Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kjønnsforskjeller i Muse Hippokampale Astrocytter etter Published: October 25, 2016 doi: 10.3791/53695
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1,3, 1,3
1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

Summary

Astrocytter er en av de viktigste nøkkelspillere i sentralnervesystemet (CNS). Her rapporterer vi en praktisk metode for sexed hippocampus astrocyte kultur protokoll for å studere mekanismene bak astrocyte funksjon i mannlige og kvinnelige nyfødte valper etter in vitro iskemi.

Abstract

Astrogliosis følgende hypoksi / iskemi (HI) -relaterte hjerneskade spiller en rolle i økt sykelighet og dødelighet hos nyfødte. Nyere kliniske studier indikerer at graden av hjerneskade synes å være sex avhengig, og at de mannlige nyfødte er mer utsatt for virkningene av HI-relaterte hjerneskade, noe som resulterer i mer alvorlige nevrologiske utfall sammenlignet med kvinner med tilsvarhjerneskader. Utviklingen av pålitelige metoder for å isolere og opprettholde høyanriket populasjoner av sexed hippocampus astrocytter er viktig å forstå den cellulære grunnlag av kjønnsforskjeller i de patologiske konsekvenser av neonatal HI. I denne studien, beskriver vi en fremgangsmåte for å lage kjønnsspesifikke hippocampus astrocyttkulturer som er utsatt for en modell for in-vitro-ischemi, oksygen-glukosemangel, etterfulgt av reoksygenering. Etterfølgende reaktiv astrogliosis ble undersøkt av immunostaining for Glial Fibrillary Surt Protein (GFAP) og S100B. Denne metoden gir et nyttig verktøy for å studere rollen til hann- og hunn hippocampus astrocytter følgende neonatal HI, hver for seg.

Introduction

Astrocytter er en av de viktigste nøkkelspillere i sentralnervesystemet (CNS). Økende bevis indikerer at rollene som astrocytter er mer enn å gi nevronale støtte. Faktisk kan rollene til astrocytter under fysiologiske betingelser være meget komplekse, for eksempel styring av migrasjon av utviklings aksoner 1, regulerer CNS blodstrøm 2, å opprettholde pH homeostase av den synaptiske interstitiell væske 3, og som deltar i blod-hjerne-barrieren 4 og synaptisk transmisjon fem. Under patologiske tilstander, astrocytter svare på skade med en prosess som kalles reaktiv astrogliosis hvori morfologien, antall, plassering, topografi (med hensyn til avstand fra fornærmelse) og funksjon av astrocyttene kan endre seg i en heterogen måte 6,7. Astrogliosis sett følgende neonatal hypoksisk iskemisk encefalopati kanskje bidrar til sykelighet og dødelighet av nyfødte

Nylige kliniske og eksperimentelle studier indikerer at graden av hjerneskade synes å være kjønnsavhengig, og at de mannlige nyfødte er mer utsatt for virkningen av hypoksi / ischemi (HI) -relaterte hjerneskade, noe som resulterer i mer alvorlige nevrologiske utfall sammenlignet kvinner med sammenlignbare hjerneskader 9-11. Selv om lokalisering av skaden er avhengig av fosterets alder og varigheten og alvorlighetsgraden av fornærmelse, er hippocampus en av de mest vanlig bevirkes områder i CNS etter betegnelsen neonatal HI, og økt hippocampus astrogliosis er blitt bekreftet ved oppregulering av den Glial Fibrillary Surt Protein (GFAP) 3 d etter neonatal HI 7,10,12,13. Kjønnsforskjeller i astrocyte funksjon ble vist i både nyfødte og voksne gnagere etter cerebral iskemi 14,15. I tillegg ble hann astrocytic mottakelighet for in-vitro-ischemi vist ved øket cell død sammenlignet med kvinnelige kortikale astrocytter i kultur 16.

Kjønnsforskjeller start in-utero og fortsetter til døden 17. I løpet av det siste tiåret, har betydningen av å inkludere kjønnene i eksperimentelle forhold i cellekultur og i-vivo studier vært vektlegging av Institute of Medicine og NIH til å søke grunnleggende kunnskap i kjønnsforskjeller sett i fysiologiske og patologiske tilstander 17,18 . Utvikling av pålitelige metoder for å isolere og opprettholde bestandene av sexed hippocampus astrocytter er viktig å forstå den cellulære grunnlag av kjønnsforskjeller i de patologiske konsekvenser av neonatal HI. Denne studien er designet for å gi teknikker for å forberede beriket kjønnsspesifikke hippocampus astrocyttkulturer fra nyfødte mus for å vurdere rollene til GFAP-immunoreaktive astrocytter følgende Oxygen / glukose deprivasjon (OGD) og Reoksygeneringen (Reox), indusereHI i cellekultur miljø. Denne teknikken kan brukes til å teste en hvilken som helst hypotese med hensyn til hippocampus-astrocytter i neonatale hanner og hunner i henhold til normoksisk og iskemiske tilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Denne studien ble gjennomført i samsvar med anbefaling fra Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr i National Institute of Health. Dyret protokollen ble godkjent av University of Wisconsin-Madison, Institutional Animal Care og bruk komité. Primær astrocyte Kultur protokoll som er presentert her er adoptert fra protokollene som presenteres av Zhang Y 19 mfl. Og Cengiz P 20 mfl. Med noen modifikasjoner.

1. hippocampus Dissection og astrocyte Kultur

  1. Forbered alle nødvendige reagenser og materialer, inkludert kirurgiske sakser, glatte fine tang, flate spissen tang, papirhåndklær, søppelpose, 70% etanol og 2 dissekere retter (3,5 cm diameter) på is fylt med 2 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) hver . Kontroller at kirurgisk utstyr er er sterile (autoklav) før prosedyren og bruke alle andre materialer (astrocyte plating medium: DMEM + 5% hesteserum +1% penicillin-streptomycin, hesteserum, HBSS, 0,25% trypsin, dekkglass, petriskåler, 15/50 ml rør, T25 kolber, etc.) som pre-sterile.
  2. Hold og spray hodet og nakken av mus valp med 70% etanol og halshogge bruker skarpe steril saks [Figur 1 (1)].
  3. Utfør en midtlinjen snitt fra bakre til fremre skalle med liten saks langs hodebunnen å utsette hjernen [Figur 1 (2-3)].
  4. Skjær kraniet nøye fra nakken til nesen med liten saks. Deretter skar kraniet anterior til olfactory pærer og dårligere enn lillehjernen å koble kraniet fra skallebasis.
  5. Lag et lite snitt i bunnen av hodeskallen og skjær langs midtlinjen. Bruk sterile flat-tip pinsett til å skrelle bort skallen. Fjern hjernestammen ved hjelp av en buet tang. Fjern hjernen fra kraniet og legg inn den første dissekere fatet [Figur 1 (4-9)] 21.
  6. Ved hjelp av en buet pinsett, snu hjernen slik at ventral overflaten av hjernen vender opp og deretter skille begge halvkuler med en skarp steril kirurgisk kniv [Figur 1 (10,11)]
  7. Skrell tilbake hjernehemisfærene og fjern forsiktig svulmende midthjernen og thalamic vev med sterile flat buet pinsett til å avsløre hippocampus, en liten, sjøhest-formet struktur i den mediale tinninglappen [Figur 1 (12-14)].
  8. Fjern begge de hippocampus lapper [Figur 1 (15,16)] og nøye dissekere hjernehinnene fra lappene ved å trekke med de fine tang. Dette trinnet unngår forurensning av det endelige astrocytt kulturen ved meningeale celler og fibroblaster.
  9. Overfør forberedt hippocampus fliker inn i andre fatet fylt med HBSS og returnere den på is [Figur 1 (17,18)]. Pool både hippocampus lappene fra et enkelt muse (P0 - P2) for utarbeidelse av flodhestcampal astrocyttkulturer. Dette gir astrocytt riktig tetthet. Hakke hippocampus fliker ved hjelp av en skarp steril kirurgisk kniv (ca. 4 ganger).
  10. Aspirer HBSS fra fatet ved hjelp av en steril spiss festet til en 1 ml pipette og tilsett 3 ml av 0,25% trypsin, bland, overføring til et 15 ml sterilt konisk rør og inkuber i vevet ved 37 ° C i 20 minutter med forsiktig risting.
  11. Sentrifugerør ved 300 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten forsiktig ved anvendelse av en steril pipette glass festet til en vakuumledning. Tilsett 10 ml astrocyte plating medium og triturate (20 - 30 ganger) med en brann polert glass pipette til vev stykker homogen.
  12. Sentrifugerør ved 300 xg i 5 minutter. Aspirer supernatanten og tilsett 2 ml fersk prewarmed astrocyte plating media. Pass celler gjennom en 70 pm sikt filter (celle sil) i en ny 50 ml konisk tube.
  13. Plate hele cellesuspensjon på en Poly-D-lysin / Laminin belagt steril T25 kulturflaske inneholdende 3 ml avastrocyttkulturer Plating media, deretter inkuberes kolben ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
  14. Sug hele medie på dag- i n-vitro (DIV) 1, DIV 3 og DIV 7, og erstatte med 2 ml fersk astrocyttkulturer plating media. Observer progresjon og astrocytic samløpet henhold lysmikroskop hver gang mens erstatte astrocyte plating media.
    NB: I en DIV, er alle levedyktige astrocytter festet til overflaten av kulturen kolbe, og de døde eller døende celler som inkluderer neuroner er flytende i supernatanten. Ved DIV 3, de vedlagte cellene begynner å dele seg for å danne astrocytic cellelaget. I fravær av de støttende forhold, er kulturen nesten blottet for enhver neuronal vekst. Ved DIV 7, er astrocytt lag ca. 80 - 90% konfluens og noen mikroglia samt oligodendrocytt forløpercellene er tilstede på toppen av astrocytic lag.
  15. Aspirer plating medium fra kolbe, tilsett 2 ml fersk prewarmed astrocyte plating medium, skyll ennd fjerne igjen ved DIV 11, når astrocytter er flytende og klar for sub dyrkning.
  16. Tilsett 2 ml 0,25% trypsin, forsiktig rotere flasken et par ganger og aspirer trypsin med en steril glass pipette.
  17. Tilsett 2 ml av 0,25% trypsin og la kolben sitter i vevskultur hetten i 4 - 5 min ved RT.
  18. Fjern det trypsin og holde kolben ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 10 min. Tilsett 5 ml forvarmet astrocyte plating medium og løsne astrocytic lag ved å trykke på flasken mot håndflaten din (3 - 4 ganger), etterfulgt av mild finmaling å oppnå fullstendig løsrivelse og samle astrocytter i en 15 ml konisk tube.
  19. Sentrifugerør ved 300 xg i 5 minutter, aspirer supernatanten, og tilsett 1 ml friskt astrocytt pletteringsmedium.
  20. Tilsett 10 ul av cellesuspensjonen til et hemocytometer, og telle cellene i det store sentrale gitterområdet (1 mm 2) ved hjelp av et invertert fasekontrastmikroskop (10X objektiv). Multiply ved 10 4 for å beregne antall celler pr ml. En T25 kolbe vil gi ~ 1 x 10 6 totalt dissosiert celler. Seed ~ 1 x 10 5 celler i 2 ml astrocytt pletteringsmedium på en 12 mm diameter Poly-D-lysin forbelagte glass dekkglass i brønnen på en 24-brønners dyrkningsskål.
  21. Inkuber ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Utfør OGD / Reox på DIV 12-14 (§ 2).
  22. Behandle astrocyttkulturer på DIV 3 med 5 mM L-leucin Methyl Ester (LME) hydroklorid til DIV 11 hvis hippocampus kulturer blottet for microglia er ønsket. Etter LME inkubasjon til lagt kulturer til risting (300 rpm i 1 time) fjerne forurensende microglia.
    MERK: LME er en microglial cytotoksisk middel som har blitt brukt mye som en metode for å eliminere voksende microglia 22.

2. OGD / Reox Treatment

  1. Sug media fra dekk inneholder tilhenger astrocyte kultur (DIV 12 - 14) og skyll 3 gangerved forsiktig rotering av 24-brønners kulturskål som holder dekk et par ganger med 1 ml isoton OGD oppløsning (pH 7,4) inneholdende (i mM): 0-glukose, 21 NaHCO3, 120 NaCl, 5,36 KCl, 0,33 Na2 HPO 4, 0.44 KH 2PO 4, 1,27 CaCl2, og 0,81 MgSO4.
  2. Legg 0,2 ml OGD løsning til godt å dekke dekkglass og inkuberes i 2 timer i et hypoksisk inkubator inneholdende 94% N 2, 1% O 2, og 5% CO2. Bland forsiktig med en orbital shaker (50 rpm) for de første 30 min av hypoksi å lette gassutveksling.
  3. Inkuber normoksisk kontrollceller i 2 timer i 5% CO2 og atmosfærisk luft i en buffer identisk med OGD løsning bortsett fra tilsetningen av 5,5 mM glukose.
  4. For Reox, aspirer OGD løsning og tilsett 2 ml astrocyte plating medium. Inkuber i 5% CO2 og atmosfærisk luft ved 37 ° C i 5 timer.

3. immunocytokjemisk Farging </ P>

  1. Aspirer kulturmedia ved hjelp av en steril glass pipette festet til en vakuumlinje og raskt å skylle dekk gang ved å tilsette 1 ml av 0,1 M Tris-buffret saltvann (TBS) (154 mM NaCl, 16 mM Trizma Base, 84 mM Tris-HCl, pH 7,4) til brønnen. Aspirer og tilsett 2 ml av 4% paraformaldehyd (PFA) i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Inkuber i 15 min ved RT.
  2. Aspirer og tilsett 1 ml 0,1 M TBS, og sett på en gynge shaker for 2 min. Dette gjentas 3 ganger. Tilsett 1 ml blokkeringsløsning (10% geiteserum, 10 mg / ml BSA, 0,025% Triton X-100 i 0,1 M TBS) og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C på en gynge shaker.
  3. Aspirer blokkeringsløsning og legge til primær mus monoklonalt anti-GFAP-antistoff (0,2 ml av en 1: 500 fortynning i blokkeringsløsning) og kanin-polyklonalt anti-S100B (1: 500) eller kanin polyklonalt anti-HIF1α (1: 200) i 60 min ved 37 ° C på en gynge shaker.
  4. Alternativt er noen astrocytter inkubert med kanin polyklonalt anti-IBA1 (1: 200) og mus Manoclonal anti-MAP2 å få tilgang til kultur renhet.
  5. Aspirer primært antistoff og skyll dekkglass ved å tilsette 1 ml av 0,1 M TBS og plassere på en gynge ryster i 2 minutter og så aspirere. Gjenta to ganger.
  6. Legg 0,2 ml av en 1: 200 fortynning av de sekundære geite-anti-kanin-488-konjugert anti-mus og 568-konjugerte antistoffer i blokkeringsløsning i 60 minutter ved 37 ° C på en gynge shaker.
  7. Aspirer sekundære antistoff og skyll dekkglass ved å tilsette 1 ml av 0,1 M TBS og sted på en gynge ryster i 2 minutter og så aspirere. Gjenta to ganger.
  8. Fjern dekkglass fra brønn og tørr ved å plassere på et lysbilde plassert på en slide-tørrere. Mount dekkglass på et nytt lysbilde ved å snu på en eneste dråpe Vectashield hardset montering medium med DAPI (1,5 ng / mL).
  9. Bildedekk på et konfokal mikroskop ved hjelp av enten 20X tørr eller 60X olje målet. Hente bilder (512 x 512) for DAPI (405 nm ex / 450 nm em) og fluorochrome 488 tagget GFAP antistoff (488 nm ex / 515 nmem). Hold oppkjøp parametre konstant i 20X og 60X grupper.

4. Sex Fastsettelse Bruke PCR

  1. Varme pup tå eller finger avklippet gress ved 95 ° C i 45 minutter i 50 mM NaOH og nøytralisere med like stort volum av 1 M Tris, pH 6,8.
  2. Tilsett 1 mL av det ekstraherte DNA oppløsningen til 19 ul av følgende blanding: 5 pmol av primerne for Myog og SRY gener, 1x reaksjonsbuffer, 0.2 mM av hver deoksynukleotid og 8 U Taq-polymerase.
  3. Bruk grunning sekvenser; Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3 ', 5'CATGACCACCACCACCACCAA3' og Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3 ', 5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3' 23.
  4. Utfør følgende PCR-protokoll: 95 ° C i 3 minutter og deretter 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder, annealing ved 58 ° C i 15 s, og forlengelse ved 72 ° C i 1 min. Etter dette 30 sykluser, avslutter reaksjonen med en avsluttende 72 ° C forlengelse i 1 min.
  5. separat PCR-produkter elektroforetisk på en etidiumbromid-inneholdende 2% agarosegel og visualisere under UV-belysning. (Figur 2A.) OBS! Etidiumbromid er et potensielt kreftfremkallende og må håndteres med forsiktighet og kastes på forsvarlig måte i henhold til institusjonens bestemmelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Forstå roller kjønnede astrocyttkulturer fungerer under fysiologiske eller patofysiologiske tilstander har blitt umåtelig belyst ved å dyrke disse cellene under in vitro betingelser. Det viktige aspektet med å utføre seksuelle dyrkning, er å bestemme kjønn av musen pup før bruk. Vi har fastslått kjønn på mus genetisk ved PCR og ved visuell vurdering (figur 2) 16. Metodikken for kjønnsbestemmelse ved hjelp av PCR ble vedtatt med endringer fra McClive og Sinclair, er rask, enkel og reproduserbar metode 23. Figur 2A viser representative resultatene av kjønnsbestemmelse ved hjelp av PCR. PCR produktene ble generert med DNA hentet fra to representative P1 mannlige og kvinnelige hale klipp. Reaksjonen omfatter multipleksede primerpar for SRY og Myog gener som genererer mannlige spesifikke band av 441 bp og kvinnelige specific bånd av 245 bp, respektivt. Visuell bestemmelse av neonatal (P 1-3) mus sex med blotte øye ble etablert ved å se etter om det er liten Darkened sted mellom anogenitale åpninger bare hos menn (figur 2B) 16,24.

Selv om dyrkning av astrocytter er enkel og forholdsvis lett å etablere ved laboratoriete satt opp, kan denne fordel bli hindret av dets forurensning primært med mikroglia eller nevroner i mindre grad. Forurensning av astrocytter kan lett bestemmes ved immunolabeling av de dyrkede celler med celle spesifikke markører for enten mikroglia (IBA1) eller nevroner (MAP2). I den foreliggende undersøkelse, ble hippocampus astrocytter som vokser i primære monolagskulturer observert å ha ~ 6% av forurensende mikroglia ved DIV 14, som foreslått av noen få celler som uttrykte IBA1 (figur 3). På den annen side ble ingen av cellene funnet å uttrykke MAP2 tyderkultur var fullstendig blottet for enhver neuronal forurensning (figur 3). Den mindre microglial forurensning observert i våre kulturer er i tråd med andre rapporter, hvor forfatterne rapporterte en 5% microglial forurensning i sine primære kortikale astrocyttkulturer avledet 1-3 dager gamle museunger 25. Astrocytter har en bestemt cytoarchitecture som tillater dem å svare på endringer i mikromiljøet inkludert hypoksi. For å finne ut hvilken som helst sex bestemt astrocytic respons på in-vitro iskemi, vi utsatt kjønnede hippocampus astrocytter til OGD / Reox. Vellykket induksjon av OGD / Reox ble bestemt ved den økede atom ekspresjon av hypoksi induserbar faktor 1 alfa (HIF1α observert i GFAP + astrocytter som utsettes for 2 timer OGD etterfulgt av 5 h Reox i forhold til de HIF1α uttrykk i celler under normoksisk forhold (Figur 4 ).

(figur 5). GFAP og S100B ble colocalized i cytoplasma og celle likene av astrocytter, karakteriserer en modnet astrocytic utviklingsstadiet hvor disse cellene har en tendens til å miste sin Neural Stem Cell (NSC) potensial 26. Den morfologi og tetthet av GFAP eller S100B immunoreaktivitetene var lik i både mannlige og kvinnelige astrocyttkulturer som observert i sine respektive normoksiske og OGD / Reox behandlingsgruppene. Under normoksisk forhold, hippocampus astrocytter presentert en polygonal til fusiform og flat morfologi [Figur 5A, B (normoxia 60X; pil)], som evalueres ved hjelp av konfokal mikroskopi. Disse cellene var i stand til å dele inntil konfluens i omtrent to uker før induksjon av OGD / Reox. Etter to timer OGD og 5 h Reox, astrocytter utstilt klassiske Reactive astrocyte morfologi viser tilbaketrukne primære prosesser, hypertrofi av soma og prosesser, og økt uttrykk av GFAP eller S100B [Figur 5A, B (OGD / Reox, 60X, pilspiss)]. Etter den OGD / Reox, den GFAP / S100B farging oppviste også en omfattende nettvaren som strekker seg på tvers av cytoplasmaet i både hann- og hunn hippocampus astrocytter. Mangel på GFAP farging observert i de dyrkede hippocampale astrocytter fra GFAP null mus tjente som en negativ kontroll (figur 5B, innfelt). Ovennevnte Resultatene gir direkte bevis for at morfologi av GFAP / S100B-immunoreaktive astrocytter gjennomgår betydelige endringer når det utsettes for OGD-Reox.

Figur 1
Figur 1. Illustrasjoner av hippocampus Removal Technique fra P1 Mus. 1. Halshogge valp å fjerne hodet.2, 3. Ved hjelp av fin saks, lage et midtlinje innsnitt i huden, for å bakre fremre og skallet tilbake på huden ved hjelp av en flat tang. 4, 5, 6. Lag et lite innsnitt i bunnen av hodeskalle. Skjær skallen langs midtlinjen og skrelle bort to halvdeler å avsløre hjernen. 7, 8. Fjern lillehjernen ved hjelp av en buet pinsett. 9. Fjern forsiktig hjernen fra kraniet og sted i en steril petriskål. 10, 11. Vend hjernen slik at ventral overflaten av hjernen vender opp ved hjelp av en buet tang, deretter skille begge halvkuler med en skarp steril kirurgisk kniv. 12, 13, 14. Fjern svulmende midthjernen og thalamic vev forlater intakt underliggende halvkule og avslørende hippocampus. 15, 16. Ta av hippocampus (liten C-formet struktur). 17, 18. Umiddelbart hippocampus lapper innhentet fra begge de halvkuler i en separat petriskål med sterile HBSS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Sex Fastsettelse av Neonatal Mus. A. Mus sex var genetisk bestemt ved PCR med primere som er spesifikke for Myog (X-kromosom) og Sry (Y-kromosom) gener ved hjelp av DNA ekstrahert fra finger eller tå utklipp (F 1; M 1). Båndene av PCR ble visualisert på en 2% agarosegel med etidiumbromid under UV-belysning. F 2 og M 2 tjente som positive kontroller for kvinnelige og mannlige, henholdsvis. B. Visuell bestemmelse av mannlige fra kvinnelige ble etablert ved å identifisere et mørkt sted mellom anogenitale åpninger (pil).urce.jove.com/files/ftp_upload/53695/53695fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Purity av muse hippocampus astrocyte kultur. Farging av astrocyte kultur med neuronal markør MAP2 (rød) og microglia markør IBA1 (grønn). Kjerner er farget med 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). Pil viser microglia forurensning. Skala:. 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. HIF1α Expression Var Ibrettet i Cultured hippocampus Astrocytter Utsatt for OGD / Reox. Representative Immunofluorescent bilder som viser GFAP (rød) og HIF1α (grønn) merking i astrocytter utsatt for (A) normoxia eller (B) OGD (2 h) / Reox (5 t). Kjerner er farget med 4 ', 6'-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (blå). Arrow, lav HIF1α uttrykk; pilspiss, forhøyet HIF1α atom uttrykk. Skala:. 25 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. oppregulering av S100B eller GFAP Expression i sexed hippocampus astrocyttkulturer følgende OGD-Reox. Sexed dyrkede hippocampus astrocytter ble farget for S110b eller GFAP til uttrykk under normoksisk forhold eller etter 2h OGD fulgt av 5 h Reox (OGD / Reox). Innfelt: 60X bilde fra hippocampus astrocytter dyrket fra GFAP null mus. Skala: 30 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å studere kjønnsforskjeller i egenskaper og funksjon av astrocytter under fysiologiske og patologiske tilstander, utarbeidelse av kjønnede primære astrocytter i cellekultur er et viktig verktøy for å utnytte. I denne studien rapporterer vi en svært effektiv og reproduserbar metode for å kultur et høyanriket homogen befolkning på kjønnede hippocampus astrocytter fra nyfødt (P0-P2) C57Bl / 6 (villtype) eller K19F (GFAP null) museunger in vitro. Etablering av denne metodikken hjelper etterforskerne forstå de fysiologiske og patologiske funksjoner av kjønnede hippocampus astrocytter etter in vitro iskemi.

Det er to viktige trinn i å etablere denne metoden inkluderer opprettholdelse av sterilitet og tilstrekkelig fordøyelse av hippokampale fliker ved trypsinering, etterfulgt av triturering av det fordøyde vevet for å oppnå en enkel cellesuspensjon. Forebygging av primære astrocytter frablir forurenset er en av de største utfordringene i hele dyrkningsprosessen. Bakteriell og / eller sopp er to vanlige former for forurensning som kan gjengi de dyrkede celler ubrukelig hvis riktig behandling er ikke tatt i bruk mens du utfører teknikken. Derfor, for å sikre eksperimentell suksess, er det viktig å utføre prosessen i henhold til et sterilt arbeid innstilling som omfatter, desinfisering arbeidsplassen før bruk, ved hjelp av steril kirurgisk utstyr og materialer, unngå kontakt av sterile materialer med ikke-sterile flater, ved hjelp av en Laminar Flow hette og unngå å ta uncapped kulturflasker ut av laminær panseret. I tillegg, under enzymatisk dissosiasjon, kan lengre inkubasjon av hippokampalt vev med trypsin, etterfulgt av omfattende fysisk triturering fører til sin over-fordøyelse resulterer i dårlig celleviabilitet og ineffektiv festing av dissosierte celler til kulturflasker.

Tvert imot, underdigestion av hjernevevet gir utilstrekkeligdissosiasjon av gliaceller og dermed resulterer i dårlig utbytte og såing av celler som store klumper. Derfor, for å oppnå friske astrocyttkulturer, er det nødvendig å optimalisere trypsin konsentrasjon, inkubasjonstid og maling for å oppnå optimal fordøyelse av hippokampalt vev. I våre hender, inkubering av hippokampale fliker med arbeidskonsentrasjon på 0,25% trypsin i 20 minutter ved romtemperatur, etterfulgt av forsiktig triturering i 20 - 30 ganger ga sterk vedheftende, sunne og meget reproduserbare astrocyttkulturer. Dessuten gjentatt frysing og tining av reagenser før bruk, hver gang kan redusere deres effektivitet. Derfor er det svært viktig å alikvote reagenser i små ønskelig mengder og fryse. For eksempel, lagre trypsin, penicillin / streptomycin som 5 ml porsjoner og føtalt bovint serum som 50 ml alikvoter i en rekke sterile koniske rør ved -20 ° C inntil bruk. Vi anbefaler ikke å bruke antibiotika etter utløpsdatoen.

GFAP er awell-preget markør av reaktive fiber astrocytter. Etter OGD / Reox, oppregulering av GFAP uttrykk som svar på reaktiv astrogliosis har blitt rapportert 20. Selv om det har blitt foreslått at GFAP overekspresjon kan brukes som spesifikt mål for neuronal reparasjonsstrategier 27 dens rolle i hippocampal skade etter HI hos nyfødte er fortsatt uklart. Immunhistokjemisk farging av astrocytter med GFAP gjør oss i stand til å identifisere og karakterisere disse cellene under fysiologiske og patologiske tilstander. GFAP farging som enhver annen markør har noen begrensninger som trenger å bli gjenkjent. En av begrensningene i den GFAP farging av astrocytter er at ikke alle astrocytter uttrykker GFAP under fysiologiske betingelser. Spesielt umoden astrocytt ekspresjon pr GFAP ikke overstiger 40% under fysiologiske betingelser 28. Avhengig av alders- og typespesifikk bruk av astrocytter, kan andre markører for valg betraktes som GLAST, ALDH1L1, BLBP, aquaporin-4 og S100B 29.

Videre nærvær av NSCs forkledd som astrocytter i primærkulturer ikke kan utelukkes. Disse NSCs har vist seg å presentere fenotypiske og ultrastrukturelle karakteristika som ligner på modne astrocytter, inkludert ekspresjonen av GFAP. Derfor er identifisering av molekylære markører som er spesifikke for fullt differensierte og modnet astrocytter et must. Astrocytter ble rapportert å uttrykte S100B på sine senere fullt differensierte utviklingsstadier. Nylig har det blitt rapportert at neonatal kortikale GFAP + astrocytter miste sin progenitor stamcelle potensial med begynnelsen av S100B uttrykk som skjer rundt DIV 15 26. På samme måte, i våre kulturbetingelser ved DIV 14, ble 91% av GFAP uttrykkende celler funnet å coexpress S100B, som tyder på at kulturene består av primært terminalt differensiert modnet hippocampus astrocytter.

Det er nesten umulig å få tak i rene primære hippocampale astrocyttkulturer fullstendig blottet for forurensende mikrogliale celler som befinner seg over og under astrocytt monolaget. Derfor er det viktig å vite hvor stor andel av forurensende mikroglia i astroglial kulturer og også for å holde dette forhold så lavt som mulig. I den foreliggende undersøkelse farget vi astrocyttkulturer med mikroglia spesifikk markør IBA1 eller neuronal markør MAP2 for å bestemme nærværet av eventuelle mikroglia eller neuroner som potensielle forurensninger. Andelen av mikroglia i gnager astrocytt kulturen kan variere fra 1% til 30% avhengig av flere faktorer som inkluderer dyr alder, arter, region, kulturmedium, subdyrking fremgangsmåte og risting 30. I våre kulturer observerte vi ca 6% av microglial forurensning som kan sammenlignes med andre rapporter 25. Hvis den tilsiktede bruk av den astrocytt kulturen er å studere rollen til hippocampus astrocytter i betennelse er det viktigtil behandling av kulturene med 5 mM LME for 10 d for å eliminere mulig microglial forurensning i de astrocyttkulturer starter fra DIV 3. LME er en microglial cytotoksisk middel som har vært brukt i stor utstrekning som en metode for å fjerne former mikroglia 20,22. I tillegg bør LME-behandlede kulturer bli utsatt for en riste protokoll (300 rpm i 1 time).

En annen teknisk utfordring i å utføre OGD / Reox er å avgjøre om en tilstrekkelig grad av hypoksi er oppnådd for å indusere astrogliosis. Markører for hypoksi i astrocytter omfatter oppregulering av GFAP og induksjon av HIF-1α. Derfor, i denne studien hypoksi ble bekreftet ved økningen i GFAP immunoreaktivitet (data ikke vist) og oppregulering av HIF1-α farging (figur 4).

Oppsummert resultatene oppnådd fra kjønnede neonatale hippocampus astrocyttkulturer viste vellykket celle vedlegg med sunn homogen astrocyte lag diutspiling typiske morfologi på dekkglass, og ekspresjonen av det store reaktive astrocytic markører GFAP og S100B ved induksjon av in-vitro-ischemi. Vi tror at protokollen vedtatt her har potensial til å svare viktige mekanistiske og translasjonelle spørsmål vedrørende rollen til astrocytter i utviklingen av mannlige og kvinnelige hjerner. Hele dyrking prosedyre i motsetning til flertallet av eksisterende teknikker genererer modne og sammenflytende sexed hippocampus astrocytter i to uker, gi en rask behandlingstid av eksperimenter og enkelhet av teknikken vil lette bruken av astrocytic dyrking metode som et verktøy for å studere kjønn spesifikke rollen gliaceller i utviklingen av hjernen og dermed lar sin bred spredning i hjerneforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen av forfatterne har konkurrerende eller motstridende interesser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Astrocyte culture media
DMEM, high glucose cellgro 10-013-CV
Horse Serum Gibco 26050-070 Final Concentration: 10%
Penicillin-Streptomycin Cellgro  30-002-CI Final Concentration: 1%
L-Leucine methyl ester hydrochloride Aldrich L1002-25G Final Concentration: 5 mM
Solution for brain tissue digestion
HBSS Life Technologies 14170-088
Trypsin cellgro 25-050-CI Final Concentration: 0.25%
Other
70% (vol/vol) ethanol Roth 9065.2
Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm round coverslips  Corning 354087
Water Sigma W3500 Cell-culture grade
PBS cellgro 21-040-CV Cell-culture grade
0.05% Trypsin-EDTA  Life Technologies 25300-062
70 μm Sterile cell strainer  Fisher scientific 22363548
3.5 cm Petri dish BD Falcon 353001
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070
Forceps, fine  Dumont 2-1032; 2-1033 # 3c; # 5
Forceps, flat tip KLS Martin 12-120-11
13 cm surgical scissors Aesculap BC-140-R
Confocal Microscope Nikon A1RSi 
Centrifuge Eppendorf 5805000.017 5804R
Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE 4450-1CE MaxQ 4450 
Anti-IBA1 Wako 019-19741 Rabbit monoclonal
Anti-MAP2 Sigma M2320 Mouse monoclonal
Anti-HIF1alpha abcam ab179483 Rabbit monoclonal
Anti-S100B Sigma HPA015768 Rabbit polyclonal
Anti-GFAP (cocktail) Biolegend 837602
VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG) Vector Labs PK-6101 Contains 4 Reagents 
Goat Anti Rabbit Alexa-Fluor 488 Invitrogen A11070
Goat Anti Mouse Alexa-Fluor 568 Invitrogen A11004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell, E. M., Geller, H. M. Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension. Glia. 26, 73-83 (1999).
  2. Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow. Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).
  3. Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective. Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).
  4. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).
  5. Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner. Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).
  6. Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. Heterogeneity of reactive astrocytes. Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).
  7. Cengiz, P., et al. Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury. Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).
  8. Ferriero, D. M. Neonatal brain injury. The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).
  9. Hill, C. A., Fitch, R. H. Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice. Neurol Res Int. , 1-9 (2012).
  10. Cikla, U., et al. ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3). eNeuro. 3, (2016).
  11. Uluc, K., et al. TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).
  12. Cikla, U., et al. Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury. J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).
  13. McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. Selective vulnerability in the developing central nervous system. Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).
  14. Morken, T. S., et al. Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).
  15. Chisholm, N. C., Sohrabji, F. Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging. Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).
  16. Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture. Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).
  17. Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. Journal of women's health & gender-based. 10, 433-439 (2001).
  18. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505, 612-613 (2014).
  19. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78, 785-798 (2013).
  20. Cengiz, P., et al. Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation. PloS one. 9, e84294 (2014).
  21. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, 187-191 (2012).
  22. Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes. J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).
  23. McClive, P. J., Sinclair, A. H. Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos. Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).
  24. Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. A method for gender determination in newborn dark pigmented mice. Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).
  25. Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia. Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).
  26. Raponi, E., et al. S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage. Glia. 55, 165-177 (2007).
  27. Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. Characterization of adult rat astrocyte cultures. PloS one. 8, e60282 (2013).
  28. Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro. Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).
  29. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).
  30. Saura, J. Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note. J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).

Tags

Neuroscience hypoksi ischemi hippocampus astrocyte kultur GFAP OGD-Reox nyfødte
Kjønnsforskjeller i Muse Hippokampale Astrocytter etter<em&gt; In-Vitro</em&gt; iskemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chanana, V., Tumturk, A., Kintner,… More

Chanana, V., Tumturk, A., Kintner, D., Udho, E., Ferrazzano, P., Cengiz, P. Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia. J. Vis. Exp. (116), e53695, doi:10.3791/53695 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter