Summary
Her beskriver vi en fremgangsmåde til at udtrykke og oprense kvalitet norovirus høj udragende (P) domæner i E. coli til anvendelse i røntgenkrystallografi undersøgelser. Denne metode kan anvendes på andre calicivirus P domæner, såvel som ikke-strukturelle proteiner, dvs.., Viralt protein genom-linked (VPG), protease, og RNA-afhængige RNA-polymerase (RdRp).
Abstract
Den norovirus kapsid består af en enkelt større strukturelt protein, kaldet VP1. VP1 er opdelt i en skal (S) domæne og en fremspringende (P) domænet. S-domænet danner en sammenhængende stillads omkring det virale RNA, mens P domæne former virale pigge på S domæne og indeholder determinanter for antigenicitet og vært-celle-interaktioner. P-domænet binder carbohydratstrukturer, dvs.., Histo-blodgruppeantigener, der menes at være vigtige for norovirus infektioner. I denne protokol, beskriver vi en metode til at producere høj kvalitet norovirus P-domæner i høje udbytter. Disse proteiner kan derefter anvendes til røntgenkrystallografi og ELISA for at undersøge antigenicitet og vært-celle-vekselvirkninger.
P domæne er først klonet ind i en ekspressionsvektor og derefter udtrykkes i bakterier. Proteinet oprenses ved hjælp af tre trin, der involverer immobiliserede metal-ion-affinitetskromatografi og gelpermeationskromatografi. Iprincip, er det muligt at klone, udtrykke, rense, og krystallisere proteiner i mindre end fire uger, hvilket gør denne protokol et hurtigt system til analyse nyligt opståede norovirus stammer.
Introduction
Menneskelige norovira er den væsentligste årsag til akut gastroenteritis verdensplan 1. Disse virus tilhører Caliciviridae familien, hvoraf der er mindst fem slægter, herunder norovirus, Sapovirus, Lagovirus, Vesivirus, og Nebovirus. På trods af deres høje effekt på sundhedssystemet og bred fordeling, er studiet af menneskelige norovira hæmmet af manglen på en robust cellekultursystem. Til dato er der ingen godkendte vacciner eller antivirale strategier til rådighed.
Den norovirus vigtigste capsidprotein, betegnet VP1, kan opdeles i en skal (S) domæne og en fremspringende (P) domæne 2. P-domænet er forbundet til S-domænet af et fleksibelt hængsel (H) region. S-domænet danner et stillads omkring det virale RNA, hvorimod P-domænet udgør den yderste del af det virale capsid. P domæne samler ind biologisk relevante dimerer, når de udtrykkes i bakterier. P dimer interagerer med carbonhydratstrukturer, betegnet histo-blodgruppeantigener (HBGAs), som er til stede som opløselige antigener i spyt og findes på visse værtsceller 3. P domain-HBGA interaktion menes at være vigtigt for infektion 4. Faktisk en nylig rapport afslørede betydningen af syntetiske HBGAs eller HBGA-udtrykkende bakterier til mennesker norovirus infektion in vitro fem.
Aktuelle undersøgelser vedrørende værtscellen fastgørelse af norovira er hovedsageligt udført med viruslignende partikler (VLP'er), der kan udtrykkes i insektceller, eller med rekombinante P domæner udtrykt i Escherichia coli (E. coli). For at forstå P domæne-HBGA interaktioner på atomar opløsning, kan P domæne-HBGA komplekse strukturer løses ved hjælp røntgenkrystallografi. Her beskriver vi en protokol for P domænenavn ekspression og oprensning, der tillader produktion af P domæne høj mængde og kvalitet, der skal bruges til X-ray crystallography. Desuden kan denne metode anvendes til andre calicivirus P domæner og ikke-strukturelle proteiner.
P-domænet er kodon-optimeret til E. coli ekspression og klonet ind i en standard transfervektor. P-domænet er derefter igen klonet ind i en ekspressionsvektor, der koder for et polyhistidin (His) -mærke og en mannose-bindende protein (MBP), der er efterfulgt af et proteasespaltningssted. MBP-His-P domæne-fusionsprotein udtrykkes i E. coli, efterfulgt af tre oprensningstrin. MBP-His-P domæne-fusionsprotein oprenses under anvendelse af immobiliseret metalion-affinitetskromatografi (IMAC). Dernæst fusionsproteinet spaltes med humant rhinovirus (HRV) 3C protease og P-domænet er adskilt fra MBP-His med yderligere IMAC oprensningstrin. Endelig er P domæne oprenset ved anvendelse gelpermeationskromatografi (SEC). Den oprensede P domæne kan derefter anvendes til røntgenkrystallografi. Screening af protein krystallisationsbetingelser er PerfoRMED med kommercielt tilgængelige screening kits ved hjælp af forskellige P domæne proteinkoncentrationer. observeres krystalvækst og de mest lovende betingelser optimeres.
Med de metoder, der er beskrevet her, er det muligt at gå fra gen til protein til struktur inden for mindre end fire uger. Derfor er vores fremgangsmåde til P domæne ekspression, oprensning og krystallisation er egnet til at studere norovirus-vært interaktion på molekylært niveau og giver vigtige data til at bistå med up-to-date vaccine design og lægemiddelscreening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. P Domæne Kloning
- Bestem P domæne kodende region ved sekvens alignment af norovirus stammer (f.eks GII.10 stammen, GenBank: AF504671, FBF-ID: 3ONU) 6. Desuden fjerner den fleksible region ved den C-terminale ende af P-domænet (figur 2A). Codon-optimere DNA'et for E. coli udtryk og omfatter BamHI (N-terminal) og NotI (C-terminale) restriktionssteder med henblik på at sub-klon P domæne kodende region i pMalc2x ekspressionsvektoren 6,7.
Bemærk: P-domæne kodende region er optimeret og syntetiseret af en kommerciel tjeneste. P-domæne kodende region (indsæt) er cirka 1 kb i længden og leveres i en standard overførsel vektor. - Fordøje 2 ug af transfervektor med hver 1 pi BamHI (20.000 U / ml) og NotI (10.000 U / ml) restriktionsenzymer i 1 time ved 37 ° C med producenten leverede buffere.
- Adskil det fordøjede insert på en 1% agarosegeli 20 minutter ved 135 V og oprense insert DNA'et fra gelen under anvendelse af et kommercielt kit.
- Forbered pMalc2x ekspressionsvektoren ved fordøjelse 2 ug af denne vektor med hver 1 pi BamHI (20.000 U / ml) og NotI (10.000 U / ml) restriktionsenzymer i 1 time ved 37 ° C. Oprens vektoren fra en agarosegel som beskrevet ovenfor (1.3). Bemærk: Begge prøver (1,2 og 1,4) kan opbevares ved -20 ° C.
- Ligere oprenset indsatsen ind i fordøjet pMalc2x vektoren ved BamHI og Notl-restriktionssteder med 1 pi T4-DNA-ligase (400.000 U / ml) i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) (figur 2B og 2C). Brug mindst 20 ng af pMalc2x vektor og en vektor: insert-forhold 1: 3 (molekylvægt). Ligeringsblandingen er normalt ~ 20 pi.
- Transform 2 pi af ligeringsblandingen i 50 pi kemisk kompetent E. coli DH5a bakterieceller under anvendelse af en standard transformation protokol (10 min på is, varmechok 45 sek ved 42 ° C) og vokse i 600pi SOC-medium i 1 time ved 37 ° C. Centrifuger de transformerede celler i 3 min ved 1000 x g, supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i 30 pi SOC-medium.
- Plate transformationsblandingen på LB-agarplader indeholdende 100 ug / ml ampicillin til udvælgelse, og vokse natten over ved 37 ° C. Vælge mindst fem kolonier.
- For hver af de fem kolonier, inokulering 2-3 ml kultur af LB-medium suppleret med 50 ug / ml ampicillin (LB-amp) og vokse ved omrystning natten over ved 160 rpm ved 37 ° C.
- Uddrag plasmiderne fra overnatskultur under anvendelse af et kommercielt kit. Kontrollere tilstedeværelsen af P-domænet insertet ved sekventering med en pMalc2x forward primer (5'-TCAGACTGTCGATGAAGC-3 ') og revers primer (5'-GATGTGCTGCAAGGCGAT-3').
2. P Domæne Expression
- Transform 1 pi (150 ng / pl - 400 ng / pl) i pMalc2x vektoren koder for MBP-His-P domænefusionsprotein i 50 pi kompetente E. coli BL21-celler under anvendelse af en standard transformation protokol (10 min på is, varmechok 45 sek ved 42 ° C) og vokse i 600 pi SOC-medium i 1 time ved 37 ° C. Subkultur i 120 ml LB-amp natten over ved 160 rpm og 37 ° C.
- Pode ni liter (f.eks 6 x 5 L kolber med 1,5 l medium hver) af LB-amp med subkultur (1: 100). Grow cellerne omrystning ved 160 rpm og 37 ° C, indtil OD600 når 0,4 - 0,6. Efterfølgende sænke temperaturen til 22 ° C i ~ 1 time og derefter inducere proteinekspression med 0,66 mM isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) 8. Grow cellerne natten over ved 22 ° C (~ 18 timer).
Bemærk: Temperaturen kan varieres, men vi anbefaler at bruge 22 ° C eller lavere. - Cellerne høstes ved centrifugering (10.543 x g, 15 min, 4 ° C). Supernatanten fjernes, og fryse cellepelleten ved -20 ° C.
1. Rensning Step og Protease Spaltning
- Forbered buffere, der anvendes under de protein oprensningstrin fra stamopløsninger at sikre reproducerbarhed og stabilitet af forsøgene. Forbered fire forskellige puffere til den immobiliserede metalion affinitetskromatografi (IMAC), som hver indeholder en forskellig koncentration af imidazol (10 mM, 20 mM, 50 mM og 250 mM). For SEC, fremstille en gel-filtrering puffer (GFB) med en højere saltkoncentration, men uden imidazol. Brug deioniseret vand og filtrere alle puffere før brug med en porestørrelse på 0,45 um.
Bemærk: For en detaljeret forberedelse ordning buffer, se tabel 1. - Optø cellepelleten fra ni liter kultur og opløses i 150 ml PBS ved 4 ° C. Sonikeres cellesuspensionen tre gange i 2 min (strøm 130 W, amplitude 20%, pulsfrekvens 50%) for at sprænge cellerne. Hold cellesuspensionen på is under sonikering.
- Centrifuge den sonikeret cellesuspension (43.667 x g, 30 min, 4 ° C) for at adskille cellerester fra supernatanten indeholdende udtrykte protein. Saml supernatanten og kassér pillen.
- Vask og ækvilibrering 10 ml (= 1 søjlerumfang [CV]) opslæmning af nikkel (Ni) -NTA agaroseperler med 10 mM imidazol-buffer i en kromatografisøjle. Tilsæt de ækvilibrerede Ni perler til supernatanten fra trin 3.3 indeholdende udtrykt MBP-His-P domæne-fusionsprotein og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C med langsom rotation.
- Efter inkubation anvende hele Ni-perle-proteinblanding til en kromatografisøjle. Kolonnen udvaskes langsomt med hver 5 CV 10 mM, 20 mM og 50 mM imidazol buffere, der starter med 10 mM, derefter 20 mM og sidste 50 mM (figur 3A).
- Eluering af MBP-His-P domæne-fusionsprotein under anvendelse af 250 mM imidazol-buffer (figur 3A). Under eluering, kontrollere OD280nm at kontrollere elueringen af fusionsproteinet (stigningen i OD 280nm). Fortsæt eluering indtil OD280nm falder til ~ 0,1. Vask perlerne med store mængder af 250 mM imidazol buffer (mindst 10 CV'er), efterfulgt af mindst 10 CV 10 mM imidazol buffer. Gem perlerne for anden rensning trin (afsnit 4).
- Kontrollere tilstedeværelsen af MBP-His-P domæne fusionsprotein med SDS-PAGE under anvendelse af en 12% SDS-polyacrylamidgel (10 x 8 cm) 9 (figur 3A). Udføre gelelektroforese ved 45 A og 200 V i 45 minutter.
- Koncentrer (fx under anvendelse af et kommercielt koncentrator) den eluerede MBP-His-P domæne fusionsproteinet til en slutkoncentration på ~ 3 mg / ml. Spalte MBP-His-P domæne fusion med HRV-3C protease under dialyse mod 2 liter 10 mM imidazol-buffer (~ 1: 100) natten over ved 4 ° C (figur 3A). Afhængigt af det endelige rumfang koncentreret protein, udføre dialyse i en dialyse kassette eller dialyserør.
Bemærk: Mængden af HRV-3C protease for proteinspaltning beregnes efter den specifikke proteaseaktivitet (2 U / pl, 1 U er tilstrækkelig til at spalte 100 ug protein) og mængden af elueret fusionsprotein, der varierer på ekspressionsniveauet og kan estimeres ud fra SDS-PAGE resultat (3,7 ).
4. 2. oprensningstrin
- Ækvilibrere NI-perler fra trin 3.6 i 10 mM imidazol buffer.
- Inkubér den dialyserede protein fra trin 3.7 (indeholdende spaltet P domæne, MBP-protein, og HRV-protease) med den ækvilibrerede Ni-beads (4.1) i 30 minutter ved 4 ° C med langsom rotation.
- Påfør Ni-perle blandingen til en søjle og indsamle gennemløbet (spaltet P domæne) (figur 3B). Måle koncentrationen af protein som det kommer ud af kolonnen, indtil OD 280 nm når ~ 0,1.
Bemærk: MBP-His skal forblive bundet til Ni-beads (figur 3B). - Kontroller tilstedeværelsen af spaltet P domæne ved hjælp af SDS-PAGE med en 12% gel som beskrevet ovenfor (figur 3B). Koncentrer den eluerede P domæne til ~ 3 mg / ml og dialyseres natten over ved 4 ° C mod GFB til efterfølgende SEC oprensning.
5. 3. oprensningstrin
- Vask pumper og rør HPLC rensning system og pre-ligevægt SEC-kolonnen (se Materialer List) med GFB.
- Injicere P domæne til søjlen ved en strømningshastighed på 1 ml / min under anvendelse af en Superloop (op til 12 ml) eller sløjfe (op til 3 ml), afhængigt af mængden af den koncentrerede prøve. Efter injektionen er afsluttet, øges strømningshastigheden til 2,5 ml / min.
- Som OD stiger og P-domænet kommer fra søjlen, indsamle fraktioner på 1,5 ml. Check fraktioner ved hjælp af SDS-PAGE med en 12% gel (figur 4A og 4B). Pool kun de reneste fraktioner og koncentrer til ~ 3 mg / ml og ~ 8 mg / ml.
Bemærk: Efter ~ 110 ml (ugyldig volumen) de fleste urenheder elueres fra en SEC kolonne med 320 ml seng volumen. DetP domæne sædvanligvis elueres som en dimer. Elueringstid / volumen af P-domænet dimer afhænger af prep bedømmelse (pg) af SEC kolonne.
6. Krystallisation af P Domain
- Bruge P domæne i ~ 3 mg / ml og 8 mg / ml for indledende screening krystallisation. Fremstilles mindst 100 pi P domæne pr koncentration for indledende skærme med 384 kommercielt tilgængelige screening betingelser. Udføre screening ved 18 ° C i en 96-brønds pladeformat, hvor reservoiret indeholder 100 pi mor opløsning og en dråbe består af 0,2 pi stamopløsning og 0,2 pi protein.
- Gentag og optimere succesfulde krystallisationsbetingelser. Brug derfor 15 brønde, der indeholder 3 rækker. Oprette den første række med 100% mor opløsning, den anden række med 90% stamopløsning og 10% vand, og den tredje række med 80% stamopløsning og 20% vand. Brug en dråbestørrelse på 2 pi (1 pi protein + 1 pi mor opløsning) og 50081; l af mor opløsning som et reservoir volumen.
- Brug optimerede krystal betingelser for co-krystallisering af P domæne med ligander. Forbered plader som beskrevet i 6.2. I stedet for 2 pi dråbestørrelse, der er nedsat dråber indeholdende 1 pi stamopløsning, 1 pi protein, og 1 pi af ligand i en koncentration på 1 mg / ml.
- Saml datasæt af enkelte krystaller ved hjælp synkrotronstråling. Udfør molekylær udskiftning ved hjælp af offentliggjorte P domæne strukturer med en høj sekvens lighed som indledende søgning model 6,10-13.
Bemærk: Tilstedeværelse af en ligand viser sig som un-modelleret klat elektron tæthed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den skematiske af den beskrevne protokol er afbildet i figur 1. Protokollen omfatter 6 store dele, der omfatter kloning af målgenet, ekspression, en tre-trins oprensning og krystallisation. Figur 2 illustrerer udformningen af ekspressionskonstruktionen (EF) og karakteristika pMalc2x ekspressionsvektor. Sekvensen for det multiple kloningssite (MCS), i pMalc2x vektoren viser restriktions- og proteasespaltningssites. Figur 3 viser repræsentative SDS-PAGE-resultaterne af MBP-His-P domæne-fusionsprotein og spaltes P-domæne med de tilsvarende skemaer af de to første oprensningstrin. Det tredje oprensningstrin er afbildet i figur 4 og involverer en oprensningsplan, elueringen kromatogram af oprenset P-domæne og en repræsentant SDS-PAGE resultat af opsamlede fraktioner. De reneste fraktioner (ifølge SDS-PAGE) samles, koncentrated, og anvendes til røntgenkrystallografi.
Figur 1. Skematisk af Roskildesyge P Domain Ekspression og oprensning. Protokollen for norovirus P domæne ekspression og oprensning indeholder seks store dele, der dækker kloning og ekspression (1 og 2), oprensning (3 til 5), og krystallisation (6.). Røde trekanter repræsenterer P-domænet (gen og protein), hvorimod blå rektangler repræsenterer MBP-His. Ni-NTA-agaroseperler, der anvendes under IMAC (3 og 4) er vist som store cyan sfærer. SEC perler er afbildet som grå kugler.
Figur 2. Design og Kloning af ekspressionskonstruktionen (EF). P-domænet EFEkspressionsvektoren kort, og det multiple kloningssite (MCS) er vist. A) Justering af norovirus capsidprotein (VP1) og P-domænet EF illustrerer udformningen af EF med den C-terminale deletion (grøn). B ) Skematisk afbildning af pMalc2x ekspressionsvektoren anvendes til P domæne ekspression i E. coli med ampicillin-resistens-kassette (AmpR), lac-operon (lacI), mannose-bindende protein (mand, MBP) og en MCS. C) Sekvens af MCS i pMalc2x ekspressionsvektoren. Fremhævet er de restriktionsenzymspaltningssteder (røde kasser) og genkendelsessekvensen LEVLFQGP for HRV 3C protease (præcision, blå boks).
Figur 3. Skematisk og Repræsentative resultater for 1. og 2. Purification Trin. Oprensning overblik og repræsentative SDS-PAGE resultater er vist. A) Oprensning af MBP-His-P domæne-fusionsprotein under anvendelse af Ni-NTA agaroseperler (store cyan kugler). 12% SDS-PAGE-gel viser MBP-His-P domæne-fusionsprotein. B) Adskillelse af MBP-His (blå rektangel) fra spaltet P domæne (rød trekant). Eluering af spaltet P domæne analyseres ved SDS-PAGE på en 12% gel.
Figur 4. Skematisk og repræsentative resultater af 3. oprensningstrin. Kromatogram af P domæne eluering under anvendelse SEC og tilsvarende SDS-PAGE resultat. Sorte tal angiver fraktionerne, der indsamles. A) Skematisk af separation på SEC-søjle (SEC perler er afbildet som grå kugler). 12% SDS-PAGE viser de tilstedeværende proteinersi fraktionerne, der er indsamlet under SEC eluering, og som efterfølgende samles og anvendes til røntgenkrystallografi. B) SEC kromatogram viser den målte absorbans (sort linje) i løbet af elueringsvolumen. Den røde linje viser, når P-domænet blev injiceret i SEC-kolonnen. C) Zoom ind på anden top af B. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer navn | 1 M Tris pH 7,6 | 5 M NaCl | 3,5 M imidazol, pH 8 |
| 250 mM imidazol-buffer | 20 ml | 40 ml | 71 ml |
| 50 mM imidazol-buffer | 20 ml | 40 ml | 14 ml |
| 20 mM imidazol-buffer | 20 ml 40 ml | 5,7 ml | |
| 10 mM imidazol-buffer | 20 ml | 40 ml | 2,8 ml |
| GFB (Gelfiltrering puffer) | 25 ml | 60 ml | - |
Tabel 1. Pipetting Ordning for Fælles Buffere anvendes under rensningen. Stamopløsninger af Tris-HCI, er natriumchlorid (NaCl), og imidazol forberedt som angivet i overskriften på bordet. Mængden af stamopløsning nødvendige for at forberede 1 I af den ønskede puffer i vand er repræsenteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi en protokol for ekspression og oprensning af norovirus P-domæner i høj kvalitet og kvantitet. Norovira er ikke godt undersøgt og løbende behov strukturdata. Så vidt vi ved, har P domænenavn produktion ved hjælp af andre protokoller (f.eks GST-mærket P domæner) været problematisk, hidtil, og har været savnet tilstrækkelige strukturelle data om norovirus-vært interaktion. Med den her beskrevne fremgangsmåde, har vi for nylig bidraget væsentligt til forståelsen af de molekylære detaljer i norovirus kulhydrat bindende. Den foreliggende protokol kan tilpasses til en række proteiner. Men en vellykket gennemførelse af denne protokol afhænger af flere faktorer inden for hver del af rensning metode.
Design af ekspressionskonstruktionen er det første skridt af betydning. Vi udfører codon-optimering af P domæne ekspressionskonstruktionen at forbedre ekspressionen udbytte i E. coli og fjern relevante restriktionssteder, der er til stede i den kodende region. Desuden fjerner vi en fleksibel region ved C-terminus, som kan være ufordelagtig for proteinfoldning under ekspression og protein pakning under krystallisation. Ekspression som MBP-fusionsprotein er et middel til at holde proteinet i opløsning under ekspression.
Vedrørende opløseligt protein ekspression er der yderligere parametre, der skal overvejes. E. coli BL21 stammen er optimeret til højt udbytte proteinekspression og derfor anvendes i denne protokol. Ekspression udføres natten over ved 22 ° C og en reduceret mængde af IPTG anvendes til induktion. Dette er gunstigt for kinetikken for protein-ekspression og som følge heraf, vil mindre protein aggregere til organer som følge af misfoldning inklusion. Derfor er det vigtigt at afkøle kulturen til 22 ° C før induktion af proteinekspression med IPTG. Hvis proteinet Udbyttet er ikke tilfredsstillende, er det muligt yderligere at formindske Temperature og justere mængden af IPTG.
bør tages Visse omhu med hensyn til rensning kolonner. I princippet kan Ni-beads genbruges flere gange. Dog vil bindingskapacitet blive reduceret med tiden. Hvis Ni-løsningen mister sin standard blå farve, kan perlerne blive strippet og genoplades ved hjælp af instruktionerne i producentens håndbog. Desuden er det vigtigt at fastholde SEC kolonne i god stand og rengør det regelmæssigt for at tillade høj ydeevne. Afhængig af proteinet størrelse, der skal oprenses en anden prep bedømmelse (pg) af SEC kolonne skal vælges. P domæne dimer er ~ 65 kDa i størrelse og kan godt adskilt fra urenheder fra ~ 100 kDa under anvendelse af en 75 pg kolonne, hvorimod større proteiner kan være bedre adskilt under anvendelse af en 200 pg kolonne.
Som en kombination af optimerede sekvens design, ekspression og oprensning procedure er det muligt at opnå meget ren og høj kvalitet P-domæne ved hjælp af vores method. På grund af den høje kvalitet af det rensede P-domænet, supplerende undersøgelser er egnede, herunder immunisering for antistofproduktion, NMR-forsøg, og ELISA-baserede undersøgelser. Endvidere kan det oprensede P domæne anvendes til kompleksdannelse med Fab-antistoffer og nanobodies 14,15. Til vores viden, er dette den første protokol, der tillader P domænenavn krystallisering i en high throughput måde og ved hjælp af denne protokol, har vi bestemt over 20 komplekse strukturer af forskellige norovirus og lagovirus P domæner i kompleks med HBGAs 6,16.
Ifølge vores erfaring kan protokollen begrænses til proteiner op til 65 kDa. Imidlertid blev capsidproteiner af forskellige calicivira 17 og ikke-strukturelle proteiner, såsom viralt protein genom-linked (VPG), protease, og RNA-afhængige RNA-polymerase (RdRp) succes udtrykt og oprenset ved hjælp af denne metode (upubliceret). Ved anvendelse af denne metode til at capsidproteiner af andre vira, it kan være nødvendigt at variere og optimere flere parametre (f.eks., den imidazolkoncentration i elueringspufferen) for at få tilstrækkelig mængde protein. Derudover kan forskellige andre end GFB (f.eks PBS eller TBS) opbevaring buffere testes for optimal protein stabilitet.
Størstedelen af de analyserede konstruktioner gav i kubiske / pladelignende krystaller, som diffrakterede til høj-opløsninger. Derfor er den nuværende protokol giver et værktøj til at opnå rent protein, der krystalliserer godt. Så længe der er nu robust cellekulturmodel rådighed, denne metode udgør et vigtigt skridt til at bidrage til forståelsen af norovirus-værtscelle-interaktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P domain DNA | Life Technologies | GeneArt Gene Synthesis | |
| pMalc2x vector | On request | ||
| BamHI | New England Biolabs | R0136L | |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| S.O.C. Medium | Life Technologies | 15544-034 | |
| Econo-Column Chromatography Column | Bio-Rad | 7372512 | 2.5 x 10 cm, possible to use other size |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | |
| Vivaspin 20 | GE Healthcare | various | cutoff of 10 kDa, 30 kDa and 50 kDa used |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Life Technologies | 18265-017 | |
| One Shot BL21(DE3) Chemically Competent E. coli | Life Technologies | C6000-03 | |
| HRV 3C Protease | Merck Millipore | 71493 | |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 PG | GE Healthcare | 28-9893-34 | SEC column |
| JCSG Core suites | Qiagen | various | 4 screens with each 96 wells |
| Carbohydrates | Dextra Laboratories, UK | various | Blood group products |
References
- Ahmed, S. M., et al. Global prevalence of norovirus in cases of gastroenteritis: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis. 14, 725-730 (2014).
- Prasad, B. V., Matson, D. O., Smith, A. W.
- Choi, J. M., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. Atomic resolution structural characterization of recognition of histo-blood group antigens by Norwalk virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9175-9180 (2008).
- Marionneau, S., et al. Norwalk virus binds to histo-blood group antigens present on gastroduodenal epithelial cells of secretor individuals. Gastroenterology. 122, 1967-1977 (2002).
- Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346, 755-759 (2014).
- Hansman, G. S., et al. Crystal structures of GII.10 and GII.12 norovirus protruding domains in complex with histo-blood group antigens reveal details for a potential site of vulnerability. J. Virol. 85, 6687-6701 (2011).
- Fath, S., et al. Multiparameter RNA and codon optimization: a standardized tool to assess and enhance autologous mammalian gene expression. PLoS One. 6 (e17596), (2011).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kabsch, W. Automatic Processing of Rotation Diffraction Data from Crystals of Initially Unknown Symmetry and Cell Constants. J. Appl. Crystallogr. 26, 795-800 (1993).
- Mccoy, A. J., et al.
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K.
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
- Koromyslova, A. D., Hansman, G. S. Nanobody binding to a conserved epitope promotes norovirus particle disassembly. J. Virol. 89, 2718-2730 (2015).
- Hansman, G. S., et al. Structural basis for broad detection of genogroup II noroviruses by a monoclonal antibody that binds to a site occluded in the viral particle. J. Virol. 86, 3635-3646 (2012).
- Singh, B. K., Leuthold, M. M., Hansman, G. S. Human noroviruses' fondness for histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2024-2040 (2015).
- Leuthold, M. M., Dalton, K. P., Hansman, G. S. Structural analysis of a rabbit hemorrhagic disease virus binding to histo-blood group antigens. J. Virol. 89, 2378-2387 (2015).
