de preventie van de ziekte JUNV 29. JUNV C # 1 was afgeleid van de virulente stam JUNV XJ via seriële passage zowel in vivo als in vitro en verschilt van de parentale stam door XJ 12 aminozuren 30. Because JUNV C # 1 is een bioveiligheidsniveau (BSL) -2-rated ziekteverwekker, moet het werk beschreven voor dit gedeelte worden uitgevoerd met de juiste BSL-2 praktijken 31. Dit omvat het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (bijvoorbeeld bescherming van de ogen, laboratoriumjas, dubbele handschoenen), een klasse II bioveiligheid kast, en zorgt ervoor dat alle institutionele opleiding en goedkeuringen nodig is om veilig te behandelen dit organisme hebben ontvangen.
- Verdun de JUNV C # 1 monster (s) te testen om de gewenste PVE of focus eenheden in ijskoud compleet DMEM en op te slaan op het ijs pas klaar om elk putje toe te voegen.
Opmerking: Als alternatief voor het uitvoeren van de bindingsstudies met virus verdund in compleet DMEM, gebruikt een minimaal medium dat PBS met een verminderde serumconcentratie (2%) en een geschikte buffer te gaan of serum interferentie met virusbinding kan veroorzaken. Vergelijkbare attachment protocollen voor alternatieve virussen hebben het gebruik van RPMI 1640 medium zonder bicarbo gemeldnate bevattende 0,2% runderserumalbumine, 10 mM (2- (morfolino) ethaansulfonzuur), en 10 mM HEPES, pH 6,8 32. Deze binding media kunnen superieur zijn om pH-veranderingen die kunnen optreden wanneer de media van de CO 2 -Milieu van de incubator wordt verwijderd te voorkomen.- Wordt geënt in wells met PVE, variërend van 200 tot 2.000 tot niet-productieve attachment gebeurtenissen beperken. Zoals getoond in figuur 2, deze test is het opsporen van hechting gebruik zo weinig als 20 PFU (of zoveel als 2 x 10 6 PFU).
- Maak een master mix van het virus voor inenting op cellen. Elk virus monster wordt geïnoculeerd duplo putjes in een volume van 50 pl per putje. Als dus de toevoeging van 2000 PVE virus per putje gewenst, verdund 4800 PVE in een totaal volume van 120 pl ijskoud compleet DMEM.
- Om te controleren voor de specificiteit van de test, gebruik maken van een aangepast paar van de Chinese hamster ovarium cellijnen die ofwel niet uitdrukken TfR1 (TRVb) of expruk hTfR1 (TRVb-1) als JUNV gehechtheid aan deze cellen moeten worden verminderd of niet, respectievelijk 13,33. Alternatief, behandel cellen met een protease, zoals proteïnase K tot arenavirus bevestiging 34 of ingang 35 te voorkomen. Oplosbare hTfR1 of het monoklonale antilichaam ch128.1, dat specifiek is voor hTfR1, kan ook worden beschouwd als ze bekend om de toegang van JUNV in cellen 13,36 blokkeren. Bovendien, voorbehandeling van cellen met gratis mannose 14 of incubatie van deeltjes met JUNV-specifieke neutraliserende antilichamen 37 kunnen virus toegang te belemmeren.
- Let echter op dat deze laatste reagentia en benaderingen, ondanks het blokkeren JUNV binnenkomst, zijn niet bevestigd tot bevestiging te blokkeren, hoewel dit een waarschijnlijke verklaring. De hier beschreven protocol kan worden gebruikt om formeel bepalen of deze verschillende benaderingen effect virion bevestiging.
- Verwijder platen uit de 37 ° C incubatorplaatsen hetzij in een 4 ° C koelkast of op ijs gedurende 15 min om het vermogen van de cellen uitgeplaat endocytose uitvoeren remmen.
- Vervolgens zuig het volledige DMEM uit elk putje en snel wassen elk putje wordt tweemaal telkens met 100 ul ijskoude PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) pH 7,4. Voeg vervolgens 50 pl van het verdunde pre-virus monsters (bereid in stap 2,1) aan de geschikte putjes.
- Wikkel de plaat in plastic folie en onmiddellijk te plaatsen ofwel terug op het ijs of in een 4 ° C koelkast gedurende 1 tot 1,5 uur om het virus gehechtheid aan optreden. Houd de plaat, wassen buffer, en virusmonsters koud bij 4 ° C gedurende deze stap.
- Na de voltooiing van de 4 ° C incuberen, zuig het virus inoculum en was elk putje 3 maal met 200 ul ijskoude PBS.
3. Viral RNA Extraction
- Zuiver viraal RNA uit JUNV C # 1 deeltjes aan de monolagen met de commerciële kit (bijv RNeasy Mini kit) according het protocol van de fabrikant. Specifically, volg dan de "zuivering van totaal RNA van dierlijke cellen gebruik makend van spin-technologie protocol" op pagina's 23-28 in de RNeasy Mini Handbook (4e editie, april 2006) met de onderstaande wijzigingen.
- Lyseren de cellen zoals aangegeven in stap 1B door het direct toevoegen van 350 ui lysisbuffer RLT aan elk putje. Meng de buffer verscheidene keren cellysis te garanderen. Merk op dat cellen lyseren gemakkelijk in deze buffer en volledige lysis kan worden gecontroleerd door het bekijken putjes onder een omgekeerde microscoop.
- Het verkregen cellysaat de kit kolom (stap 3a) en volg de rest van het protocol zoals beschreven. Op dit moment is het virus geneutraliseerd door de lysis buffer zodat de resterende stappen van het protocol kan worden gedaan buiten de klasse II bioveiligheid kast verschaft de kit buizen werden niet besmet met infectieus virus.
- Voeg de optionele stap 9 van het protocol van de fabrikant, die een additional centrifugeren van de spin kolom om eventuele overdracht van Buffer RPE te elimineren.
- In de laatste stap protocol van de fabrikant (stap 10), elueren de gezuiverde RNA van de spin kolom met 30 ul nuclease-vrij DDH 2 O. RNA opslag bij -80 ° C op dit punt of direct gebruik in de qRT-PCR assay. Afbraak van gezuiverd viraal RNA monsters voorkomen nucleasen Gebruik nuclease-vrije reagentia en materialen en houden ontdooide RNA-monsters op ijs.
Opmerking: Buffers RLT en RW1 bevatten guanidinezout en mag niet worden vermengd met bleekwater. Buffer RW1 bevat ethanol.
4. qRT-PCR Meting van virale genoom
- Om JUNV C # 1 S segment RNA omgezet in cDNA voor daaropvolgende qPCR, bloot het virale RNA (opgewekt in stap 3.1.4) tot kamertemperatuur in een totaal volume van 50 pl.
- Het opzetten van de RT-reactie, eerst een master mix met elk van de volgende reagentia per reactie: 6,75 pi nuclease-vrij DDH 2 O, 5 ui van een 2 pM voorraad van de RT-primer S 2098- 2075- aan (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), dat complementair is aan het gebied NP van de S segment genomisch RNA, 5 gl 10X PCR-buffer II, 11 pi van een 25 mM MgCl2-oplossing, 1,25 pl (62,5 eenheden) van RT enzym, 1 gl (0,4 eenheden) RNase inhibitor, en 10 gl van een 500 uM dNTP voorraad.
Opmerking: In de loop van arenavirus replicatie, zijn 4 virus S segment RNA species gegenereerd: een volledige lengte genomisch RNA (vRNA), een volle lengte antigenoom RNA (vcRNA) (die het omgekeerde complement van het vRNA) en twee subgenomische mRNAs codeert de NP en GP-genen, respectievelijk. De RT-primer Hier worden specifiek is voor alleen de S segment vRNA, maar niet de vcRNA, NP mRNA of mRNA GP. - Meng de RT master mix en aliquot 40 pi in afzonderlijke 0,2 ml PCR-buizen. Voeg 10 ul van viraal RNA aan elke buis. Omvatten i) een no-template controle buis (bv. Voeg 10 ul nuclease-vrij DDH 2 O tot 40 pi van de master mix) en ii) een niet RT enzymcontrole (bijv voeg 10 ul van een bekende positieve viraal RNA monster 40 pi Master Mix die niet ontvangen elke RT enzym) te screenen op besmetting van de RT reagentia met geamplificeerd DNA dat het virale doelsequentie. Omvatten RNA geëxtraheerd uit geïnfecteerde cellen met de volledige RT master mix te controleren voor assay specificiteit in aanwezigheid van cellulair RNA.
- Bovendien zijn een bekende positieve viraal RNA staal voor het werkelijke master mix de kwaliteit van de RT reagentia te controleren. Merk op dat het volume van de RT-reactie om 25 gl kan zonodig verlaagd.
- Het opzetten van de RT-reactie, eerst een master mix met elk van de volgende reagentia per reactie: 6,75 pi nuclease-vrij DDH 2 O, 5 ui van een 2 pM voorraad van de RT-primer S 2098- 2075- aan (5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3 '), dat complementair is aan het gebied NP van de S segment genomisch RNA, 5 gl 10X PCR-buffer II, 11 pi van een 25 mM MgCl2-oplossing, 1,25 pl (62,5 eenheden) van RT enzym, 1 gl (0,4 eenheden) RNase inhibitor, en 10 gl van een 500 uM dNTP voorraad.
- Het aldus RT buizen naar de volgende cyclingcondities: 25 ° C gedurende 10 min, 48 ° C gedurende 30 min, en 95 ° C gedurende 5 minuten. Merk op dat monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C op dit moment of gedurende één nacht in de thermocycler door toevoeging van een 4 ° C stap.
- Perform qPCR in een totaal volume van 25 pl.
- Wordt qPCR Master Mix door het volgende te combineren: 2,5 pl (van 9 pM voorraad) van elk van de voorwaartse PCR primer S1937 + tot 1958+ (5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3 ') en reverse PCR primer S 2001- 1982- tot (5 '-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'), 2,5 pl (van een 2 pM voorraad) van de qPCR probe S 1960+ tot 1975+ (5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3 ') en 12,5 pl van de universele 2X qPCR master mengen. Merk op dat de voorwaartse primer hier vermeld, dat specifiek is voor JUNV C # 1 verschilt met 1 nt van het oorspronkelijk gerapporteerde primersequentie 38, waarbij de virulente stam JUNV Romero richt.
- Meng de oplossing en voeg dan 20 ul aan elk qPCR ook. Voeg 5 ul van elke RT-reactie aan de juiste putjes qPCR. Gedrag qPCR in drievoud voor elk getest monster. Merk op dat het reactievolume PCR kunnen worden gereduceerd tot slechts 12,5 pl indien nodig.
Opmerking: De software die hoort bijde qPCR machine absolute kopie aantal JUNV C # 1 S segment genomisch RNA te genereren door de waarde van elk onbekend monster te vergelijken met een serie standaard verdunningen van plasmide dat codeert voor het JUNV C # 1 NP-gen, die het voorwerp van de qPCR primer en probe set. De qPCR assay kan alleen kwantificering van waarden die binnen het bereik van de standaardkromme vallen. Daarom bevatten de volgende hoeveelheden plasmide (in triplo putjes): 5, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 en 5 x 10 7 kopieën per putje.
- Laad de qPCR plaat in de thermocycler en voer de volgende reactieomstandigheden: 95 ° C gedurende 10 minuten en 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 sec en 60 ° C gedurende 1 min.
- Verzamelen en analyseren van de hoeveelheid van viraal RNA in elk monster te bepalen volgens het protocol van de fabrikant.
- Een standaardcurve stellen door de nieuw gezuiverde monster van plasmide dat het qPCR teerkrijgen volgorde, eerst het plasmide aantal kopieën in deze oplossing te bepalen.
- Bereken het molecuulgewicht van het plasmide. Indien de sequentie van het gehele plasmide bekend, berekenen aan de hand van de volgende formule: MW = ([A * 312,2] + [G * 328,2] + [C * 288,2] + [T * 303,2] - 61,13). Herinner het totale aantal van een bepaalde nucleotidesequentie vinden op elke streng van het dubbelstrengs plasmide bevatten.
- Als de grootte van het plasmide is bekend, maar de exacte sequentie niet Bereken het MW onder de veronderstelling dat elke dsDNA basenpaar heeft een MW van 600.
Opmerking: De pCAGGS-JUNV C # 1 NP plasmide hier gebruikt heeft een MW van 4,2 x 10 6. - Zodra het MW van het plasmide werd bepaald, berekenen hoeveel kopieën per ul in de voorraad plasmide oplossing.
- Allereerst wordt de totale ug plasmide in de oplossing, deze vervolgens omzetten in mol plasmide (bijvoorbeeld als 69 pg plasmide zijn opgenomen in 300 pl water, daarna 6,9 x 10 -5 g plasmide * 1 mol / 4,2 x 10 6 g plasmide = 1,6 x 10 -11 mol plasmide), die kan worden omgezet nummer over (bijvoorbeeld 1,6 x 10 -11 mol plasmide * 6,022 x 10 23 moleculen / mol = 9,8 x 10 12 moleculen (of kopieën)).
- Verdeel de totale kopieën van plasmide in het plasmide oplossing door het volume van die oplossing om kopieën per ul te krijgen (bijvoorbeeld 9,8 x 10 12 kopieën / 300 pi = 3,28 x 10 10 exemplaren).
- Verdun deze oplossing adequaat zodat 5 gl volumes op de PCR-plaat kan worden geplaatst om het bereik van kopie-aantallen nodig standaardcurve vast leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de gevoeligheid en dynamisch bereik van de qPCR test aan te tonen, werden bekende hoeveelheden van een plasmide dat codeert voor het NP-gen van JUNV C # 1 (range 5-5 x 10 7 exemplaren) onderworpen aan qPCR zoals beschreven in paragraaf 4 van het protocol. De test is gevoelig en betrouwbaar kan detecteren zo weinig als 5 kopieën van het doelnucleïnezuur (figuur 2). Verder is het dynamische bereik van de assay is groot en, zoals getoond in figuur 2 kan ten minste 7 logs matrijs bedekken. Hoewel niet getoond, hebben we ontdekt liefst 5 x 10 9 exemplaren van nucleïnezuur.
Om het nut van de test voor het meten van JUNV C # 1 deeltje attachment illustreren, werden verschillende hoeveelheden JUNV C # 1 vooraf gebonden Vero E6-cellen zoals beschreven in het protocol. Na het wegwassen van ongebonden deeltjes werden cellen gelyseerd voor RNA-zuivering en de resulterende RNA-monsters werden onderworpen aan qRT-PCR. Zoals getoond in figuur 3, kan de assay detecteren virale hechting gebeurtenissen met behulp zo weinig als 20 of zoveel als 2 x 10 6 PFU, wat zich vertaalt naar MOI van 0,0004 en 40, respectievelijk.
Zoals getoond in figuur 4, is het mogelijk om het protocol te wijzigen om niet alleen te meten virale hechting, maar ook de mate van amplificatie van het genoom in virusdeeltjes de inkomende tijd. Deze gewijzigde benadering kan worden gebruikt als een surrogaat te bepalen of verdere gebreken in de resterende stappen van virale binnenkomst (bijvoorbeeld deeltjes endocytose en / of fusie en het vrijkomen van virale genoom in het cytoplasma) kan worden voorkomen. Interessant is dat de hoeveelheid viraal genoom lijkt af te nemen tijdens de eerste 6 uur na bevestiging, wat suggereert dat een deel van de binnenkomende virale genoom wordt afgebroken. Dit kan gebeuren met deeltjes die niet in de cel te nemen en af te breken in de extracellheid op ruimte of misschien te wijten aan de afbraak in het endolysosomal netwerk. De getoonde gegevens tonen dat 12 of 18 uur na infectie zou optimale tijden te screenen op actieve genoomreplicatie.
Figuur 1:. Afbeelding van protocol workflow De hoofdstappen van het virus-celhechting assay 1) incubatie van virusdeeltjes aan cellen bij 4 ° C om virus-celhechting voor te komen, gevolgd door wassen om ongebonden virus te verwijderen, 2) zuivering van viraal RNA uit de cellen, 3) reverse transcriptie (RT) nodig JUNV S segment genomisch RNA (vRNA) in cDNA, en 4) qPCR kopieën van JUNV S vRNA sommen als een maat voor virus-celhechting. klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. QPCR assay voor de detectie van JUNV S segment genoom gevoelig en kan worden gebruikt over een groot dynamisch bereik Het JUNV S segment qPCR primer-probe set werd getest op zijn vermogen om nauwkeurig bekende hoeveelheid (5, 16,6, 50, 5 x 10 3, 5 x 10 5 of 5 x 10 7 kopieën) van een DNA-standaard controle-plasmide dat codeert voor de doelsequentie. Afgebeeld zijn de versterking percelen (A) en de standaard curve fit lijnen (B). R2, correlatiecoëfficiënt van primer-probe set. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: JUNV-celhechting assay betrouwbaar maatregelendeeltje attachment gebruik zo weinig als 20 PFU. Vero E6-cellen werden vooraf gebonden met bekende hoeveelheden JUNV C # 1 (2 x 10 1, 2 x 10 2, 2 x 10 3, 2 x 10 4, 2 x 10 5 of 2 x 10 6 PFU) gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. Ongebonden deeltjes werden verwijderd door wassen werden de cellen gelyseerd voor RNA-extractie en de resulterende RNA-monsters werden onderworpen aan qRT-PCR detecteren JUNV C # 1 S segment vRNA als maat deeltje bevestiging aan Vero E6-cellen. Gegevens stellen het gemiddelde aantal kopieën per putje van putjes in duplo ± SEM.
Figuur 4:. Kinetiek van JUNV C # 1 genoomreplicatie na infectie Vero E6-cellen werden geïncubeerd met 2 x 10 3 PFU JUNV C # 1 (MOI van 0,04) gedurende 1,5 uur bij 4 ° C. Na verscheidene wassingen in ijskoude PBS werden de cellen geoogst hetzij onmiddellijk (0 uur tijdstip)en verwarmd tot 37 ° C gedurende de aangegeven tijden voor verzameling. In elk geval werd totaal RNA geëxtraheerd uit cellen en onderworpen aan qRT-PCR detecteren JUNV C # 1 S segment vRNA. De waarden worden vermeld als gemiddelde kopieën per putje van putjes in duplo ± SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol beschrijven we is eenvoudig en robuust op voorwaarde dat de volgende kritische beschouwingen in acht worden genomen. Ten eerste moet een strikte pre-PCR-techniek worden toegepast (zie 28 voor een uitstekende beoordeling). Het is absoluut noodzakelijk dat alle reagentia en apparatuur zijn vrij van versterkte DNA dat de qPCR doelsequentie en dat er passende controles zijn om een dergelijke besmetting op te sporen. Ten tweede, voor het virus-celhechting deel van het protocol, het virus, cellen en media moeten bij 4 ° C worden gehouden om endocytose van het oppervlak gebonden virionen te voorkomen. Ten derde moet de hoeveelheid cellen verzameld voor RNA-extractie geval beperkt tot RNA bindingscapaciteit van het RNA zuivering filter. Ten vierde, gezuiverd viraal RNA monsters worden beschermd tegen ribonuclease-afhankelijke afbraak door het gebruik van nuclease-vrije reagentia en materialen en door ze op ijs indien ontdooid. Ten vijfde, het traject van de standaardcurve in de qPCR assay voldoende groteom alle geconstateerde waarden van de onbekende monsters te vangen. Zesde moeten technische replicaten worden opgenomen voor zowel de virus-celhechting deel van de test en de qPCR afzonderlijke RNA-monsters. Zevende controles (bv cellijnen die hTfR1 expressie of niet) kan worden opgenomen om te controleren voor de specificiteit van de assay. Tot slot moeten alle medewerkers de juiste bioveiligheid opleiding en institutionele goedkeuring te behandelen besmettelijke JUNV C # 1 of andere pathogene arenavirussen hebben.
De qPCR deel van het protocol vraagt om een qPCR probe in de eerste plaats om ervoor te zorgen de specificiteit van het product dat wordt versterkt tijdens elke fase van de PCR-reactie. De kosten van de test kunnen, door eliminatie van deze qPCR probe ten gunste van een andere qPCR chemie die geen probe vereist verlaagd echter (bijvoorbeeld het gebruik van de asymmetrische kleurstof SYBR Green I 25) en / of door het volume van de qPCR reactiemengsel gebruikt. Als een sonde-onafhankelijke qPCR appvoorn wordt gebruikt, het belangrijk is om te verifiëren dat de reactieomstandigheden stringent genoeg specificiteit van de qPCR primers waarborgen. Het is ook belangrijk om te weten dat arenavirus RNA, hetzij geëxtraheerd uit cellen of virions, kan niet-specifiek geprimede cDNA in de RT vormen in de afwezigheid van een virus-specifieke RT-primer 12. Daarom kopiëren nummers gedetecteerd met een vRNA-specifieke RT primer niet strikt weerspiegelen alleen de vRNA soorten die onder de RT-primer. Als specificiteit voor genoom of antigenoom nodig, we hebben een middel om dit fenomeen niet-specifieke priming omzeild door het gebruik van gebiotinyleerde primers en RT streptavidineparels 12 gemeld.
Een belangrijke kracht van deze test is de extreme gevoeligheid. Andere arenavirus-celhechting assays met radioactief gemerkte 22, 20 gebiotinyleerd of fluorescerend gemerkte 21 deeltjes vereist MOI van 0,2, 100 of 1000, respectievely. Hoewel het gebruik van radioactief-gemerkte deeltjes resulteert in goede gevoeligheid, is het noodzakelijk gebruik van radioactiviteit, die de logistieke complexiteit en veiligheidsaspecten waaraan deze specifieke assay verhoogt. De qPCR-gebaseerde hier beschreven methode vereist slechts 20 PFU (MOI van ~ 0,0004 in een 48-well plaat) en op betrouwbare bevestiging detecteert over een groot dynamisch bereik van MOI's (bijv MOI van 0,0004 tot tenminste 40) (figuur 3 ). De sterke gevoeligheid van deze assay is het mogelijk om lage MOI gebruiken voor meer nauwkeurige meting van productieve bindinggebeurtenissen door standaard infectieus virus. De hoge gevoeligheid vermindert aanzienlijk de hoeveelheid virus die nodig is voor de test en daarmee beperkt de aanvullende behandelingsstappen dat de kwaliteit van virions invloed kan worden gebruikt in de assay (bijvoorbeeld polyethyleenglycol gebaseerde precipitatie van virions, etikettering virions met fluoroforen of radioactieve isotopen en / of sucrose-banding van VIRIONS). Bovendien, de qPCR assay zelf is eenvoudig zo goed presteren als zeer nauwkeurig en reproduceerbaar.
De cel-hechting assay beschreven kan worden gewijzigd om additionele stadia van virale binnenkomst waaronder viraal deeltje endocytose en de laatste stap van virusfusie, dat afgifte van virale genoom in het cytoplasma te meten. Om deeltje endocytose te meten, zou dezelfde stappen van de bevestiging protocol worden gevolgd met stap 2,5, hetgeen hechting van deeltjes tot cellen bij 4 ° C. Cellen zou dan worden verwarmd om virusdeeltjes te endocytose, gevolgd door behandeling met een protease aan extern gebonden virionen die niet werden endocytose beschreven 22,24 strippen. De afdelingen 3 en 4 van dit protocol zou dan worden gevolgd om viraal RNA te extraheren en kwantificeren kopieën van viraal RNA genoom als een maat voor endocytose. Om genoom uncoating volgende fusie van virale en endosomale membranen te meten, zouden cellen worden vooraf gebonden metvirus bij 4 ° C, opgewarmd (tot endocytose en fusie mogelijk) en gestript externe deeltjes en vervolgens verzameld voor analyse. In één benadering kunnen cellen worden gelyseerd in een isotone buffer intracellulaire vesicles behouden, en vervolgens verdeeld in 2 fracties: een die zou worden behandeld met een cocktail van RNases (onbeklede viraal RNA is gevoelig voor afbraak) en de andere die niet zou 39 . Als alternatief kunnen de cellen worden gescheiden in cytosolische of endosomale fracties 40. In beide gevallen zou qRT-PCR worden gebruikt om virale genoom kwantificeren in het cytoplasma als maat voor virale genoom uncoating. Ten slotte kan de qRT-PCR-test eenvoudig worden aangepast om virusbinding, endocytose of fusie van andere virussen ontvangen de RT-PCR reagentia worden aangepast aan de nieuwe virus plaats te bestuderen (zie voor voorbeelden 24-27).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Markus Thali, Nathan Roy, Christopher Ziegler, Emily Bruce, en Benjamin King nuttige discussies en de National Institutes of Health voor de ondersteuning van deze studies door middel van subsidies T32 AI055402 (JK), R21 AI088059 (JB) en P20RR021905 (JB) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | 100x |
| HEPES Buffer Solution | Life Technologies | 15630-130 | 100x |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1x |
| Vero E6 cells | American Type Culture Collection | CRL-1586 | |
| Costar 48-well plate | Corning | 3548 | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | do not mix buffers RLT or RW1 with bleach |
| QIAshredder homogenizer | Qiagen | 79654 | |
| Taqman Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4326614 | |
| Multiscribe Reverse Transcriptase (50U/µl) | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP Mixture (10 mM; 2.5 mM each dNTP) | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR Buffer II and 25 mM MgCl2 solution | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase Inhibitor (5000U/100 µl) | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT primer 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ |
Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA oligo | standard desalting |
| Forward qPCR primer 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| Reverse qPCR primer 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | standard desalting |
| TaqMan Probe 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC purified |
| MicroAmp Fast Optical 96-well reaction plate (0.1 mL) | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4376598 | or other qPCR instrument |
References
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L.
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50. Fields Virology. Knipe, D. M. 2, Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. 1791-1827 (2007).
- Parodi, A. S., et al. Sobre la etiologia del brote epidemico de Junin (Nota previa). Dia Medico. 30, (1958).
- Frame, J. D., Baldwin, J. M., Gocke, D. J., Troup, J. M. Lassa fever, a new virus disease of man from West Africa. I. Clinical description and pathological findings. Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 670-676 (1970).
- Buchmeier, M. J., Zajac, A. J. Lymphocytic Choriomenigitis Virus. , John Wiley & Sons Ltd. (1999).
- Barton, L. L., Mets, M. B., Beauchamp, C. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: emerging fetal teratogen. Am. J. Obstet. Gynecol. 187, 1715-1716 (2002).
- Fischer, S. A., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. N. Engl. J. Med. 354, 2235-2249 (2006).
- Palacios, G., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. N. Engl. J. Med. 358, 991-998 (2008).
- Meyer, B. J., de la Torre, J. C., Southern, P. J. Arenaviruses: genomic RNAs, transcription, and replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 139-157 (2002).
- Meyer, B. J., Southern, P. J. Sequence heterogeneity in the termini of lymphocytic choriomeningitis virus genomic and antigenomic RNAs. J. Virol. 68, 7659-7664 (1994).
- Haist, K., Ziegler, C., Botten, J. Strand-Specific Quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction Assay for Measurement of Arenavirus Genomic and Antigenomic RNAs. PLoS One. 10, e0120043 (2015).
- Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446, 92-96 (2007).
- Martinez, M. G., et al. Utilization of human DC-SIGN and L-SIGN for entry and infection of host cells by the New World arenavirus, Junin virus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 441, 612-617 (2013).
- Martinez, M. G., Cordo, S. M., Candurra, N. A.
- Martinez, M. G., Forlenza, M. B., Candurra, N. A. Involvement of cellular proteins in Junin arenavirus entry. Biotechnol J. 4, 866-870 (2009).
- Nunberg, J. H., York, J. The Curious Case of Arenavirus Entry, and Its Inhibition. Viruses. 4, 83-101 (2012).
- Botten, J., King, B., Klaus, J., Zielger, C. Viral Hemorrhagic Fevers. , CRC Press. 233-260 (2013).
- Klaus, J. P., et al. The intracellular cargo receptor ERGIC-53 is required for the production of infectious arenavirus, coronavirus, and filovirus particles. Cell Host Microbe. 14, 522-534 (2013).
- Rojek, J. M., Perez, M., Kunz, S. Cellular entry of lymphocytic choriomeningitis virus. J. Virol. 82, 1505-1517 (2008).
- Lavanya, M., Cuevas, C. D., Thomas, M., Cherry, S., Ross, S. R. siRNA screen for genes that affect Junin virus entry uncovers voltage-gated calcium channels as a therapeutic target. Sci Transl Med. 5, 204ra131 (2013).
- Ellenberg, P., Edreira, M., Scolaro, L. Resistance to superinfection of Vero cells persistently infected with Junin virus. Arch. Virol. 149, 507-522 (2004).
- Brandenburg, B., et al. Imaging poliovirus entry in live cells. PLoS Biol. 5, e183 (2007).
- Petersen, J., et al. The Major Cellular Sterol Regulatory Pathway Is Required for Andes Virus Infection. PLoS pathogens. 10, e1003911 (2014).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Israelsson, S., Lindberg, A. M. A rapid and efficient method for studies of virus interaction at the host cell surface using enteroviruses and real-time PCR. Virol J. 6, 217 (2009).
- Jiang, J., et al. Hepatitis C virus attachment mediated by apolipoprotein E binding to cell surface heparan sulfate. J. Virol. 86, 7256-7267 (2012).
- Shannon-Lowe, C., et al. Epstein-Barr virus-induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth. J. Gen. Virol. 86, 3009-3019 (2005).
- Mifflin, T. E. Setting up a PCR laboratory. CSH Protoc. 2007, pdb top14 (2007).
- Maiztegui, J. I., et al. Protective efficacy of a live attenuated vaccine against Argentine hemorrhagic fever. AHF Study Group. J. Infect. Dis. 177, 277-283 (1998).
- Goni, S. E., et al. Genomic features of attenuated Junin virus vaccine strain candidate. Virus Genes. 32, 37-41 (2006).
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Centers for Disease Control and Prevention (U.S.). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. (2009).
- White, J., Matlin, K., Helenius, A. Cell fusion by Semliki Forest, influenza, and vesicular stomatitis viruses. J. Cell Biol. 89, 674-679 (1981).
- McGraw, T. E., Greenfield, L., Maxfield, F. R. Functional expression of the human transferrin receptor cDNA in Chinese hamster ovary cells deficient in endogenous transferrin receptor. J. Cell Biol. 105, 207-214 (1987).
- Borrow, P., Oldstone, M. B. Characterization of lymphocytic choriomeningitis virus-binding protein(s): a candidate cellular receptor for the virus. J. Virol. 66, 7270-7281 (1992).
- Rojek, J. M., Spiropoulou, C. F., Kunz, S. Characterization of the cellular receptors for the South American hemorrhagic fever viruses Junin, Guanarito, and Machupo. 346. , 476-491 (2006).
- Helguera, G., et al. An antibody recognizing the apical domain of human transferrin receptor 1 efficiently inhibits the entry of all new world hemorrhagic Fever arenaviruses. J. Virol. 86, 4024-4028 (2012).
- Sanchez, A., et al. Junin virus monoclonal antibodies: characterization and cross-reactivity with other arenaviruses. J. Gen. Virol. 70, 1125-1132 (1989).
- Trombley, A. R., et al. Comprehensive panel of real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for detection and absolute quantification of filoviruses, arenaviruses, and New World hantaviruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 82, 954-960 (2010).
- Helenius, A., Marsh, M., White, J. Inhibition of Semliki forest virus penetration by lysosomotropic weak bases. J. Gen. Virol. 58 (Pt 1), 47-61 (1982).
- Nour, A. M., Li, Y., Wolenski, J., Modis, Y. Viral membrane fusion and nucleocapsid delivery into the cytoplasm are distinct events in some flaviviruses. PLoS pathogens. 9, e1003585 (2013).
