Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Sex Verschillen in Mouse hippocampus Astrocytes na Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

Astrocyten een van de belangrijkste belangrijkste spelers in het centrale zenuwstelsel (CNS). Hier worden we melding van een praktische methode van gesekst hippocampus astrocyten cultuur protocol om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de astrocyt functie in de mannelijke en vrouwelijke pasgeboren pups na in-vitro ischemie te bestuderen.

Abstract

Astrogliosis na hypoxie / ischemie (HI) -gerelateerde hersenletsel speelt een rol bij verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij pasgeborenen. Recente klinische studies geven aan dat de ernst van hersenletsel lijken geslacht afhankelijk zijn, en dat de mannelijke pasgeborenen zijn vatbaarder voor de effecten van HI-gerelateerde hersenletsel, hetgeen leidt tot ernstige neurologische gevolgen dan bij vrouwen met vergelijkbare hersenletsel. De ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en te onderhouden sterk verrijkte populaties gesekst hippocampus astrocyten is essentieel voor de cellulaire basis van geslacht verschillen in de pathologische gevolgen van neonatale HI begrijpen. In deze studie beschrijven we een methode waarbij seksespecifieke hippocampale astrocyt culturen die zijn onderworpen aan een model van in vitro ischemie, zuurstof glucose ontbering, gevolgd door reoxygenatie. Latere reactieve astrogliosis werd onderzocht door immunostaining voor de Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en S100B. Deze methode verschaft een bruikbaar instrument om de rol van mannelijke en vrouwelijke hippocampus astrocyten na neonatale HI bestuderen afzonderlijk.

Introduction

Astrocyten een van de belangrijkste belangrijkste spelers in het centrale zenuwstelsel (CNS). Groeiende hoeveelheid bewijsmateriaal wijst erop dat de rol van de astrocyten zijn meer dan het verstrekken van neuronale ondersteuning. In feite kan de rol van astrocyten onder fysiologische omstandigheden zeer complex zijn, zoals geleiden van de migratie van de ontwikkeling axonen 1, reguleren CNS bloedstroom 2, de pH homeostase van de synaptische interstitiële vloeistof 3, en die aan de bloedhersenbarrière 4 en 5 synaptische transmissie. Onder pathologische omstandigheden, astrocyten reageren op verwonding met een proces genaamd reactieve astrogliose waarbij de morfologie, aantal, plaats, topografie (ten opzichte afstand van lozing) en functie van de astrocyten kan veranderen in een heterogene wijze 6,7. Astrogliosis waargenomen na neonatale hypoxische ischemische encefalopathie misschien bijdragen tot de morbiditeit en mortaliteit van neonaten

Recente klinische en experimentele studies geven aan dat de ernst van hersenletsel blijkt sex-afhankelijke zijn en dat de mannelijke pasgeborenen zijn vatbaarder voor de effecten van hypoxie / ischemie (HI) -gerelateerde hersenletsel, hetgeen leidt tot ernstige neurologische resultaten in vergelijking met vrouwen met vergelijkbare hersenletsel 9-11. Hoewel de lokalisatie van het letsel is afhankelijk van de zwangerschapsduur en de duur en de ernst van de belediging, hippocampus is een van de meest bewerkstelligd gebieden in het CNS na term neonatale HI en verhoogde hippocampale astrogliosis is bevestigd door opregulatie van de Glial Fibrillaire zuur eiwit (GFAP) 3 d na de neonatale HI 7,10,12,13. Sekseverschillen in de astrocyt functie werden getoond in zowel pasgeborenen en volwassenen knaagdieren na cerebrale ischemie 14,15. Bovendien mannelijke astrocytic gevoeligheid voor in vitro ischemie werd aangetoond door verhoogde cell overlijden in vergelijking met vrouwelijke corticale astrocyten in de cultuur 16.

Sekseverschillen starten in de baarmoeder en gaan door tot de dood 17. In het afgelopen decennium is het belang van het opnemen van de seksen in experimentele omstandigheden in celcultuur en in-vivo studies hebben de nadruk van het Institute of Medicine en de NIH om fundamentele kennis te zoeken in de sekseverschillen gezien in fysiologische en pathologische omstandigheden 17,18 . Ontwikkeling van betrouwbare methoden voor het isoleren en populaties gesekst hippocampus astrocyten behouden is essentieel voor de cellulaire basis van geslacht verschillen in de pathologische gevolgen van neonatale HI begrijpen. De huidige studie werd ontworpen om de technieken te verstrekken aan verrijkte seksespecifieke hippocampus astrocyten culturen van pasgeboren muizen te bereiden met het oog op de rol van GFAP-immunoreactieve astrocyten volgende Oxygen / Glucose beroving (OGD) en reoxygenatie (Reox), het induceren beoordelenHI in celcultuur omgeving. Deze techniek kan worden gebruikt om een ​​hypothese met betrekking tot de hippocampus astrocyten neonatale mannen en vrouwen onder normoxische en ischemische aandoeningen testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbeveling van de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren van het National Institute of Health. Het dier protocol werd goedgekeurd door de Universiteit van Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care en gebruik Comite. Primaire Astrocyte Cultuur protocol dat hier wordt gepresenteerd is overgenomen uit de door Zhang Y 19 et al., En Cengiz P 20 et al protocollen. Met enkele wijzigingen.

1. hippocampus Dissection en Astrocyte Cultuur

  1. Bereid alle benodigde reagentia en materialen, waaronder chirurgische schaar, gladde fijne tang, platte tip tang, papieren handdoeken, afvalzak, 70% ethanol en 2 ontleden gerechten (3,5 cm diameter) op ijs gevuld met 2 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) elk . Zorg ervoor dat de chirurgische apparatuur zijn steriele (autoclaaf) voorafgaand aan de procedure en gebruik maken van alle andere materialen (Astrocyte plating medium: DMEM + 5% paard serum +1% penicilline-streptomycine, paardenserum, HBSS, 0,25% trypsine, dekglaasjes, petrischaaltjes, 15/50 ml buizen, T25 flessen, etc.) als pre-steriel.
  2. Zachtjes te houden en spuit het hoofd en de nek van de muis pup met 70% ethanol en onthoofden met een scherpe steriele schaar [Figuur 1 (1)].
  3. Voer een middellijn incisie van posterior naar anterior schedel met een klein schaartje langs de hoofdhuid naar de hersenen [Figuur 1 (2-3)] bloot te leggen.
  4. Snijd de schedel voorzichtig uit de nek naar de neus met een klein schaartje. Snijd vervolgens schedel anterior aan de olfactorische bollen en inferieur aan de kleine hersenen met de schedel van de schedelbasis verbreken.
  5. Voeg een kleine incisie aan de basis van de schedel en gesneden langs de middellijn. Gebruik steriele flat-tip tang om afpellen van de schedel. Verwijder de hersenstam met behulp van een gebogen pincet. Verwijder hersenen uit de schedel en plaats in de eerste ontleden schotel [Figuur 1 (4-9)] 21.
  6. Met behulp van een gebogen pincet, flip de hersenen, zodat het ventrale oppervlak van de hersenen naar boven en dan scheiden beide hemisferen met een scherpe steriele chirurgische mes [Figuur 1 (10,11)]
  7. Trek de hersenhelften en verwijder voorzichtig de uitpuilende middenhersenen en de thalamus weefsel met een steriele flat gebogen tang om de hippocampus, een kleine, zeepaardje-vormige structuur in de mediale temporale kwab [Figuur 1 (12-14)] onthullen.
  8. Verwijder zowel de hippocampus lobben [Figuur 1 (15,16)] en zorgvuldig ontleden de hersenvliezen van de lobben door te trekken met de fijne pincet. Deze stap voorkomt vervuiling van de finale astrocyten cultuur door het meningeale cellen en fibroblasten.
  9. Breng de voorbereide hippocampus lobben in de tweede schotel gevuld met HBSS en terug te sturen op ijs [Figuur 1 (17,18)]. Pool zowel hippocampus lobben van een enkele muis (P0 - P2) voor de bereiding van hippoCampal astrocyt culturen. Dit geeft de astrocyt juiste dichtheid. Mince hippocampus lobben met een scherp steriel chirurgisch mes (ongeveer 4 keer).
  10. Aspireren van HBSS schotel met een steriel uiteinde bevestigd aan een 1 ml pipet en voeg 3 ml 0,25% trypsine, mengen, overbrengen naar een 15 ml steriele conische buis en incubeer het weefsel bij 37 ° C gedurende 20 minuten onder zacht schudden.
  11. Centrifugebuis bij 300 g gedurende 5 min. Zuig supernatant voorzichtig met een steriele glazen pipet verbonden met een vacuüm lijn. Voeg 10 ml astrocyten plating medium en vermaal (20 - 30 maal) met behulp van een brand gepolijst glas pipet totdat stukken weefsel te homogeniseren.
  12. Centrifugebuis bij 300 g gedurende 5 min. Zuig supernatant en voeg 2 ml vers voorverwarmde astrocyten plating media. Passeren cellen door een 70 urn zeef (cel zeef) in een nieuwe 50 ml conische buis.
  13. Plaat gehele celsuspensie op een Poly-D-Lysine / laminine beklede steriele T25 kolf met 3 mlastrocyt uitplaatmedia, dan incubeer de kolf bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator.
  14. Zuig gehele media op dag- i n-vitro (DIV) 1, 3 en DIV DIV 7, en te vervangen door 2 ml vers astrocyten plating media. Let op de progressie en astrocytaire samenloop onder lichtmicroscoop elke keer bij het vervangen van de astrocyten plating media.
    OPMERKING: Bij DIV 1, alle levensvatbare astrocyten aan het oppervlak van de kweekfles en de dode of stervende cellen die omvatten neuronen drijven in de supernatant. Bij DIV 3, de aangehechte cellen beginnen te verdelen astrocytaire cellaag vormen. Aangezien het ondersteunende omstandigheden cultuur vrijwel verstoken van elke neuronale groei. Bij DIV 7, astrocyten laag ongeveer 80-90% confluent en enkele microglia en oligodendrocyt voorloper cellen aanwezig zijn bovenop de astrocytaire laag.
  15. Zuig de beplating medium uit de fles, voeg 2 ml vers voorverwarmde astrocyten plating medium, spoel eennd verwijderen opnieuw bij DIV 11, toen astrocyten zijn confluent en klaar voor sub kweken.
  16. Voeg 2 ml 0,25% trypsine, zachtjes draaien de kolf een paar keer en zuig trypsine met behulp van een steriele glazen pipet.
  17. Voeg 2 ml 0,25% trypsine en laat de kolf zitten in de weefselkweek kap voor 4-5 min bij RT.
  18. Verwijder de trypsine en houd de kolf bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 10 minuten. Voeg 5 ml voorverwarmde astrocyten plating medium en maak de astrocytaire laag door de kolf tegen de palm van je hand te tikken (3-4 keer), gevolgd door zachte tritureren om volledige onthechting te bereiken en het verzamelen van de astrocyten in een 15 ml conische buis.
  19. Centrifugebuis bij 300 g gedurende 5 minuten, zuig de supernatant en voeg 1 ml vers medium astrocyt plating.
  20. Voeg 10 ul van de celsuspensie een hemocytometer en tel de cellen in de grote centrale gerasterde oppervlak (1 mm 2) met een omgekeerde fase contrast microscoop (10X objectief). Multiply met 10 4 tot het aantal cellen per ml schatten. Een T25 fles zal opleveren ~ 1 x 10 6 totaal gescheiden cellen. Zaad ~ 1 x 10 5 cellen in 2 ml medium astrocyten plateren op een 12 mm diameter poly-D-lysine vooraf beklede glazen dekglaasje in de put van een 24-well kweekplaat.
  21. Incubeer bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator. Voer OGD / Reox bij DIV 12-14 (deel 2).
  22. Behandel de astrocyten kweken bij DIV 3 met 5 mM L-leucine Methyl Ester (LME) hydrochloride tot DIV 11 als de hippocampus culturen verstoken van microglia gewenst zijn. Na LME incubatie onderworpen aan kweken onder schudden (300 rpm gedurende 1 h) verwijderen verontreinigende microglia.
    OPMERKING: LME een microgliale cytotoxisch middel die uitgebreid is gebruikt als een werkwijze te elimineren prolifererende microglia 22.

2. OGD / Reox Treatment

  1. Aspireren media van dekglaasje met aanhangend astrocyten cultuur (DIV 12-14) en spoel 3 keerdoor voorzichtig draaien van de 24-well kweekplaat met het dekglaasje een paar keer met 1 ml isotone OGD oplossing (pH 7,4) bevattende (in mM): 0 glucose, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2PO 4, 1,27 CaCl2 en 0,81 MgSO4.
  2. Voeg 0,2 ml OGD oplossing goed op het dekglaasje te bedekken en incubeer gedurende 2 uur in een hypoxische incubator met 94% N2, 1% O2 en 5% CO2. Meng met een rondschudapparaat (50 rpm) voor de eerste 30 minuten van hypoxie om de gasuitwisseling te bevorderen.
  3. Incubeer normoxische controlecellen gedurende 2 h in 5% CO2 en atmosferische lucht in een buffer identiek aan de OGD oplossing behalve de toevoeging van 5,5 mM glucose.
  4. Voor Reox, aspireren OGD-oplossing en voeg 2 ml astrocyten plating medium. Incuberen in 5% CO2 en atmosferische lucht bij 37 ° C gedurende 5 uur.

3. Immunocytochemisch kleuring </ P>

  1. Zuig het kweekmedium met een steriele glazen pipet bevestigd aan een vacuümleiding en snel spoel dekglaasje eenmaal door toevoeging van 1 ml 0,1 M Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) naar de bron. Aspireren en voeg 2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Aspireren en voeg 1 ml van 0,1 M TBS en plaats op een schommelende schudder gedurende 2 min. Herhaal dit 3 keer. Voeg 1 ml blokkeeroplossing (10% geit serum, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 in 0,1 M TBS) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C op een rocking shaker.
  3. Aspireren blokkeeroplossing en voeg primair monoklonaal anti-GFAP-antilichaam (0,2 ml van een 1: 500 verdunning in blokkeeroplossing) en konijn polyklonaal anti-S100B (1: 500) of konijn polyklonaal anti-HIF1α (1: 200) gedurende 60 min bij 37 ° C op een rocking shaker.
  4. Alternatief zijn enkele astrocyten geïncubeerd met konijn polyklonaal anti-IBA1 (1: 200) en muis maaoclonal anti-MAP2 op toegang tot cultuur zuiverheid.
  5. Zuig primair antilichaam en spoel dekglaasje door het toevoegen van 1 ml 0,1 M TBS en het in een rockende shaker gedurende 2 minuten en vervolgens aspireren. Herhaal dit twee keer.
  6. Voeg 0,2 ml van een 1: 200 verdunning van het secundaire geit anti-konijn-488 geconjugeerd anti-muis 568-geconjugeerde antilichamen in blokkeeroplossing gedurende 60 minuten bij 37 ° C op een rocking shaker.
  7. Zuig secundair antilichaam en spoel dekglaasje door het toevoegen van 1 ml 0,1 M TBS en leg ze op een rockende shaker gedurende 2 minuten en vervolgens aspireren. Herhaal dit twee keer.
  8. Verwijder dekglaasje uit goed en droog door het plaatsen op een dia geplaatst op een dia-droger. Mount dekglaasje op een nieuwe dia door het omkeren op een enkele druppel Vectashield hardset montage medium met DAPI (1,5 ng / ul).
  9. Afbeelding dekglaasjes op een confocale microscoop met behulp van 20x droog of 60X olie doelstelling. Acquire beelden (512 x 512) voor DAPI (405 nm ex / 450 nm em) en fluorochroom 488 tag GFAP antilichaam (488 nm ex / 515 nmem). Houd acquisitie parameters constant binnen de 20X en 60X groepen.

4. Geslacht Bepaling Met behulp van PCR

  1. Warmte pup teen of vinger teennagelknipsels bij 95 ° C gedurende 45 min in 50 mM NaOH en geneutraliseerd met een gelijk volume 1 M Tris, pH 6,8.
  2. Voeg 1 ul van de geëxtraheerde DNA-oplossing aan 19 ul van het volgende mengsel: 5 pmol primers voor Myog en Sry genen, 1 x reactiebuffer, 0,2 mM elk deoxynucleotide en 8 U Taq polymerase.
  3. Gebruik primers sequenties; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' en Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Voer de volgende PCR-protocol: 95 ° C gedurende 3 min daarna 30 cycli van denaturatie bij 95 ° C gedurende 15 s, hybridisatie bij 58 ° C gedurende 15 s en verlenging bij 72 ° C gedurende 1 min. Na deze 30 cycli, de reactie een afsluitend 72 ° C verlenging gedurende 1 min.
  5. aparte PCR elektroforetisch producten op ethidiumbromide-bevattende 2% agarosegel en zichtbaar onder UV-belichting. (Figuur 2A.) LET OP! Ethidiumbromide is een potentieel kankerverwekkend is en moet zorgvuldig worden behandeld en afgevoerd volgens de geldende voorschriften instelling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Inzicht in de rol van gesekst astrocyten functies onder fysiologische of pathofysiologische omstandigheden zijn enorm opgehelderd door het kweken van deze cellen onder in vitro omstandigheden. Het belangrijke aspect van het uitvoeren gesekst kweken is het geslacht van de muis pup vaststellen vóór het gebruik. We bepaalden het geslacht van de muis genetisch door PCR en door visuele inspectie (figuur 2) 16. De methodologie van geslachtsbepaling met behulp van PCR werd met modificaties uit McClive en Sinclair aangenomen, is snel, eenvoudig en zeer reproduceerbare methode 23. Figuur 2A toont de representatieve resultaten van geslachtsbepaling met behulp van PCR. PCR-producten werden gegenereerd met DNA geëxtraheerd uit twee representatieve P1 mannelijke en vrouwelijke staart knipt. De reactie omvat multiplex primerparen voor Sry en Myog genen die mannelijke specifieke banden van 441 bp en vrouwelijke SPECIF genererenic banden van 245 bp, respectievelijk. Visuele bepaling van neonatale (P 1-3) muis sex met blote oog werd vastgesteld door te kijken naar de aanwezigheid van kleine Darkened plek tussen anogenitale openingen uitsluitend bij mannen (figuur 2B) 16,24.

Hoewel kweken van astrocyten is handig en relatief gemakkelijk vaststellen onder laboratoriumopstelling, kan dit voordeel worden belemmerd door de verontreiniging voornamelijk microglia met of neuronen in mindere mate. Verontreiniging van de astrocyten kan gemakkelijk worden bepaald door immunokleuring van de gekweekte cellen met cel-specifieke markers voor zowel microglia (IBA1) neuronen (MAP2). In de onderhavige studie werden hippocampus astrocyten groeien in primaire monolaagkweken waargenomen ~ 6% verontreinigende microglia ten DIV 14, zoals voorgesteld door enkele cellen die IBA1 (figuur 3) uitgedrukt. Integendeel, geen van de cellen bleken MAP2 expressie suggererende kweek was totaal verstoken van elke neuronale verontreinigingen (figuur 3). De minor microgliale verontreiniging waargenomen in onze kweken is overeenkomstig andere verslagen, waarbij de auteurs rapporteerden een 5% microgliale besmetting in hun primaire corticale kweken afkomstig astrocyten 1-3 dagen oude pups muis 25. Astrocytes beschikken over een specifiek cytoarchitecture die hen in staat stellen om te reageren op veranderingen in hun micro-omgeving, waaronder hypoxie. Om elke sekse specifieke astrocytic response in-vitro ischemie kunnen bepalen werden onderworpen gesekst hippocampus astrocyten tot OGD / Reox. Succesvolle inductie van OGD / Reox werd bepaald door de verhoogde nucleaire expressie van hypoxie induceerbare factor 1 alfa (HIF1α waargenomen in GFAP + astrocyten onderworpen aan 2 uur OGD vervolgens 5 h Reox vergelijking met de HIF1α expressies in cellen onder normoxische omstandigheden (figuur 4 ).

(Figuur 5). GFAP en S100B werden colocalized in het cytoplasma en cellichamen van astrocyten, het karakteriseren van een gerijpte astrocytaire ontwikkelingsstadium waarin deze cellen hebben de neiging om hun neurale stamcel (NSC) potentiële 26 verliezen. De morfologie en dichtheid van GFAP of S100B immunoreactiviteiten waren vergelijkbaar in zowel mannelijke als vrouwelijke astrocyt culturen zoals waargenomen in hun normoxische en OGD / Reox behandelingsgroepen. Onder normoxische omstandigheden, de hippocampus astrocyten presenteerde een veelhoekige om fusiform en platte morfologie [Figuur 5A, B (normoxie 60X; pijl)], zoals geëvalueerd met behulp van confocale microscopie. Deze cellen konden splitsen tot samenvloeiing gedurende ongeveer 2 weken voorafgaand aan de inductie van OGD / Reox. Na 2 uur OGD en 5 h Reox, astrocyten tentoongesteld klassieke Reactive astrocyten morfologie weergave teruggetrokken primaire processen, hypertrofie van de soma en processen, en verhoogde expressie van GFAP of S100B [Figuur 5A, B (OGD / Reox, 60X; pijlpunt)]. Na de OGD / Reox de GFAP / S100B kleuring vertoonde ook een uitgebreide maaswerk uitstrekt over het cytoplasma in zowel de mannelijke als vrouwelijke hippocampus astrocyten. Weinig GFAP kleuring waargenomen in de gekweekte hippocampale astrocyten van GFAP null muizen dienden als negatieve controle (Figuur 5B, bijvoegsel). De bovenstaande resultaten geven direct bewijs dat de morfologie van GFAP / S100B-immunoreactieve astrocyten significante veranderingen ondergaat bij onderwerping aan OGD-Reox.

Figuur 1
Figuur 1. Illustraties van de hippocampus Removal Techniek van P1 Mice. 1. Onthoofden pup naar het hoofd te verwijderen.2, 3. Met behulp van fijne schaar, maak een middellijn incisie van de huid, posterior naar anterior en afpellen van de huid met behulp van een platte tip tang. 4, 5, 6. Voeg een kleine incisie aan de basis van de schedel. Snijd de schedel over de middellijn en afpellen twee helften naar de hersenen bloot. 7, 8. Verwijder cerebellum met behulp van een gebogen pincet. 9. Verwijder voorzichtig de hersenen uit de schedel en plaats in een steriele petrischaal. 10, 11. Flip de hersenen, zodat het ventrale oppervlak van de hersenen naar boven met behulp van een gebogen pincet, dan scheiden beide hersenhelften met een scherpe steriele chirurgische mes. 12, 13, 14. Verwijder de uitpuilende middenhersenen en de thalamus weefsel verlaten van het intact onderliggende halfrond en het openbaren van de hippocampus. 15, 16. Verwijder de hippocampus (kleine C-vormige structuur). 17, 18. Meteen zet de hippocampus kwabben verkregen van zowel de hemisferen in een aparte petrischaal met steriele HBSS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Sex Bepaling van pasgeboren muizen. A. Muis sex genetisch werd bepaald door PCR met primers specifiek voor de Myog (X-chromosoom) en Sry (Y chromosoom) genen in het DNA geëxtraheerd uit de vinger of teen clippings (F 1, 1 M). De banden van PCR werden gevisualiseerd op een 2% agarosegel met ethidiumbromide onder ultraviolet licht. F 2 en M 2 dienden als positieve controles voor vrouwelijke en mannelijke, resp. B. Visuele bepaling van de man uit vrouwen werd opgericht door het identificeren van een donkere plek tussen de anogenitale openingen (pijl).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. De zuiverheid van de primaire Mouse hippocampus Astrocyte Cultuur. Immunokleuring van astrocyten cultuur met neuronale marker MAP2 (rood) en microglia marker IBA1 (groen). Kernen zijn gekleurd met 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blauw). Pijl geeft microglia besmetting. Schaal bar:. 50 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. HIF1α Expression Was Ingevouwen in gekweekte Hippocampal Astrocytes blootgesteld aan OGD / Reox. Vertegenwoordiger immunofluorescentie beelden die GFAP (rood) en HIF1α (groen) etikettering in astrocyten onderworpen aan (A) normoxie of (B) OGD (2 h) / Reox (5 h). Kernen zijn gekleurd met 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blauw). Pijl, lage HIF1α meningsuiting; pijlpunt, verhoogde HIF1α nucleaire expressie. Schaal bar:. 25 pm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 5
Figuur 5. Up-regulatie van S100B of GFAP expressie in de hippocampus Sexed Astrocyte Cultures volgende OGD-Reox. Sexed gekweekte hippocampus astrocyten werden gekleurd voor S110b of GFAP expressie onder normoxische omstandigheden of na 2h OGD vervolgens 5 h Reox (OGD / Reox). Inzet: 60X beeld van de hippocampus astrocyten gekweekt uit GFAP null muizen. Schaal bar: 30 micrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met het oog op de sekseverschillen in de eigenschappen en de functie van astrocyten onder fysiologische en pathologische omstandigheden te bestuderen, de voorbereiding van gesekst primaire astrocyten in celkweek is een belangrijk instrument om te gebruiken. In de huidige studie rapporteren we een zeer efficiënte en een reproduceerbare methode om de cultuur van een sterk verrijkt homogene populatie van gesekst hippocampus astrocyten van pasgeboren (P0-P2) C57BL / 6 (wild type) of K19F (GFAP null) muis pups in-vitro. Vaststelling van deze methode helpt de onderzoekers inzicht in de fysiologische en pathologische functies van gesekst hippocampus astrocyten na in-vitro ischemie.

Er zijn twee belangrijke stappen bij het vaststellen van deze methode waaronder het handhaven van steriliteit en verteerd is hippocampale lobben tijdens behandeling met trypsine gevolgd door trituratie van het gedigereerde weefsel om de enkele celsuspensie te verkrijgen. Preventie van primaire astrocyten uithet krijgen van besmet is een van de grootste uitdagingen in de hele cultuur proces. Bacteriële en / of schimmels zijn twee veel voorkomende vormen van vervuiling die de gekweekte cellen onbruikbaar kan maken als de juiste zorg niet wordt aangenomen, terwijl het uitvoeren van de techniek. Dus om experimentele succes te garanderen, is het noodzakelijk om de werkwijze onder steriele werkomgeving die ook uitvoeren desinfecteren de werkplek voor gebruik, met steriele chirurgische apparatuur en materialen contact van steriele materialen met steriel oppervlak te voorkomen met behulp van een laminaire stroming kap en te voorkomen dat het nemen van niet-afgetopte cultuur kolven uit de laminaire kap. Bovendien, tijdens enzymatische dissociatie, langere incubatie van de hippocampus weefsel met trypsine gevolgd door uitgebreide fysieke wrijven kan leiden tot haar over-vertering resulteert in een slechte levensvatbaarheid van de cellen en inefficiënt bevestiging van gescheiden cellen aan cultuur kolven.

Integendeel, underdigestion van het hersenweefsel onvoldoendedissociatie van glia cellen hetgeen leidt tot een slechte opbrengst en zaaien van cellen als grote massa. Teneinde gezonde astrocyt culturen te verkrijgen, is het noodzakelijk te optimaliseren trypsine concentratie, incubatietijd en trituratie optimale vertering van de hippocampus weefsel bereiken. In onze handen, incubatie van hippocampale lobben met de werking concentratie van 0,25% trypsine gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door voorzichtig trituratie van 20-30 maal leverde sterk hechtende, gezonde en zeer reproduceerbaar astrocyt culturen. Ook herhaaldelijk bevriezen en ontdooien van reagentia vóór elke keer gebruiken kunnen hun effectiviteit verminderen. Daarom is het erg belangrijk om aliquot reagentia in kleine hoeveelheden en gewenste bevriezen. Voorbeeld: sla trypsine, penicilline / streptomycine en 5 ml porties en foetaal runderserum en 50 ml porties in verschillende steriele conische buisjes bij -20 ° C tot gebruik. Wij raden u af om antibiotica te gebruiken na de vervaldatum.

GFAP is awell gekarakteriseerd marker van reactieve vezelige astrocyten. Na OGD / Reox, opregulatie van GFAP expressie in reactie op reactieve astrogliosis gerapporteerd 20. Hoewel is voorgesteld dat overexpressie GFAP 27 zijn rol in hippocampale schade kan worden gebruikt als doelwit voor specifieke neuronale herstelstrategieën na HI bij pasgeborenen is nog onduidelijk. Immunohistochemische kleuring van astrocyten met GFAP stelt ons in staat om deze cellen te identificeren en te karakteriseren onder de fysiologische en pathologische omstandigheden. GFAP kleuring zoals elke andere marker heeft een aantal beperkingen die moeten worden erkend. Een van de beperkingen van de GFAP kleuring van astrocyten is dat niet alle astrocyten tot expressie GFAP onder fysiologische omstandigheden. Vooral de onvolgroeide astrocyten expressie tarief van GFAP niet meer dan 40% onder fysiologische omstandigheden 28. Afhankelijk van de leeftijd en het type-specifieke gebruik van astrocyten, kunnen ook andere markers van de keuze worden beschouwd, zoals GLAST, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 en S100B 29.

Bovendien aanwezigheid van NSCs vermomd als astrocyten in primaire kweken kan niet worden uitgesloten. Deze NSC is aangetoond dat fenotypische en ultrastructurele kenmerken bezitten soortgelijke astrocyten en het uiten van GFAP rijpen. Daarom is de identificatie van moleculaire merkers die specifiek zijn voor volledig gedifferentieerde en gerijpt astrocyten zijn is een must. Astrocyten werd gemeld dat expressie S100B hun later volledig gedifferentieerde ontwikkelingsstadia. Recent is gerapporteerd dat neonatale corticale GFAP + astrocyten verliezen hun voorlopercellen stamcellen potentieel met het begin van S100B expressie gebeuren rond DIV 15 26. Ook in onze kweekomstandigheden in DIV 14, 91% van GFAP tot expressie brengende cellen bleken coexpress S100B, die suggereren dat de cultures bestaan ​​uit hoofdzakelijk terminaal gedifferentieerde volwassen hippocampus astrocyten.

Het is bijna onmogelijk om zuivere primaire hippocampale astrocyt culturen totaal verstoken van contaminerende microgliale cellen die boven en onder de astrocyten monolaag bevinden verkrijgen. Daarom is het belangrijk om de hoeveelheid verontreinigende microglia in astroglial culturen, en om deze verhouding zo laag mogelijk te houden kennen. In de huidige studie in lood we astrocyt culturen met microglia specifieke marker IBA1 of neuronale marker MAP2 met het oog op de eventuele aanwezigheid van microglia of neuronen als potentiële verontreinigingen vast te stellen. Het aandeel van microglia in knaagdieren astrocyten kweek kan variëren van 1% tot 30% afhankelijk van verschillende factoren die dierlijke leeftijd, soort, gebied, kweekmedium, subcultuur werkwijze en schudden 30 omvatten. In onze culturen zagen we ongeveer 6% van microgliale verontreiniging die vergelijkbaar is met andere verslagen 25. Wanneer het beoogde gebruik van de astrocyt cultuur is de rol van de hippocampus astrocyten bestuderen ontsteking is het noodzakelijkaan de culturen te behandelen met 5 mM LME 10 d microgliale mogelijke besmetting in de astrocyt culturen vanaf DIV 3 LME elimineren is een microgliale cytotoxisch middel die uitgebreid is gebruikt als een methode voor de verwijdering prolifererende microglia 20,22. Bovendien moet LME-behandelde kweken worden onderworpen aan een protocol schudden (300 rpm gedurende 1 uur).

Een ander technisch probleem bij de uitvoering OGD / Reox is te bepalen of een voldoende mate van hypoxie is verwezenlijkt astrogliosis induceren. Markers voor hypoxie in astrocyten zijn de up-regulatie van GFAP en de inductie van HIF-1α. Dus in deze studie hypoxie werd bevestigd door de stijging van de GFAP-immunoreactiviteit (gegevens niet getoond) en de opregulatie van HIF1 α-kleuring (figuur 4).

Samengevat, de resultaten van gesekst neonatale hippocampus astrocyten culturen resultaten bleek succesvol celhechting met gezonde homogene astrocyten laag diwijd te spreiden typische morfologie op dekglaasjes en de expressie van de belangrijkste reactieve astrocytaire markers GFAP en S100B na inductie van ischemie in vitro. Wij geloven dat de hier gekozen protocol heeft het potentieel om te beantwoorden belangrijke mechanistische en translationele vragen met betrekking tot de rol van astrocyten in het ontwikkelen mannelijke en vrouwelijke hersenen. De gehele kweken procedure, in tegenstelling tot de meeste bestaande technieken genereert volwassen en confluente gesekst hippocampus astrocyten twee weken, verlenen een snelle turnaround experimenten en de eenvoud van de techniek zal het gebruik van astrocytaire kweekmethode als middel om het geslacht te bestuderen vergemakkelijken specifieke rol van gliacellen in de ontwikkeling van de hersenen waardoor zijn ruime verspreiding in hersenonderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen van de auteurs hebben concurrerende of tegenstrijdige belangen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Tags

Neuroscience hypoxie ischemie hippocampus astrocyten cultuur GFAP OGD-Reox pasgeborene
Sex Verschillen in Mouse hippocampus Astrocytes na<em&gt; In-vitro</em&gt; Ischemie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanana, V., Tumturk, A., Kintner,… More

Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter