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Neuroscience

Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). Qui, stiamo riportando un metodo pratico di sessuato dell'ippocampo protocollo cultura astrociti al fine di studiare i meccanismi alla base della funzione degli astrociti in cuccioli di neonato maschio e femmina dopo ischemia in vitro.

Abstract

Astrogliosis seguente ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related svolge un ruolo in un aumento della morbilità e mortalità nei neonati. Recenti studi clinici indicano che la gravità della lesione cerebrale sembrano essere il sesso dipendente, e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di lesioni cerebrali HI-correlati, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto alle femmine con lesioni cerebrali simili. Lo sviluppo di metodi affidabili per isolare e mantenere le popolazioni altamente arricchito di sessuato astrociti dell'ippocampo è essenziale per comprendere la base cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. In questo studio, si descrive un metodo per la creazione di specifiche culture astrociti dell'ippocampo di sesso che sono sottoposti a un modello di ischemia in vitro, deprivazione di ossigeno e glucosio, seguito da riossigenazione. Successivamente astrogliosi reattiva è stata esaminata dal immunostaining per la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) e S100B. Questo metodo fornisce un utile strumento per studiare il ruolo del maschio e astrociti dell'ippocampo femminili seguente neonatale HI, separatamente.

Introduction

Gli astrociti sono uno dei più importanti attori chiave del sistema nervoso centrale (SNC). crescente corpo di evidenze indicano che i ruoli di astrociti sono più di sostegno neuronale. Infatti, i ruoli di astrociti in condizioni fisiologiche possono essere molto complessa, come guidare la migrazione degli assoni sviluppo 1, regolazione del flusso sanguigno CNS 2, mantenendo l'omeostasi pH della sinaptica liquido interstiziale 3, e partecipando la barriera ematoencefalica 4 e 5 la trasmissione sinaptica. In condizioni patologiche, astrociti rispondono al danno con un processo chiamato astrogliosis reattiva in cui la morfologia, numero, la posizione, la topografia (rispetto alla distanza da insulto) e funzione delle astrociti possono cambiare in modo eterogeneo 6,7. Astrogliosis visto seguente neonatale encefalopatia ischemica ipossica forse contribuire alla morbilità e la mortalità dei neonati

studi clinici e sperimentali recenti indicano che la gravità del danno cerebrale sembra essere il sesso-dipendente e che i neonati maschi sono più sensibili agli effetti di ipossia / ischemia (HI) lesione cerebrale -related, con conseguente esiti neurologici più gravi rispetto a femmine con lesioni cerebrali paragonabili 9-11. Sebbene la localizzazione della lesione dipende dall'età gestazionale e la durata e la gravità dell'insulto, ippocampo è una delle regioni più comunemente effettuata nel SNC dopo termine neonatale HI, e aumentato astrogliosis ippocampo è stato confermato da up-regolazione Protein fibrillare gliale acida (GFAP) 3 d dopo la HI neonatale 7,10,12,13. Differenze di genere nella funzione degli astrociti sono stati mostrati in entrambi i neonati e nei roditori adulti dopo ischemia cerebrale 14,15. Inoltre, maschio suscettibilità astrociti di ischemia in vitro è stato dimostrato da un aumento cell morte rispetto ai astrociti corticali femminili nella cultura 16.

Differenze di sesso iniziano in utero e continuare fino alla morte 17. Negli ultimi dieci anni, l'importanza di includere i sessi in condizioni sperimentali in coltura cellulare e in vivo studi sono stati l'enfasi dell 'Istituto di Medicina e NIH di cercare la conoscenza fondamentale nelle differenze di sesso visto in condizioni fisiologiche e patologiche 17,18 . Sviluppo di metodi affidabili di isolare e mantenere popolazioni di sessuato astrociti dell'ippocampo è essenziale per comprendere le basi cellulare di differenze di sesso e le conseguenze patologiche di HI neonatale. Il presente studio è stato progettato per fornire le tecniche per preparare culture dell'ippocampo astrociti sesso-specifici arricchito da topi appena nati al fine di valutare il ruolo degli astrociti GFAP-immunoreattive seguenti ossigeno / glucosio Deprivation (OGD) e riossigenazione (Reox), inducendoHI in ambiente di coltura cellulare. Questa tecnica può essere utilizzata per testare qualsiasi ipotesi di pertinenza astrociti dell'ippocampo nei maschi e nelle femmine neonatali in condizioni normossiche e ischemiche.

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Protocol

NOTA: Questo studio è stato condotto in conformità con la raccomandazione della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health. Il protocollo animale è stato approvato dalla University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care e del Comitato Usa. Primaria protocollo cultura astrociti che viene qui presentata è adottato dai protocolli presentati da Zhang Y 19 et al. E Cengiz P 20 et al., Con alcune modifiche.

1. ippocampale dissezione e la cultura astrociti

  1. Preparare tutti i reagenti e materiali necessari, tra cui forbici chirurgiche, una pinza sottile liscia, pinze punta piatti, tovaglioli di carta, il sacchetto dei rifiuti, il 70% di etanolo e 2 piatti dissezione (3,5 centimetri di diametro) sul ghiaccio riempito con 2 Soluzione di ml Hank salina bilanciata (HBSS) ogni . Assicurarsi che il apparecchi chirurgici sono sterili (autoclave) prima procedura e usare tutti gli altri materiali (astrociti placcatura media: siero DMEM + 5% di cavallo +1% di penicillina-streptomicina, siero di cavallo, HBSS, 0,25% tripsina, vetrini, piastre di Petri, 15/50 mL, fiasche T25, etc.) come pre-sterile.
  2. Delicatamente tenere e spruzzare la testa e il collo del cucciolo del mouse con il 70% di etanolo e decapitare con le forbici sterili affilate [Figura 1 (1)].
  3. Eseguire un'incisione mediana da posteriore ad anteriore cranio con piccole forbici lungo il cuoio capelluto per esporre il cervello [Figura 1 (2-3)].
  4. Tagliare il cranio con cura dal collo al naso con piccole forbici. Poi tagliare cranio anteriore ai bulbi olfattivi e inferiore al cervelletto per scollegare il cranio dalla base del cranio.
  5. Fai una piccola incisione alla base del cranio e tagliare lungo la linea mediana. Utilizzare sterili pinze a punta piatta a staccarsi il cranio. Rimuovere il tronco cerebrale con l'aiuto di una pinza curve. Rimuovere il cervello dal cranio e posto in primo piatto dissezione [Figura 1 (4-9)] 21.
  6. Utilizzando una pinza curva, capovolgere il cervello in modo che la superficie ventrale del cervello è rivolto verso l'alto e poi separare entrambi gli emisferi con una lama chirurgica sterile tagliente [Figura 1 (10,11)]
  7. Staccare gli emisferi cerebrali e rimuovere con attenzione il tessuto mesencefalo e del talamo sporgenti con una sterile pinze curve piatte a rivelare l'ippocampo, una piccola struttura a forma di cavalluccio marino nel lobo temporale mediale [Figura 1 (12-14)].
  8. Rimuovere entrambi i lobi dell'ippocampo [Figura 1 (15,16)] e sezionare con attenzione le meningi dai lobi tirando con le belle pinze. Questo passaggio consente di evitare la contaminazione della cultura finale astrociti dalle cellule meningee e fibroblasti.
  9. Trasferire i lobi dell'ippocampo preparati nel secondo piatto pieno di HBSS e riportarlo sul ghiaccio [Figura 1 (17,18)]. Pool sia dell'ippocampo lobi da un singolo mouse (P0 - P2) per la preparazione di Ipponaculture Campal astrociti. Questo dà la giusta densità astrociti. Tritare lobi dell'ippocampo usando una lama affilata chirurgico sterile (circa 4 volte).
  10. Aspirare HBSS da piatto con una punta sterile, collegato a un mL pipetta 1 e aggiungere 3 ml di 0,25% tripsina, mescolare, trasferire in un tubo conico sterili 15 ml e incubare il tessuto a 37 ° C per 20 minuti agitando delicatamente.
  11. tubo Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante con cura utilizzando una pipetta di vetro sterile, collegato a una linea di vuoto. Aggiungere 10 ml astrociti placcatura medio e triturare (20 - 30 volte) utilizzando un incendio lucidato pipetta di vetro fino a pezzi di tessuto omogeneizzare.
  12. tubo Centrifugare a 300 xg per 5 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 2 ml di mezzi astrociti placcatura preriscaldata fresco. Passare cellule attraverso un filtro a maglia 70 micron (colino cella) in un nuovo tubo da 50 ml.
  13. intera sospensione cellulare piastra su un pallone di coltura T25 sterile Poly-D-lisina / laminina rivestito contenente 3 mL dimezzi astrociti placcatura, poi incubare il pallone a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
  14. Aspirare tutta la media al giorno- I n-vitro (DIV) 1, DIV 3 e DIV 7, e sostituirlo con 2 ml di mezzi freschi astrociti placcatura. Osservare la progressione e la confluenza astrocitari sotto microscopio ottico ogni volta che durante la sostituzione del supporto astrociti placcatura.
    NOTA: A DIV 1, tutti gli astrociti vitali sono attaccati alla superficie del pallone di coltura e le cellule morte o morenti che includono i neuroni sono galleggianti nel supernatante. A DIV 3, le cellule attaccate iniziano a dividersi per formare lo strato di cellule astrociti. In assenza di condizioni favorevoli, cultura è quasi privo di crescita neuronale. A DIV 7, strato astrociti è circa 80 - 90% confluenti e pochi microglia e cellule precursori degli oligodendrociti sono presenti sulla parte superiore dello strato di astrociti.
  15. Aspirare il mezzo di placcatura dal pallone, aggiungere 2 ml di preriscaldata astrociti placcatura mezzo fresco, sciacquare unND rimuovere di nuovo a DIV 11, quando gli astrociti sono confluenti e pronti per sub coltura.
  16. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina, delicatamente ruotare il pallone un paio di volte e aspirare tripsina usando una pipetta di vetro sterile.
  17. Aggiungere 2 ml di 0,25% tripsina e lasciare che il pallone sedersi nella cappa coltura di tessuti per 4-5 minuti a temperatura ambiente.
  18. Rimuovere la tripsina e mantenere il matraccio a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 10 min. Aggiungere 5 ml preriscaldata astrociti placcatura medio e staccare lo strato di astrociti toccando il pallone contro il palmo della mano (3 - 4 volte), seguito da dolce triturazione per ottenere completo distacco e raccogliere i astrociti in un tubo da 15 ml.
  19. provetta da centrifuga a 300 xg per 5 minuti, aspirare il surnatante e aggiungere 1 ml di media astrociti fresco placcatura.
  20. Aggiungere 10 ml di sospensione cellulare per un emocitometro e contare le cellule nella grande area centrale reticolata (1 mm 2) usando un microscopio a contrasto di fase invertita (obiettivo 10X). Multiply da 10 4 per stimare il numero di cellule per ml. Un pallone T25 produrrà ~ 1 x 10 6 cellule totali dissociato. Seed ~ 1 x 10 5 cellule in 2 ml astrociti medio placcatura in 12 mm di diametro Poly-D-lisina coprioggetto vetro preverniciato nel pozzo di un piatto della cultura 24 pozzetti.
  21. Incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Eseguire OGD / Reox a DIV 12 - 14 (sezione 2).
  22. Trattare le colture di astrociti in DIV 3 con 5 mM estere metilico (LME) cloridrato L-leucina fino DIV 11 se si desiderano culture ippocampali privi di microglia. Dopo LME incubazione, culture soggetti a agitazione (300 rpm per 1 ora) per rimuovere la contaminazione microglia.
    NOTA: LME è un agente citotossico microglia che è stato ampiamente utilizzato come metodo per eliminare proliferanti microglia 22.

2. OGD / Trattamento Reox

  1. supporti Aspirare dal vetrino contenenti cultura astrociti aderente (DIV 12 - 14) e risciacquare 3 volteruotando delicatamente la cultura piatto 24 pozzetti tenendo il vetrino un paio di volte con 1 mL di soluzione isotonica OGD (pH 7,4) contenente (in mm): 0 di glucosio, 21 NaHCO 3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 CaCl 2, e 0,81 MgSO 4.
  2. Aggiungere 0,2 mL di soluzione OGD per bene per coprire il vetrino e incubare per 2 ore in un incubatore ipossico contenente il 94% N 2, 1% O 2 e il 5% di CO 2. Mescolare delicatamente con un agitatore orbitale (50 rpm) per i primi 30 min di ipossia per facilitare lo scambio di gas.
  3. Incubare le cellule di controllo normossiche per 2 h in 5% CO 2 e aria atmosferica in un buffer identica alla soluzione OGD eccetto per l'aggiunta di 5,5 mM di glucosio.
  4. Per Reox, aspirare la soluzione OGD e aggiungere 2 ml di astrociti placcatura media. Incubare in 5% CO 2 e aria atmosferica a 37 ° C per 5 ore.

3. Immunocytochemical colorazione </ P>

  1. Aspirare il terreno di coltura usando una pipetta di vetro sterile, collegato a una linea di vuoto e sciacquare rapidamente vetrino una volta con l'aggiunta di 1 ml di 0,1 M Tris Buffered Saline (TBS) (154 mM NaCl, 16 mm Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) al pozzo. Aspirare e aggiungere 2 ml di 4% paraformaldeide (PFA) in 1x tampone fosfato (PBS). Incubare per 15 minuti a RT.
  2. Aspirare e aggiungere 1 ml di 0,1 M TBS, poi posto su un agitatore a dondolo per 2 minuti. Ripetere 3 volte. Aggiungere 1 mL soluzione bloccante (10% siero di capra, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 in 0,1 M TBS) e incubare per 30 min a 37 ° C su un agitatore dondolo.
  3. Aspirare soluzione bloccante e aggiungere monoclonale primario del mouse anticorpo anti-GFAP (0,2 mL di una diluizione 1: 500 in soluzione bloccante) e policlonali di coniglio anti-S100B (1: 500) o policlonale di coniglio anti-HIF1α (1: 200) per 60 min a 37 ° C su un agitatore dondolo.
  4. In alternativa, alcuni astrociti vengono incubate con policlonale di coniglio anti-Iba1 (1: 200) e mon il mouseoclonal anti-MAP2 di accedere alla cultura purezza.
  5. Aspirare anticorpo primario e risciacquare vetrino con l'aggiunta di 1 ml di 0,1 M TBS e mettendo su un agitatore a dondolo per 2 minuti e poi aspirare. Ripetere due volte.
  6. Aggiungere 0,2 ml di una diluizione 1: 200 di capra anti-coniglio secondaria 488-coniugati e anti-topo anticorpi 568 coniugati nel bloccare soluzione per 60 min a 37 ° C su un agitatore dondolo.
  7. Aspirare anticorpo secondario e risciacquare vetrino con l'aggiunta di 1 ml di 0,1 M TBS e posto su un agitatore a dondolo per 2 minuti e poi aspirare. Ripetere due volte.
  8. Rimuovere vetrino da ben asciutta e mettendo su una diapositiva posizionato su una slide-asciugatrice. Monte vetrino su una nuova diapositiva invertendo su una sola goccia di Vectashield hardset mezzo di montaggio con DAPI (1,5 ng / mL).
  9. coprioggetto di immagine su un microscopio confocale utilizzando 20X obiettivo olio secco o 60X. Acquisire le immagini (512 x 512) per DAPI (405 nm ex / 450 nm em) e fluorocromo 488 tagged anticorpi GFAP (488 nm ex / 515 nmem). Mantenere parametri di acquisizione costanti all'interno del 20X e 60X gruppi.

4. determinazione del sesso Usando PCR

  1. Calore pup punta o ritagli di barretta a 95 ° C per 45 min a 50 mM NaOH e neutralizzare con pari volume di 1 M Tris, pH 6,8.
  2. Aggiungere 1 ml di soluzione di DNA estratto da 19 ml della seguente miscela: 5 pmoli di primer per i geni Myog e Sry, tampone di reazione 1x, 0,2 millimetri ogni deossinucleotide e 8 U Taq polimerasi.
  3. Utilizzare primer sequenze; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' e Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Eseguire il seguente protocollo PCR: 95 ° C per 3 min quindi 30 cicli di denaturazione a 95 ° C per 15 s, ricottura a 58 ° C per 15 s, e l'allungamento a 72 ° C per 1 min. Dopo questi 30 cicli, la reazione si conclude con un finale C elongazione 72 ° per 1 min.
  5. PC separatoR prodotti elettroforesi su gel di agarosio etidio bromuro contenente 2% e visualizzare sotto illuminazione UV. (Figura 2A.) ATTENZIONE! Etidio bromuro è un potenziale cancerogeno e deve essere maneggiata con cura e smaltito correttamente come da regolamento dell'istituzione.

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Representative Results

La comprensione dei ruoli delle funzioni astrociti sessuati in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche sono stati immensamente chiarito coltivando queste cellule in condizioni in vitro. L'aspetto importante di eseguire coltura sessuato è quello di determinare il sesso del cucciolo del mouse prima del suo utilizzo. Abbiamo determinato il sesso del topo geneticamente mediante PCR e dalla valutazione visiva (Figura 2) 16. La metodologia di determinazione del sesso mediante PCR è stata adottata con modifiche dal McClive e Sinclair, è veloce, semplice e altamente riproducibile metodo 23. Figura 2A mostra i risultati rappresentativi della determinazione del sesso con la PCR. I prodotti di PCR sono stati generati con il DNA estratto da due tagli rappresentativi P1 maschile e femminile coda. La reazione comprende coppie di primer multiplex per i geni Sry e Myog che generano bande specifiche maschili di 441 bp e specif femminilebande ic di 245 bp, rispettivamente. Visiva determinazione neonatale (P 1 - 3) sesso mouse con occhio nudo è stato istituito, cercando per la presenza di piccola macchia Darkened tra aperture anogenitali solo nei maschi (Figura 2b) 16,24.

Sebbene, coltura di astrociti è conveniente e relativamente facile determinare in laboratorio allestito, questo vantaggio può essere ostacolato dalla sua contaminazione principalmente microglia o neuroni in misura minore. La contaminazione degli astrociti possono essere facilmente determinata dalla immunomarcatura delle cellule in coltura con marcatori specifici delle cellule sia per microglia (Iba1) o neuroni (MAP2). Nel presente studio, sono stati osservati astrociti ippocampali crescono in colture monostrato primarie avere ~ 6% della microglia contaminanti a DIV 14, come suggerito da alcune cellule che esprimono Iba1 (Figura 3). Al contrario, nessuna delle cellule sono stati trovati per esprimere MAP2 suggerendoLa coltura è stata totalmente priva di qualsiasi contaminazione neuronale (Figura 3). La contaminazione della microglia minore osservato nelle nostre culture è in accordo con altri rapporti, in cui gli autori hanno riportato una contaminazione microglia 5% nelle loro colture primarie di astrociti corticali derivati 1-3-giorni di età cuccioli di topo 25. Gli astrociti possiedono una citoarchitettura specifico che permettono loro di rispondere ai cambiamenti nel loro microambiente tra cui ipossia. Al fine di determinare alcuna specifica risposta astrociti sesso vitro in-ischemia, abbiamo sottoposto astrociti dell'ippocampo sessuati a OGD / Reox. L'induzione di successo di OGD / Reox è stato determinato dal maggiore espressione nucleare di ipossia fattore inducibile 1 alfa (HIF1α osservato in GFAP + astrociti sottoposti a 2 ore OGD seguita da 5 h Reox rispetto alle espressioni HIF1α nelle cellule in condizioni normossiche (Figura 4 ).

(Figura 5). GFAP e S100B sono stati colocalized nei corpi citoplasma e cellulari di astrociti, che caratterizzano una fase di sviluppo astrocitaria maturata in cui queste cellule tendono a perdere la loro cellule staminali neurali (NSC) potenziale 26. La morfologia e la densità di GFAP o immunoreactivities S100B erano simili in entrambe le culture astrociti maschili e femminili come osservato nei rispettivi normossiche e gruppi di trattamento OGD / Reox. In condizioni normossiche, astrociti dell'ippocampo presentato una poligonale a fusiforme e morfologia pianeggiante [Figura 5A, B (normoxia 60X; freccia)], valutata usando la microscopia confocale. Queste cellule sono state in grado di dividere fino confluenti per circa 2 settimane prima della induzione di OGD / Reox. Dopo 2 ore e 5 OGD h Reox, astrociti esposti riatti classicive astrociti morfologia visualizzazione di processi primari retratti, l'ipertrofia del soma e processi, e una maggiore espressione di GFAP o S100B [Figura 5A, B (OGD / Reox, 60X; punta di freccia)]. Dopo la OGD / Reox, la colorazione GFAP / S100B anche esposto un ampio reticolo che si estende attraverso il citoplasma in entrambi i maschi e astrociti dell'ippocampo femminili. La mancanza di GFAP colorazione osservata negli astrociti ippocampali da topi GFAP nullo servito come controllo negativo (Figura 5B, riquadro). I risultati di cui sopra forniscono la prova diretta che la morfologia del GFAP astrociti / S100B-immunoreattive subisce variazioni significative se sottoposti a OGD-Reox.

Figura 1
Figura 1. Illustrazioni del tecnica di rimozione Hippocampal da P1 topi. 1. Decapitare cucciolo di rimuovere la testa.2, 3. Utilizzando forbici sottili, fare una incisione mediana della pelle, posteriore a anteriore e buccia indietro la pelle con l'aiuto di una TV a punta pinze. 4, 5, 6. Fare una piccola incisione alla base del cranio. Tagliare il cranio lungo la linea mediana e staccarsi due metà per esporre il cervello. 7, 8. Rimuovere cervelletto con l'aiuto di una pinza curve. 9. Rimuovere con attenzione il cervello dal cranio e posto in una piastra di Petri sterile. 10, 11. Capovolgere il cervello in modo che la superficie ventrale del cervello è rivolto verso l'alto con una pinza curva, quindi separare entrambi gli emisferi con un forte sterile lama chirurgica. 12, 13, 14. rimuovere il tessuto mesencefalo e del talamo sporgenti lasciando intatto sottostante emisfero e rivelando l'ippocampo. 15, 16. Rimuovere l'ippocampo (piccola struttura a forma di C). 17, 18. porre immediatamente i lobi di ippocampo ottenute da entrambe le emisferi in un piastra di Petri sterile separato contenente HBSS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

figura 2
Figura 2. Sesso Determinazione del topo neonato. A. Il sesso del mouse è stata geneticamente determinata mediante PCR con primer specifici per il Myog (cromosoma X) e geni Sry (cromosoma Y) utilizzando DNA estratto da ritagli di punta o della barretta (F 1; M 1). Le bande di PCR sono state visualizzate su un gel di agarosio al 2% con bromuro di etidio sotto illuminazione UV. F 2 e M 2 serviti come controlli positivi per il femminile e maschile, rispettivamente. B. Visiva determinazione del maschio dalla femmina è stato istituito con l'identificazione di un punto buio tra le aperture anogenitali (freccia).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. La purezza del mouse primario Hippocampal astrociti Cultura. Immunocolorazione della cultura astrociti con MAP2 neuronale indicatore (rosso) e marcatore microglia Iba1 (verde). I nuclei sono colorati con 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blu). La freccia indica la contaminazione microglia. Barra di scala:. 50 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. HIF1α In espressione è statastropicciati in colture di astrociti ippocampale Esposto a OGD / Reox. immagini di immunofluorescenza rappresentativi mostrano GFAP (rosso) e HIF1α (verde) etichettatura negli astrociti sottoposti a (A) normossia o OGD (B) (2 h) / Reox (5 h). I nuclei sono colorati con 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blu). Freccia, espressione basso HIF1α; Arrowhead, elevata espressione nucleare HIF1α. Barra di scala:. 25 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. up-regolazione di S100B o GFAP Espressione in culture Sexed ippocampale astrociti dopo OGD-Reox. Sessuato astrociti dell'ippocampo in coltura sono state colorate per S110b o l'espressione di GFAP in condizioni di normossia o dopo 2h OGD seguito da 5 ore di Reox (OGD / Reox). Inserto: immagine 60X dagli astrociti dell'ippocampo in coltura da GFAP topi nulli. barra della scala: 30 micron.

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Discussion

Al fine di studiare le differenze di sesso nelle proprietà e la funzione degli astrociti in condizioni fisiologiche e patologiche, la preparazione degli astrociti primari sessuati in coltura cellulare è uno strumento importante da utilizzare. Nel presente studio riportiamo un altamente efficiente e un metodo riproducibile per la cultura di una popolazione omogenea altamente arricchito di astrociti dell'ippocampo sessuati da neonato (P0-P2) C57Bl / 6 (wild type) o K19F (GFAP null) cuccioli di topo in vitro. Stabilire questa metodologia aiuta i ricercatori a comprendere le funzioni fisiologiche e patologiche di astrociti dell'ippocampo sessuati dopo ischemia in vitro.

Ci sono due fasi critiche istituisce questa metodologia incluso il mantenimento della sterilità e adeguata digestione dei lobi ippocampali durante tripsinizzazione seguita dalla triturazione del tessuto digerito per ottenere la sospensione singola cella. Prevenzione degli astrociti primari daottenere contaminati è una delle più grandi sfide in tutto il processo di coltura. Batterica e / o fungine sono due modi comuni di contaminazione che possono rendere le cellule in coltura inutile se la cura adeguata non è adottato durante l'esecuzione della tecnica. Pertanto, al fine di assicurare il successo sperimentale, è indispensabile eseguire il processo in un ambiente di lavoro sterile che comprende, disinfezione il posto di lavoro prima dell'uso, utilizzando apparecchi chirurgici sterili e materiali, evitare il contatto dei materiali sterili con superfici non sterili, utilizzando un cappa a flusso laminare e evitare di prendere palloni di coltura non ridotte fuori della cappa laminare. Inoltre, durante la dissociazione enzimatica, più lungo di incubazione del tessuto dell'ippocampo con tripsina seguito da un'ampia triturazione fisica può portare alla sua over-digestione con conseguente scarsa vitalità delle cellule e l'attaccamento inefficiente delle cellule dissociate per fiaschi di coltura.

Al contrario, underdigestion del tessuto cerebrale fornisce insufficientidissociazione delle cellule gliali quindi con conseguente scarsa resa e la semina delle cellule come grandi ciuffi. Pertanto, al fine di ottenere colture astrociti sani, è necessario ottimizzare concentrazione tripsina, tempo di incubazione e triturazione per ottenere una digestione ottimale del tessuto dell'ippocampo. Nelle nostre mani, l'incubazione di lobi dell'ippocampo con la concentrazione di lavoro del 0,25% tripsina per 20 min a RT seguita da triturazione dolce per 20 - 30 volte prodotto forte aderenti, sani e culture astrociti altamente riproducibili. Inoltre, cicli ripetuti di congelamento e scongelamento dei reagenti prima di utilizzare ogni volta che può ridurre la loro efficacia. Pertanto, è molto importante reagenti aliquote in piccole quantità desiderabili e congelamento. Ad esempio, magazzini tripsina, penicillina / streptomicina come 5 aliquote mL e siero fetale bovino come aliquote di 50 ml in numerosi tubi conici sterili a -20 ° C fino al momento dell'uso. Si consiglia di non usare antibiotici oltre la data di scadenza.

GFAP è awmarker di astrociti fibrosi reattivi ell-caratterizzato. A seguito di OGD / Reox, upregulation di espressione GFAP in risposta a astrogliosi reattiva stato segnalato 20. Anche se, è stato proposto che GFAP sovraespressione potrebbe essere utilizzato come obiettivo specifico per le strategie di riparazione neuronale 27 il suo ruolo nel danno dell'ippocampo dopo HI nei neonati è ancora chiaro. La colorazione immunoistochimica degli astrociti con GFAP ci consente di identificare e caratterizzare queste cellule in condizioni fisiologiche e patologiche. GFAP colorazione come qualsiasi altro marcatore ha alcune limitazioni che devono essere riconosciuti. Uno dei limiti della colorazione GFAP degli astrociti è che non tutti gli astrociti esprimono GFAP in condizioni fisiologiche. In particolare il tasso di astrociti espressione immatura di GFAP non supera il 40% in condizioni fisiologiche 28. A seconda dell'utilizzo età e tipo specifico di astrociti, altri marcatori di scelta possono essere considerati come GLAST, ALDH1L1, BLBP, Aquaporin-4 e S100B 29.

Inoltre, la presenza di NSC travestito da astrociti nelle colture primarie non può essere esclusa. hanno dimostrato Questi NSC per presentare le caratteristiche fenotipiche e ultrastrutturali simile a maturare astrociti, tra cui l'espressione di GFAP. Pertanto, l'identificazione di marcatori molecolari che sono specifici per gli astrociti completamente differenziate e maturati è un must. Gli astrociti sono stati segnalati per espresso S100B nei loro stadi di sviluppo in seguito completamente differenziate. Recentemente, è stato riportato che neonatale corticale GFAP + astrociti perdono il loro progenitore potenziale delle cellule staminali con l'inizio di espressione S100B che accadono intorno DIV 15 26. Allo stesso modo, nelle nostre condizioni di coltura in DIV 14, 91% di cellule che esprimono GFAP sono risultati coesprimere S100B, che suggeriscono che le culture sono costituiti da principalmente terminalmente differenziate astrociti dell'ippocampo maturati.

È quasi impossibile ottenere colture pure primaria astrociti dell'ippocampo totalmente privi di contaminanti cellule microgliali che risiedono sopra e sotto il monostrato astrociti. Pertanto, è importante conoscere la percentuale di contaminanti microglia in culture astrogliali e anche per mantenere questa proporzione più basso possibile. Nel presente studio abbiamo macchiato culture astrociti con microglia specifico Iba1 marcatore o neuronale MAP2 marcatore al fine di determinare la presenza di eventuali cellule microgliali o neuroni come potenziali contaminanti. La percentuale di microglia in coltura astrociti roditori può variare da 1% al 30% a seconda di diversi fattori che includono l'età degli animali, specie, regione, terreno di coltura, il metodo subcoltura e scuotendo 30. Nelle nostre culture abbiamo osservato circa il 6% di contaminazione microglia che è paragonabile con altri rapporti 25. Se l'uso previsto della cultura astrociti è quello di studiare il ruolo degli astrociti dell'ippocampo nell'infiammazione è imperativoper trattare le colture con 5 mM LME per 10 d per eliminare eventuali contaminazioni microglia nelle culture astrociti partire dal DIV 3. LME è un agente citotossico microglia che è stato ampiamente utilizzato come metodo per rimuovere proliferanti microglia 20,22. Inoltre, culture LME trattati devono essere sottoposti ad un protocollo scuotimento (300 rpm per 1 h).

Un'altra sfida tecnica nell'esecuzione OGD / Reox è determinare se un grado sufficiente di ipossia è stato raggiunto per indurre astrogliosis. Marcatori per ipossia negli astrociti comprendono l'up-regolazione di GFAP e l'induzione di HIF-1α. Così, in questo studio ipossia è stato confermato dall'incremento delle GFAP immunoreattività (dati non mostrati) e la sovraregolazione di HIF1-α colorazione (Figura 4).

In sintesi, i risultati ottenuti da sessuati neonatali culture astrociti dell'ippocampo hanno dimostrato attaccamento cellulare di successo con sano astrociti omogeneo strato didivaricazione tipica morfologia su vetrini e l'espressione del principale reattiva astrociti GFAP marcatori e S100B dopo induzione di ischemia in vitro. Noi crediamo che il protocollo adottato qui ha il potenziale per rispondere a importanti domande meccanicistici e traslazionale relativi al ruolo degli astrociti nello sviluppo di cervelli maschili e femminili. L'intera procedura di coltura rispetto alla maggior parte delle tecniche esistenti genera astrociti ippocampali maturi e confluenti sessuato in due settimane, garantendo una rapida inversione di esperimenti e la semplicità della tecnica faciliterà l'uso del metodo di coltura astrociti come strumento per studiare sesso ruolo specifico di cellule gliali nello sviluppo cerebrale consentendo in tal modo la sua ampia diffusione nella ricerca sul cervello.

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Disclosures

Nessuno degli autori sono in competizione o interessi in conflitto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

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Le differenze di sesso in ippocampali di topo astrociti dopo<em&gt; In-Vitro</em&gt; Ischemia
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Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

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