Summary
Astrozyten sind eine der wichtigsten Schlüsselspieler im zentralen Nervensystem (ZNS). Hier berichten wir eine praktische Methode der sexed Hippokampus - Astrozyten Kulturprotokoll , um die zugrunde liegenden Mechanismen der Astrozytenfunktion bei männlichen und weiblichen Neugeborenen Welpen nach In-vitro - Ischämie zu untersuchen.
Abstract
Astrogliose nach Hypoxie / Ischämie (HALLO) -related Hirnverletzung spielt eine Rolle bei einer erhöhten Morbidität und Mortalität bei Neugeborenen. Neuere klinische Studien zeigen , dass die Schwere der Hirnverletzung erscheinen Geschlecht abhängig zu sein, und dass die männlichen Neugeborenen sind anfälliger für die Auswirkungen von HALLO bezogenen Hirnverletzung, was zu mehr schweren neurologischen Ergebnisse als zu Frauen mit vergleichbaren Hirnverletzungen verglichen. Die Entwicklung zuverlässiger Methoden zur Isolierung und hochangereichertes Populationen von sexed Hippokampus-Astrozyten halten ist wichtig, die zellulären Grundlagen der Geschlechtsunterschiede in den pathologischen Folgen der Neugeborenen-HALLO zu verstehen. In dieser Studie beschreiben wir ein Verfahren zur geschlechtsspezifischen hippocampal Astrozytenkulturen schaffen , die in vitro zu einem Modell der Ischämie unterzogen werden, Sauerstoff-glucose deprivation, gefolgt von Reoxygenierung. Nachfolgende reaktive Astrogliose wurde von immunostai geprüftning für den sauren Gliafaserproteins (GFAP) und S100B. Dieses Verfahren stellt ein nützliches Werkzeug, um die Rolle der männlichen und weiblichen hippocampalen Astrozyten folgenden neonatal HALLO, separat zu untersuchen.
Introduction
Astrozyten sind eine der wichtigsten Schlüsselspieler im zentralen Nervensystem (ZNS). Immer deutlicher abzeichnet, zeigt an, dass die Rollen von Astrozyten sind mehr als neuronale Unterstützung. In der Tat können die Rollen der Astrocyten unter physiologischen Bedingungen sehr komplex, wie die Wanderung der Entwicklungs Axone 1 Führung Regulieren CNS Blutfluß 2, um den pH - Homöostase des synaptischen Interstitialflüssigkeit 3 und in der Blut - Hirn - Schranke beteiligt 4 und 5 der synaptischen Übertragung. Unter pathologischen Bedingungen reagieren Astrozyten zu Verletzungen im Zusammenhang mit einem Prozess reaktiven Astrogliose genannt , in dem die Morphologie, Anzahl, Lage, Topographie (in Bezug auf Abstand von Insult) und Funktion der Astrozyten in einer heterogenen Weise 6,7 geändert. Astrogliose folgende neonatalen hypoxischen ischämischen Enzephalopathie gesehen vielleicht auf die Morbidität und Mortalität von Neugeborenen beitragen Neuere klinische und experimentelle Studien zeigen, dass die Schwere der Hirnverletzung wird geschlechtsabhängig zu sein und dass die männlichen Neugeborenen anfälliger für die Wirkungen von Hypoxie / Ischämie (HALLO) -bezogene Hirnverletzung, was zu schweren neurologischen Ergebnisse im Vergleich zu Frauen mit vergleichbaren Hirnverletzungen 11.09. Obwohl die Lokalisation der Verletzung auf dem Schwangerschaftsalter und der Dauer und der Schwere der Insult abhängt, ist hippocampus eine der am häufigsten durchgeführt Regionen im ZNS nach der Begriff neonatal HALLO und erhöhte hippocampal Astrogliose durch Hochregulierung von bestätigt die sauren Gliafaserproteins (GFAP) 3 d nach der Neugeborenen HALLO 7,10,12,13. Geschlechtsunterschiede in Astrozytenfunktion wurden in beiden Neugeborenen und erwachsenen Nagetieren nach zerebraler Ischämie 14,15 gezeigt. Zusätzlich wurde männlichen astrozytären Anfälligkeit für in-vitro Ischämie durch erhöhte cel gezeigtenl Tod im Vergleich zu weiblichen kortikalen Astrozyten in Kultur 16. Geschlechtsunterschiede beginnen in-utero und weiter bis zum Tod 17. Im Laufe der letzten zehn Jahre von der Bedeutung , die Geschlechter in der experimentellen Bedingungen in Zellkultur mit und in-vivo - Studien haben die Schwerpunkte des Instituts für Medizin und NIH gewesen grundlegende Kenntnisse in den geschlechtsspezifische Unterschiede in der physiologischen und pathologischen Zuständen gesehen zu suchen 17,18 . Entwicklung zuverlässiger Methoden Populationen von sexed Hippokampus-Astrozyten zu isolieren und zu pflegen ist wichtig, die zellulären Grundlagen der Geschlechtsunterschiede in den pathologischen Folgen der Neugeborenen-HALLO zu verstehen. Die vorliegende Studie wurde entworfen, um die Techniken zu bieten angereichertem geschlechtsspezifische hippokampale Astrozytenkulturen von neugeborenen Mäusen vorzubereiten, um die Rollen von GFAP-immunoreaktive Astrozyten zu bewerten folgenden Sauerstoff / Glukose-Deprivation (OGD) und Reoxygenierung (Reox), induzierenHALLO in Zellkulturumgebung. Diese Technik kann verwendet werden, um eine Hypothese zu testen, in Bezug auf Hippokampus-Astrocyten in neonatal Männchen und Weibchen unter normoxischen und ischämischen Zuständen.
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Protocol
HINWEIS: Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit der Empfehlung des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health durchgeführt. Das Tier Protokoll wurde von der University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. Primäre Astrocyte Kultur Protokoll , das hier vorgestellt wird , wird aus den von Zhang Y 19 et al Protokolle angenommen. Und Cengiz P 20 et al. Mit einigen Modifikationen.
1. Hippocampale Dissection und Astrocyte Kultur
- Bereiten Sie alle notwendigen Reagenzien und Materialien einschließlich chirurgische Scheren, glatt feinen Pinzette, flache Spitze Pinzette, Papiertücher, Abfallbeutel, 70% Ethanol und 2 Sezieren Gerichte (3,5 cm Durchmesser) auf Eis gefüllt mit 2 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) jeder . Stellen Sie sicher, dass die chirurgische Ausrüstung sind steril (Autoklav) vor dem Verfahren lassen und alle anderen Materialien (Astrocyte Plating Medium: DMEM + 5% Pferdeserum +1% Penicillin-Streptomycin, Pferdeserum, HBSS, 0,25% Trypsin, Glasplättchen, Petrischalen, 15/50 ml - Röhrchen, T25 Flaschen, etc.) als vorge steril.
- Mit scharfen sterilen Schere [1 (1)] vorsichtig halten und den Kopf und den Hals der Maus pup mit 70% Ethanol besprühen und enthaupten.
- Führen Sie einen Mittelschnitt von hinten nach vorn Schädel mit einer kleinen Schere entlang der Kopfhaut , das Gehirn zu entlarven [1 (2-3)].
- Schneiden Sie den Schädel vorsichtig vom Hals bis zur Nase mit einer kleinen Schere. Dann schneiden Sie Schädel anterior der Riechkolben und schlechter als das Cerebellum den Schädel von der Schädelbasis zu trennen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Basis des Schädels und entlang der Mittellinie geschnitten. Verwenden Sie sterile Flach Spitze Zange den Schädel abzulösen. Entfernen Sie den Hirnstamm mit Hilfe einer gebogenen Pinzette. Entfernen Sie Gehirn aus dem Schädel und legen Sie in die erste Sezieren Gericht [1 (4-9)] 21.
- Unter Verwendung einer gebogenen Pinzette, drehen das Gehirn , so dass die ventrale Oberfläche des Gehirns nach oben und trennen sich dann die beiden Hemisphären mit einem scharfen sterilen chirurgischen Klinge [1 (10,11)]
- Ziehen Sie die zerebralen Hemisphären und sorgfältig die prall Mittelhirns und Thalamus Gewebe mit einer sterilen flach gebogenen Pinzette entfernen Sie den Hippocampus zu offenbaren, eine kleine, Seepferdchen förmige Struktur im medialen Temporallappen [1 (12-14)].
- Entfernen Sie sowohl die Hippokampus - Lappen [1 (15,16)] und sorgfältig die Meningen von den Lappen sezieren , indem sie mit den feinen Pinzette ziehen. Dieser Schritt vermeidet eine Verunreinigung der endgültigen Astrozyten Kultur von meningealen Zellen und Fibroblasten.
- Übertragen Sie die vorbereiteten Hippokampus - Lappen in die zweite Schale mit HBSS gefüllt und schicken Sie es auf Eis [1 (17,18)]. Pool sowohl Hippocampus-Lappen aus einer einzigen Maus (P0 - P2) zur Herstellung von hippoCampal Astrozytenkulturen. Dies gibt die Astrozyten richtige Dichte. Mince Hippokampus-Lappen einen scharfen sterilen chirurgischen Klinge (ca. 4 mal).
- Absaugen HBSS aus Schale mit einer sterilen Spitze an einer 1-ml-Pipette und 3 ml 0,25% Trypsin, mischen, Transfer in ein 15 ml sterilen konischen Röhrchen und inkubieren das Gewebe bei 37 ° C für 20 min unter leichtem Schütteln.
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min. Absaugen Überstand unter Verwendung sorgfältig mit einer sterilen Glaspipette mit einer Vakuumleitung angebracht. In 10 ml Astrozyten Plattierungsmedium und verreiben (20 - 30 mal) mit einem feuerpolierte Glaspipette, bis die Gewebestücke homogenisieren.
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min. Überstand entfernen und mit 2 ml frischem vorgewärmtem Astrozyten Plattenmedien. Passieren Zellen durch ein 70 & mgr; m-Mesh-Filter (Zellsieb) in ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
- Platte gesamte Zellsuspension auf Poly-D-Lysine / Laminin beschichtet sterile T25 Kulturflasche mit 3 mlAstrozyten Plattierung Medien, brüten dann der Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator.
- Absaugen gesamte Medien bei Tages- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 und DIV 7 und ersetzen mit 2 ml frischem Astrozyten Plattierung Medien. Beachten Sie die Progression und astrozytären Zusammenfluß unter dem Lichtmikroskop jedes Mal, während die Astrozyten Plattierung Medien zu ersetzen.
HINWEIS: Bei DIV 1 alle lebensfähigen Astrozyten an der Oberfläche der Kulturflasche angebracht und die toten oder sterbenden Zellen, Nervenzellen enthalten, werden in der überstehenden Flüssigkeit schwimmt. Bei DIV 3 beginnen die anhaftenden Zellen zu teilen astrozytären Zellschicht zu bilden. In Abwesenheit der unterstützenden Bedingungen ist Kultur fast frei von jeder neuronalen Wachstums. Bei DIV 7 ist Astrozyten-Schicht etwa 80-90% konfluent und einige Mikroglia sowie Oligodendrozyten-Vorläuferzellen vorhanden sind auf der Oberseite der Schicht astrozytären. - Saugen Sie das Plattenmedium aus dem Kolben, fügen Sie 2 ml frischem vorgewärmtem Astrozyten Plattierungsmedium gründlich einnd wieder entfernen bei DIV 11, wenn Astrozyten sind konfluent und bereit für die Kultivierung sub.
- In 2 ml 0,25% Trypsin, sanft den Kolben einige Male drehen und absaugen Trypsin eine sterile Glaspipette verwenden.
- In 2 ml 0,25% Trypsin und ließ den Kolben 4 in der Gewebekultur Haube sitzen - 5 min bei RT.
- Entfernen Sie die Trypsin und halten den Kolben bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 10 min. In 5 ml vorgewärmtes Astrozyten Plattierungsmedium und entfernen Sie die astrozytären Schicht, indem der Kolben gegen die Handfläche klopfen (3 bis 4 mal) durch leichtes Verreiben gefolgt vollständige Ablösung zu erreichen und die Astrozyten in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln.
- Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min den Überstand aspirieren, und fügen Sie 1 ml frisches Astrozyten Plattierungsmedium.
- Fügen Sie 10 ul der Zellsuspension auf eine Zählkammer und zählen Sie die Zellen in der großen zentralen gerasterten Bereich (1 mm 2) unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskop (10X - Objektiv). Multiply von 10 4 , die Anzahl der Zellen pro ml zu bestimmen. Ein T25 - Kolben nachgeben ~ 1 x 10 6 insgesamt dissoziierten Zellen. Seed ~ 1 x 10 5 Zellen in 2 ml astrocyte Plattierungsmedium auf einem 12 mm Durchmesser Poly-D-Lysine vorbeschichteten Deckglas in die Vertiefung einer 24-Well - Kulturschale.
- In einer 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C inkubieren. Führen Sie OGD / Reox bei DIV 12 bis 14 (Abschnitt 2).
- Behandeln Sie die Astrozytenkulturen bei DIV 3 mit 5 mM L-Leucin-Methylester (LME) Hydrochlorid bis DIV 11, wenn Hippokampus-Kulturen frei von Mikroglia erwünscht sind. Nach LME Inkubation Fachkulturen zu Schütteln (300 Umdrehungen pro Minute für 1 h) verunreinigen Mikroglia zu entfernen.
HINWEIS: LME ist ein microglial zytotoxischen Mittel , das in großem Umfang als ein Verfahren verwendet wurde Mikroglia 22 zu beseitigen proliferierenden.
2. OGD / Reox Behandlung
- Absaugen Medien von Deck enthält adhärenten Astrozyten Kultur (DIV 12 bis 14) und spülen Sie 3-maldurch die 24-Well - Kulturschale das Deckglas ein paar Mal mit 1 ml isotonischer OGD - Lösung (pH 7,4) , die (in mM) hält sanft rotierenden: 0 Glukose, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 1,27 CaCl 2 und 0,81 MgSO 4.
- In 0,2 ml OGD Lösung auch das Deckglas zu bedecken und 2 h in einem hypoxischen Inkubator inkubieren enthält 94% N 2, 1% O 2 und 5% CO 2. Vorsichtig mit einem Orbitalschüttler (50 rpm) für die ersten 30 min der Hypoxie mischen Gasaustausch zu erleichtern.
- Inkubieren normoxischen Kontrollzellen für 2 h in 5% CO 2 und atmosphärische Luft in einem Puffer identisch mit der OGD - Lösung mit Ausnahme der Zugabe von 5,5 mM Glucose.
- Für Reox absaugen OGD-Lösung und 2 mL Astrozyten Plating Medium. Inkubiere in 5% CO 2 und atmosphärischer Luft bei 37 ° C für 5 h.
3. immunzytochemische Färbung </ P>
- Absaugen Kulturmedien eine sterile Glaspipette mit einer Vakuumleitung angebracht verwenden und schnell Deck spülen einmal durch Zugabe von 1 ml 0,1 M Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM Trizma-Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) zum Brunnen. Absaugen und mit 2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x Phosphat-gepufferte Saline (PBS). Inkubieren für 15 min bei RT.
- Absaugen und fügen Sie 1 ml 0,1 M TBS, legen Sie dann auf einem Schüttler für 2 min. 3-mal wiederholen. In 1 ml Blockierungslösung (10% Ziegenserum, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 in 0,1 M TBS) und Inkubation für 30 min bei 37 ° C auf einem Schüttler.
- Aspirat Blockierungslösung und primären anti-GFAP monoklonalen Maus-Antikörper hinzuzufügen (0,2 ml einer 1: 500-Verdünnung in Blockierlösung) und Kaninchen-polyklonalen Anti-S100B (1: 500) oder polyklonalem Kaninchen-anti-HIF1α (1: 200) für 60 min bei 37 ° C auf einem Schüttler.
- und Maus mon: Alternativ werden einige Astrozyten mit polyklonalen Kaninchen-anti-Iba1 (200 1) inkubiertoclonal anti-MAP2 Reinheit der Kultur zuzugreifen.
- Absaugen primären Antikörper und spülen Deckglas durch Zugabe von 1 ml 0,1 M TBS und Unterbringung an einem Schüttler für 2 Minuten und dann gründlich absaugen. Zweimal wiederholen.
- Hinzufügen 0,2 ml einer 1: 200-Verdünnung des sekundären Ziegen-Anti-Kaninchen-488-konjugiertem und anti-Maus-568-konjugierten Antikörper in Blocking-Lösung für 60 min bei 37 ° C auf einem Schüttler.
- Absaugen sekundären Antikörper und spülen Deckglas durch Zugabe von 1 ml 0,1 M TBS und auf einem Schüttler für 2 Minuten und dann gründlich absaugen. Zweimal wiederholen.
- Entfernen Sie Deck von gut und trocken, indem man auf eine Folie auf einem Schlitten Trockner positioniert. Berg Deckglas auf einer neuen Folie, indem Sie auf einen einzigen Tropfen des Vectashield Umkehren hardset Eindeckmedium mit DAPI (1,5 ng / ul).
- Bild Deckgläser auf einem konfokalen Mikroskop entweder 20X trocken oder 60X Öl-Objektiv. Erwerben Sie Bilder (512 x 512) für DAPI (405 nm ex / 450 nm em) und Fluorochrom 488 markiert GFAP Antikörper (488 nm ex / 515 nmem). Halten Sie Erfassungsparameter konstant innerhalb der 20X und 60X-Gruppen.
4. Geschlechtsbestimmung mittels PCR
- Wärme Pup Zeh oder Finger Schnittgut bei 95 ° C für 45 min in 50 mM NaOH und Neutralisieren mit einem gleichen Volumen von 1 M Tris, pH 6,8.
- 1 & mgr; l der extrahierten DNA-Lösung zu 19 & mgr; l des folgenden Gemisches: 5 pmol Primer für die MYOG und Sry Gene, 1x Reaktionspuffer, 0,2 mM von jedem Desoxynukleotid und 8 U Taq-Polymerase.
- Verwenden Sie Primer-Sequenzen; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' und MYOG 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
- Führen Sie die folgende PCR-Protokoll: 95 ° C für 3 min, dann 30 Zyklen Denaturierung bei 95 ° C für 15 s, Annealing bei 58 ° C für 15 s und Verlängerung bei 72 ° C für 1 min. Nach dieser 30 Zyklen schließt die Reaktion mit einem letzten 72 ° C Elongation für 1 min.
- Separate PCR Produkte elektrophoretisch auf einem mit Ethidiumbromid, das 2% Agarose-Gel und unter UV-Beleuchtung sichtbar. (2A.) ACHTUNG! Ethidiumbromid ist ein potenzielles Karzinogen und muss sorgfältig und fachgerecht gemäß Institution Vorschriften entsorgt behandelt werden.
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Representative Results
Verständnis haben die Rollen von sexed Astrozyten Funktionen unter physiologischen oder pathophysiologischen Bedingungen wurden durch die Kultivierung dieser Zellen unter in vitro Bedingungen immens aufgeklärt. Der wichtige Aspekt gesextem Züchten der Durchführung ist das Geschlecht der Maus Welpen vor seiner Verwendung zu bestimmen. Wir stellten fest , das Geschlecht der Maus genetisch durch PCR und durch visuelle Beurteilung (Abbildung 2) 16. Die Methodik der Geschlechtsbestimmung mittels PCR wurde mit Modifikationen von McClive und Sinclair angenommen, ist schnell, einfach und hoch reproduzierbare Methode 23. 2A zeigt die repräsentativen Ergebnisse der Geschlechtsbestimmung mittels PCR. PCR-Produkte wurden von zwei repräsentativen P1 männliche und weibliche Schwanz snips mit DNA extrahiert erzeugt. Die Reaktion umfasst Multiplex - Primerpaare für Sry und MYOG Gene , die männliche spezifischen Banden von 441 bp und weiblichen spezif erzeugenic Banden von 245 bp, respectively. Die visuelle Bestimmung der Neugeborenen (P 1 - 3) Maus Sex mit bloßem Auge wurde nur bei Männern (2B) 16,24 , indem man auf das Vorhandensein von kleinen abgedunkelten Stelle zwischen anogenital Öffnungen etabliert.
Obwohl die Kultivierung von Astrozyten bequem ist und relativ einfach im Labor zu etablieren einzurichten, dieser Vorteil wird durch seine Kontamination behindert werden in erster Linie mit Mikroglia oder Neuronen in einem geringeren Ausmaß. Verunreinigung der Astrozyten kann leicht durch Immunmarkierung der kultivierten Zellen mit zellspezifischen Marker entweder für Mikroglia (Iba1) oder Neuronen (MAP2) bestimmt werden. In der vorliegenden Studie wurden die Hippokampus - Astrocyten in primären Monolayerkulturen wachsen beobachtet haben ~ 6% der kontaminierenden Mikroglia bei DIV 14, wie durch einige Zellen vorgeschlagen , die Iba1 (Abbildung 3) ausgedrückt. Im Gegenteil, keine der Zellen zu exprimieren MAP2 gefunden darauf hindeutetDie Kultur wurde völlig frei von jeglicher Kontamination neuronal (Abbildung 3). Die kleinere microglial Kontamination in unseren Kulturen beobachtet wurde, ist in Übereinstimmung mit anderen Berichten, wobei die Autoren berichteten von einer 5% Mikroglia - Kontamination in ihrer primären kortikalen Astrozyten - Kulturen abgeleitet von 1 bis 3 Tage alten Maus - Jungen 25. Astrocyten besitzen eine spezifische Zytoarchitektur, die es ihnen ermöglichen, auf Veränderungen in ihrer Mikroumgebung einschließlich Hypoxie zu reagieren. Um jede geschlechtsspezifische astrozytären Reaktion auf In-vitro - Ischämie zu bestimmen, wir sexed Hippokampus - Astrozyten OGD / Reox unterworfen. Erfolgreiche Induktion von OGD / Reox durch die Erhöhung der nuklearen Expression von Hypoxie - induzierbaren Faktor 1 alpha bestimmt wurde (beobachtet HIF1α in + GFAP Astrozyten unterzogen , um 2 h OGD , gefolgt von 5 h Reox wie in Zellen unter normoxischen Bedingungen zu den HIF1α Ausdrücke verglichen (Abbildung 4 ).
(Abbildung 5). GFAP und S100B wurden im Zytoplasma und Zellkörper von Astrozyten colocalized, ein ausgereiftes astrozytären Entwicklungsstadium zu charakterisieren , wo diese Zellen ihre Neural Stem Cell (NSC) neigen Potential 26 zu verlieren. Die Morphologie und Dichte der GFAP oder S100B Immunreaktivitäten waren in beiden männlichen und weiblichen Astrozyten-Kulturen als in ihren jeweiligen normoxischen und OGD / ReOx Behandlungsgruppen beobachtet. Unter normoxischen Bedingungen präsentiert Hippokampus - Astrozyten eine polygonale und flache Morphologie zu spindelförmig [5A, B (Normoxie 60X; Pfeil)], wie mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Diese Zellen konnten für etwa 2 Wochen bis zur Konfluenz zu teilen vor der Induktion der OGD / ReOx. Nach 2 h OGD und 5 h Reox zeigte Astrozyten klassische Reactive Astrozytenmorphologie eingezogenen Primärprozesse, Hypertrophie des Somas und Prozesse und eine erhöhte Expression von GFAP oder S100B Anzeige [5A, B (OGD / Reox, 60X; Pfeilspitze)]. Nach der OGD / ReOx, die GFAP / S100B Färbung zeigte auch eine umfangreiche meshwork über das Cytoplasma erstreckt sowohl in den männlichen und weiblichen hippocampalen Astrozyten. Mangel an GFAP - Färbung in den kultivierten hippocampalen Astrozyten aus GFAP - null - Mäusen beobachtet , diente als negative Kontrolle (5B, Einschub). Die obigen Ergebnisse bieten einen direkten Beweis dafür, dass die Morphologie der GFAP / S100B-immunoreaktive Astrozyten erfährt signifikante Veränderungen bei der zu OGD-Reox unterworfen.
Abbildung 1. Abbildungen des Hippokampus - Entfernungstechnik von P1 Mäuse. 1. Enthaupten pup den Kopf zu entfernen.2, 3. feine Schere, einen Mittelschnitt der Haut machen, anterioren posterioren, und ziehen Sie die Haut mit Hilfe eines Flach Spitze Pinzette. 4, 5, 6 zurück. Einen kleinen Schnitt an der Basis des Make Schädel. Schneiden Sie den Schädel entlang der Mittellinie und ziehen weg zwei Hälften des Gehirns aufzudecken. 7, 8. Entfernen Sie Cerebellum mit Hilfe einer gebogenen Pinzette. 9. Entfernen Gehirn vorsichtig aus dem Schädel und Platz in einer sterilen Petrischale. 10, 11. Drehen Sie das Gehirn , so dass die ventrale Oberfläche des Gehirns nach oben zeigt eine gekrümmte Pinzette, dann mit einem scharfen sterilen chirurgischen Klinge beide Hemisphären trennen. 12, 13, 14. entfernen Sie die prall Mittelhirns und Thalamus Gewebe des intakten zugrunde liegenden Hemisphäre zu verlassen und den Hippocampus enthüllt. 15, 16. entfernen Sie den Hippocampus (kleine C-förmige Struktur). 17, 18. Unmittelbar die Hippokampus - Lappen von den beiden das erhaltene platzieren Hemisphären in a separaten Petrischale mit steriler HBSS. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Geschlechtsbestimmung von neugeborenen Mäusen. A. Maus - Sex wurde genetisch durch PCR mit Primern , die spezifisch auf die MYOG (X - Chromosom) und Sry (Y - Chromosom) Gene bestimmt DNA von Finger- oder Zehen Ausschnitte extrahiert (F 1; M 1). Die Bänder der PCR wurden auf einem 2% Agarosegel mit Ethidiumbromid unter UV-Beleuchtung sichtbar gemacht. F 2 und M 2 dienten als positive Kontrollen für weibliche und männliche, respectively. B. Die visuelle Bestimmung der männlichen von den weiblichen wurde festgestellt, indem Sie einen abgedunkelten Stelle zwischen den anogenital Öffnungen Identifizierung (Pfeil).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Reinheit der primären Maus Hippocampus Astrocyte Kultur. Immunostaining von Astrozyten Kultur mit neuronalen Marker MAP2 (rot) und Mikroglia Marker Iba1 (grün). Nuclei sind gefärbt mit 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blau). Der Pfeil zeigt die Mikroglia Kontamination. Maßstabsbalken:. 50 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. HIF1α Expression wurde inHippokampus - Astrozyten zerknittert in Cultured Exposed OGD / Reox. Repräsentative Immunofluoreszenz Bilder zeigen GFAP (rot) und HIF1α (grün) Kennzeichnung in Astrozyten unterworfen (A) Normoxie oder (B) OGD (2 h) / Reox (5 h). Nuclei sind gefärbt mit 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blau). Pfeil, niedrige HIF1α Ausdruck; Pfeilspitze, erhöhte HIF1α Kern Ausdruck. Maßstabsbalken:. 25 & mgr; m Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Hochregulation von S100B oder GFAP Expression in Sexed Hippocampus Astrozytenkulturen folgenden OGD-Reox. Sexed kultiviert wurden für S110B oder GFAP - Expression unter normoxischen Bedingungen oder nach 2 Hippokampus - Astrozyten gefärbth OGD von 5 h von Reox (OGD / ReOx) gefolgt. Kleines Bild: 60X Bild von Hippokampus-Astrozyten kultiviert von GFAP-null-Mäusen. Maßstabsbalken: 30 & mgr; m.
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Discussion
Um die geschlechtsspezifische Unterschiede in den Eigenschaften und Funktion der Astrozyten unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen, die Vorbereitung von sexed primären Astrozyten in der Zellkultur ist ein wichtiges Instrument zu nutzen. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine hocheffiziente und ein reproduzierbares Verfahren zur Kultur ein hochangereichertes homogene Population von sexed Hippokampus - Astrozyten von Neugeborenen (P0-P2) C57Bl / 6 (Wildtyp) oder K19F (GFAP null) Maus Welpen in vitro. Diese Methodik zur Messung hilft die Ermittler die physiologischen und pathologischen Funktionen von sexed Hippokampus - Astrozyten nach In-vitro - Ischämie zu verstehen.
Es gibt zwei wichtige Schritte in diese Methodik zur Messung einschließlich der Aufrechterhaltung der Sterilität und eine angemessene Verdauung von Hippocampus-Lappen während Trypsinierung, gefolgt von Verreiben des verdauten Gewebe, um die Einzelzellsuspension zu erreichen. Prävention von primären Astrozyten ausverunreinigt ist immer eine der größten Herausforderungen in der gesamten Kulturverfahren. Bakterielle und / oder Pilzen sind zwei gängige Arten der Verschmutzung, die die kultivierten Zellen nutzlos, wenn die richtige Pflege nicht übernommen machen kann, während die Technik durchgeführt wird. Daher, um experimentellen Erfolg zu gewährleisten, ist es unerlässlich, das Verfahren unter einer sterilen Arbeitsumgebung durchzuführen, die, die Desinfektion des Arbeitsplatzes vor der Verwendung mit sterilen chirurgischen Geräten und Materialien, vermeiden Sie Kontakt von sterilen Materialien mit nicht sterilen Oberflächen enthält, eine mit Laminarströmungsabzug und aus der laminaren Haube uncapped Kulturflaschen nehmen vermeiden. Darüber hinaus soll während enzymatische Dissoziation, längere Inkubationszeit von Hippocampus-Gewebe mit Trypsin mit umfangreichen physischen Verreiben gefolgt kann zu seiner Über Verdauung führen zu einer schlechten Lebensfähigkeit der Zellen und ineffizient Bindung von dissoziierten Zellen auf Kulturflaschen zur Folge hat.
Im Gegenteil stellt underdigestion des Hirngewebes unzureichendDissoziation von Gliazellen dadurch in schlechten Ausbeute und Aussaat von Zellen als große Klumpen entstehen. Daher wird, um gesunde Astrozytenkulturen zu erhalten, ist es notwendig, Trypsinkonzentration, Inkubationszeit und Verreiben zu erreichen optimale Verdau des Hippokampusgewebe zu optimieren. In unseren Händen, die Inkubation von Hippocampus-Lappen mit der Arbeitskonzentration von 0,25% Trypsin für 20 min bei RT, gefolgt von sanften Verreiben für 20 - 30 mal ergab stark haftende, gesunde und hoch reproduzierbare Astrozytenkulturen. Auch wiederholtes Einfrieren und Auftauen von Reagenzien vor jedes Mal zu verwenden, können ihre Wirksamkeit reduzieren. Daher ist es sehr wichtig zu aliquoten Reagenzien in kleinen Mengen und wünschenswerte freeze. Zum Beispiel speichern Trypsin, Penicillin / Streptomycin als 5 ml Aliquots und fötalem Rinderserum als 50 ml Aliquots in sterile zahlreiche konische Röhrchen bei -20 ° C bis zur Verwendung. Wir beraten nicht Antibiotika über das Verfallsdatum zu verwenden.
GFAP ist awell charakterisierte Marker von reaktiven Astrozyten faserig. Nach OGD / Reox, Hochregulation von GFAP - Expression in Reaktion auf reaktive Astrogliose wurde 20 berichtet. Zwar wurde vorgeschlagen, dass die Überexpression GFAP als ziel für neuronale Reparaturstrategien verwendet werden könnten , 27 ihre Rolle in hippocampalen Schäden nach HALLO bei Neugeborenen ist noch unklar. Immunhistochemische Färbung von Astrozyten mit GFAP ermöglicht es uns, diese Zellen unter den physiologischen und pathologischen Zuständen zu identifizieren und zu charakterisieren. GFAP-Färbung wie jede andere Marker hat einige Einschränkungen, die erkannt werden müssen. Eine der Beschränkungen der GFAP-Färbung von Astrozyten ist, dass nicht alle Astrozyten GFAP exprimieren unter physiologischen Bedingungen. Vor allem die unreifen Astrozyten Expressionsrate von GFAP nicht mehr als 40% unter physiologischen Bedingungen 28. Je nach alters- und typspezifischen Verwendung von Astrozyten, andere Marker der Wahl kann wie GLAST in Betracht gezogen werden, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 und S100B 29.
Darüber hinaus Anwesenheit von NSCs verkleidet als Astrozyten in den Primärkulturen nicht ausgeschlossen werden kann. Diese NSCs wurden gezeigt phänotypischen und ultrastrukturellen Eigenschaften ähnlich präsentieren Astrozyten einschließlich der Expression von GFAP zu reifen. Daher Identifizierung von molekularen Markern, die für vollständig differenzierten und gereiften Astrozyten spezifisch sind, ist ein Muss. Astrozyten wurden bei ihrer späteren vollständig differenzierten Entwicklungsstadien ausgedrückt S100B berichtet. Kürzlich wurde gefunden , dass + Astrozyten GFAP neonatalen kortikalen berichtet ihre Vorläuferstammzellpotential mit dem Beginn der S100B Expression verlieren , die um 15 26 DIV passieren. Ebenso in unseren Kulturbedingungen an DIV 14, 91% der GFAP exprimierende Zellen wurden gefunden coexprimieren S100B, die darauf hindeuten, daß die Kulturen in erster Linie terminal differenzierten gereiften hippocampalen Astrozyten besteht.
Es ist fast unmöglich reine primäre hippocampale Astrozytenkulturen völlig frei von kontaminierenden Mikroglia-Zellen zu erhalten, die oberhalb und unterhalb der Astrozyten einschichtigen befinden. Daher ist es wichtig, den Anteil an verunreinigenden Mikroglia in Astroglia Kulturen kennen zu lernen und auch diesen Anteil so gering wie möglich zu halten. In der vorliegenden Studie gefärbt wir Astrozytenkulturen mit Mikroglia spezifischer Marker Iba1 oder neuronalen Marker MAP2, um das Vorhandensein von Mikroglia oder Neuronen als potentielle Verunreinigungen zu bestimmen. Der Anteil an Mikrogliazellen in rodent astrocyte Kultur kann von 1% bis 30% variieren , abhängig von mehreren Faktoren , das Alter der Tiere umfassen Spezies, eine Region, Kulturmedium subkultiviert Verfahren und Schütteln 30. In unseren Kulturen beobachteten wir rund 6% der Mikroglia - Kontamination , die mit anderen Berichten 25 vergleichbar ist. Wenn die beabsichtigte Verwendung der Astrozyten Kultur die Rolle der hippocampalen Astrozyten in Entzündung zu untersuchen ist, ist es unerlässlich,die Kulturen mit 5 mM LME für 10 d zur Behandlung möglich Mikroglia - Kontamination in den Astrozytenkulturen von DIV beginnen zu beseitigen 3. LME ist ein Mikroglia zytotoxische Mittel , das in großem Umfang als ein Verfahren verwendet wurde , Mikroglia 20,22 wuchernden zu entfernen. Darüber hinaus sollte LME-behandelten Kulturen zu einem Schüttel-Protokoll (300 Upm für 1 h) unterzogen werden.
Eine andere technische Herausforderung OGD / ReOx in der Durchführung ist, um zu bestimmen, ob ein ausreichender Grad an Hypoxie induziert Astrogliose erreicht wurde. Marker für Hypoxie in Astrozyten umfassen die Hochregulierung von GFAP und die Induktion von HIF-1α. Somit Hypoxie in dieser Studie durch die Zunahme der GFAP - Immunoreaktivität wurde bestätigt (Daten nicht gezeigt) und die Heraufregulierung von HIF1-α - Färbung (Abbildung 4).
Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse aus gesextem neonatal hippocampal Astrozytenkulturen erhalten erfolgreiche Zellanheftung mit gesunden homogenen astrocyte Schicht diabspreizende typische Morphologie auf Deckgläser und die Expression des großen reaktiven Astrozyten Marker GFAP und S100B nach Induktion der In-vitro Ischämie. Wir glauben, dass das Protokoll hier angenommen hat das Potenzial, die Rolle der Astrozyten im Zusammenhang wichtige mechanistische und translationale Fragen zu beantworten, männliche und weibliche Gehirne zu entwickeln. Das gesamte Kultivierungsverfahren wie für die Mehrheit der bestehenden Techniken im Gegensatz erzeugt reifen und konfluenten sexed Hippokampus-Astrozyten in zwei Wochen, einen schnellen Turnaround von Experimenten und die Einfachheit der Technik Gewährung wird die Verwendung von astrozytären Kultivierungsverfahren als ein Werkzeug zu erleichtern, das Geschlecht zu studieren spezifische Rolle von Gliazellen bei der Entwicklung von Gehirn wodurch seine weite Verbreitung in der Hirnforschung.
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Disclosures
Keiner der Autoren haben im Wettbewerb oder widerstreitenden Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | cellgro | 10-013-CV | |
| Horse Serum | Gibco | 26050-070 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | Final Concentration: 1% |
| L-Leucine methyl ester hydrochloride | Aldrich | L1002-25G | Final Concentration: 5 mM |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| Trypsin | cellgro | 25-050-CI | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips | Corning | 354087 | |
| Water | Sigma | W3500 | Cell-culture grade |
| PBS | cellgro | 21-040-CV | Cell-culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 70 μm Sterile cell strainer | Fisher scientific | 22363548 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 mL Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 mL Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Confocal Microscope | Nikon | A1RSi | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | 5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | Rabbit monoclonal |
| Anti-MAP2 | Sigma | M2320 | Mouse monoclonal |
| Anti-HIF1alpha | abcam | ab179483 | Rabbit monoclonal |
| Anti-S100B | Sigma | HPA015768 | Rabbit polyclonal |
| Anti-GFAP (cocktail) | Biolegend | 837602 | |
| VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) | Vector Labs | PK-6101 | Contains 4 Reagents |
| Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 | Invitrogen | A11070 | |
| Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 | Invitrogen | A11004 |
References
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