Abstract
Unterschiede in der Aktivität von Neurotransmittern und Neuromodulatoren und folglich verschiedene neuronale Reaktionen können zwischen narkotisierten und wachen Tieren gefunden werden. Daher sind Verfahren ermöglicht die Manipulation von synaptischen Systeme in wach Tiere erforderlich, um den Beitrag der synaptischen Eingaben neuronalen Verarbeitung unbeeinflußt von Anästhetika zu bestimmen. Hier stellen wir Methoden zur Konstruktion von Elektroden gleichzeitig extrazelluläre neuronale Aktivität aufzuzeichnen und mehrere neuroaktive Substanzen freisetzen in der Nähe der Aufzeichnungs Seiten in wach Mäusen. Durch diese Verfahren kombiniert, führten wir microiontophoretic Injektionen von Gabazin selektiv zu GABA - A - Rezeptoren in Neuronen des Colliculus inferior von Kopf-gezügelt Mäuse blockieren. Gabazin erfolgreich Nervenreaktionseigenschaften wie beispielsweise die Frequenzantwortbereich und Stimulusspezifische Anpassung modifiziert. Somit zeigen wir, dass unser Verfahren geeignet sind, recording Single-Unit-Aktivität und für die Rolle der spezifischen Neurotransmitter-Rezeptoren in auditorischen Verarbeitung sezieren.
Die Haupteinschränkung des beschriebenen Verfahrens ist die relativ kurze Aufnahmezeit (~ 3 h), die durch die Höhe der Gewöhnung des Tieres zu den Aufnahmen bestimmt. Auf der anderen Seite können mehrere Aufnahmen in demselben Tier durchgeführt werden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber anderen experimentellen Verfahren verwendet, um das Niveau der Neurotransmission oder Neuromodulation (wie systemische Injektionen oder die Verwendung von optogenetische Modelle) zu manipulieren, ist, dass die Arzneimittelwirkung auf die lokalen synaptischen Eingaben in das Zielneurons beschränkt. Darüber hinaus ermöglicht die kundenspezifische Herstellung von Elektroden Einstellung bestimmter Parameter entsprechend der neuralen Struktur und Art des Neurons von Interesse (beispielsweise der Spitze Widerstand zur Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnis der Aufnahmen).
Introduction
Das Zusammenspiel von neuronalen Erregung und Hemmung ist von grundlegender Bedeutung für die Verarbeitung von Sinnesinformationen 1. Es ist auch bekannt , dass der Anästhesie einen starken Einfluss auf die Dynamik der kortikalen Aktivierung hat und das zeitliche Muster der synaptischen Eingänge 2,3. Beispielsweise wurde beobachtet , daß Anästhetika die Dauer visuell hervorgerufenen Reaktionen in kortikalen Neuronen 3,4 verändern. Darüber hinaus unterscheidet sich das Verhältnis zwischen erregenden und hemmenden synaptischen Eingänge in narkotisierten und wachen Tieren 4,5, zu verändern sowohl evozierten und spontanen Aktivitätsraten 6,7. Durch die synaptischen Leitwerte Messung, Haider und Kollegen 4 gefunden , dass die Hemmung abgestimmt Erregung in Amplitude unter Narkose während im Wachzustand, Hemmung stärker als Anregung war. Diese Ergebnisse veranlassen, die Entwicklung von experimentellen Verfahren, die Auswirkungen der spezifischen synaptischen Eingänge auf die sensorische Verarbeitung in wach Tiere zu studieren.
<p class = "jove_content"> Die gesteuerte Ausstoß von geladenen neuro Substanzen durch kleine Strominjektionen Anwendung (in der Größenordnung von nA) wurde ausgiebig verwendet , um den Beitrag der synaptischen Eingänge zu untersuchen und die Rolle der vermeintlichen Zell - Rezeptoren in der sensorischen Verarbeitung 8-13 . Diese Technik, die als microiontophoresis bekannt ist, ermöglicht die Anwendung von Medikamenten in der Nähe des aufgezeichneten neuron, was zu einem schnellen und beschränkte Wirkung beiträgt. Dieses Verfahren ist besser geeignet für lokale Effekte von neuroaktiven Substanzen studiert, im Vergleich zu den weit verbreiteten Effekt durch andere experimentelle Manipulationen, wie systemische Injektionen, Mikrodialyse oder die Verwendung von optogenetische Techniken ausgelöst. Üblicherweise wird eine Huckepack-Elektrodenkonfiguration 14,15 wird verwendet , um gleichzeitig das Ziel Neuron aufnehmen und die neuro Substanzen von Interesse zu liefern. Es besteht aus einer Aufzeichnungselektrode mit einem mehrgehäusigen Pipette angebracht, die die neuroaktiven Substanzen trägt. Abwandlungen der original Verfahren von Havey und Caspary 14 umgesetzt wurden. Beispielsweise eine Wolframelektrode, anstelle einer Glas ein, verwendet werden , um die neuronale Aktivität 16 aufzunehmen. Bisher veröffentlichte Verfahren zur Herstellung von Wolframelektroden 17,18 umfassen drei allgemeine Schritte: elektrolytische Ätzen von Wolfram Drahtspitzen, Glasisolierung, und die Einstellung der Spitze Belichtung , um die Aufnahme Anforderungen erfüllen.Ein interessantes und emergent Feld in auditorische Neurowissenschaften ist die Untersuchung der Stimulus spezifische Anpassung (SSA 19). SSA ist eine spezifische Abnahme der neuronalen Reaktion auf sich wiederholende Geräusche, die nicht auf andere, selten präsentiert Klänge nicht verallgemeinern. Die Bedeutung der SSA liegt in ihrer möglichen Rolle als neuronales Mechanismus zugrunde liegende deviance Detektion im auditorischen Gehirn sowie eine mögliche neuronale Korrelat für die späte Mismatch - Negativität Komponente des Gehör Potential 20,21 evozierte. SSA occurs vom IC bis zum auditorischen Cortex 19,22-24. GABA A -vermittelte Hemmung wurde als Verstärkungssteuerungsmechanismus auf SSA 7,16,25, die auch gezeigt wurde , werden beeinflußt durch Anästhesie 26 einwirken demonstriert. Hier stellen wir ein Protokoll , das für die Aufzeichnung der Single-Unit - Aktivität von IC - Neuronen vor und während der Anwendung eines selektiven Antagonisten der GABA A -Rezeptoren in wachen Mäusen zuvor beschriebenen Verfahren kombiniert. Zunächst beschreiben wir die Herstellung von Huckepack-Elektroden und anderen, den chirurgischen und Aufzeichnungsverfahren. Um die Wirksamkeit der Wirkstofffreisetzung zu testen, verglichen wir die rezeptiven Feld sowie das Niveau der SSA von IC-Neuronen vor und während der microiontophoretic Ausstoß von Gabazin.
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Protocol
Alle experimentellen Verfahren wurden an der Universität von Salamanca mit der Zustimmung durchgeführt und unter Verwendung von Methoden, um die Standards der konformen, der Universität von Salamanca Animal Care Committee sowie die Standards der Europäischen Union (Richtlinie 2010/63 / EU) für die Verwendung von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung.
1. Wolframelektroden
Anmerkung: Die Herstellung von Wolframelektroden basiert auf der ursprünglichen Technik beschrieben in Merrill und Ainsworth 27 und Ainsworth et al 28 durchgeführt und die Arbeitsplatzeinrichtung in Bullock beschrieben unter Verwendung et al 17...
- Zur Single-Unit extrazelluläre Aktivität von IC-Neuronen, verwenden Sie Elektroden mit einer Spitze Impedanz von 1,5 aufzeichnen - 2,5 MOhm. Hier werden die Schritte der Wolframelektrodenherstellung werden nur kurz beschrieben, da eine detaillierte Beschreibung in den oben erwähnten Druckschriften gefunden wird.
- Platzieren Sie Wolframdrähte in einem speziell angefertigten AusrichtungWerkzeug (1A) zu unterstützen , sie auf die gewünschte Länge zu schneiden. Das Ausrichtungswerkzeug besteht aus 30 Nadeln (25 G) 2 mm Abständen parallel verleimt, mit einem Anschlag an einem Ende der Länge der Leitungen zu begrenzen, um ~ 40 mm. befestigen Sie sorgfältig die losen Enden der Drähte mit Klebeband, und schneiden Sie den Rest des Drahtes mit starken Schere.
- Ziehen Sie vorsichtig vom Band, um die Wolframdrähte aus dem Alignment-Tool zu entfernen, um sicherzustellen, dass alle Drähte an dem Band befestigt bleiben. Rollen Sie das Band auf eine polierte Messingspindel (1B, C), hält die Drähte fest gegen die Spindel , so gibt es eine gute elektrische Verbindung ist.
- Schließen Sie die Spindel zu einem 5 Umdrehungen pro Minute Motor in der Workstation, und tauchen die überstehenden Drahtspitzen in einer Ätzlösung (KNO 2, 90 g pro 80 ml). Winkel der Spindelachse 45 ° relativ zu der Oberfläche der Ätzlösung. Tauchen Sie die Drahtspitzen, so dass ca. 1/3 der Drähte, die Lösung in Verbindung.
- immERSE mit einer Kohlenstoffstabelektrode in das Ätzbad die Schaltung zu schließen. Verwenden Sie eine Feder Kupfergeflecht Bürste das Ätzen Versorgung der Spindelwelle aufzubringen, während die Spindel dreht. Stellen Sie den Strom, der durch die Elektroden und die Ätzlösung auf 250 mA übergeben wird. Stoppen Sie die Spitze Ätzen, wenn der Strom auf 200 mA abfällt. Die Drahtspitzen werden in sehr feine Punkte geätzt werden.
- Führen Sie ein geschärft Draht durch eine Flamme kein Fett und Klebstoffreste zu entfernen. Setzen Sie den Draht (stumpfes Ende zuerst) in ein Borosilicatglas Kapillare (1,5 mm Außendurchmesser, 0,86 mm ID) mit seinem unteren Ende mit Knetmasse blockiert. Klemmen Sie die Pipette senkrecht nach oben und unten. Ziehen Sie die Pipette eine Heizwendel (Durchmesser 5 mm, Tiefe 5 mm) und eine Bewährungs Kolben verwendet wird. Wenn der Draht durch das Gewicht des Kolbens nach unten, das geschmolzene Glas bildet einen sehr feinen Mantel um ihn herum gezogen wird.
- Entfernen Sie das Glas mit der Spitze am scharfen Ende der Elektrode mit Hilfe eines geschmolzenen Wulst von Natrium bedecktTetraborat. Um den Wulst bilden, mischen, um das Natriumtetraborat (~ 0,25 g) mit einer geringen Menge Wasser (~ 0,5 ml) und platziere sie langsam auf einem Heizelement, bis sie in einem Wulst schmilzt ~ 2 mm im Durchmesser. Die Temperatur des Heizelements wird durch ein Potentiometer gesteuert. Platzieren des Wulstes und das Heizelement auf einem Manipulatorarm an den Tisch befestigt ist, und es zu bewegen, bis der Wulst unter dem Mikroskop bei geringer Vergrßerung fokussiert.
- Sichern Sie das Glas bedeckten Draht zu einer Folie und legen Sie sie unter dem Mikroskop. Bewegen Sie den Schlitten mit den Bühnen Knöpfe, bis die Spitze und Tetraborat Wulst im Fokus sind. Erhitzen Sie die Perle, bis sie leicht schmilzt, und legen Sie die Drahtspitze ~ 10 bis 15 & mgr; m. Schalten Sie die Heizung Potentiometer ab. Da der Wulst abkühlt, zieht es sich und wird das Glas aus der Spitze der Elektrode, Freilegung der darunterliegenden Wolfram entfernen. Die Wolframelektrode ist nun einsatzbereit.
2. mehrgehäusigen Glaspipette Herstellung
- Schützen die Enden des MehrFass Glaskapillaren (fünf Fässer in H-Konfiguration) mit Schrumpfschlauch, um einen besseren Griff zu den Abzieher Klemmen zu ermöglichen und einen Bruch zu verhindern, und stellen Sie einen in der vertikalen Puller.
- Um Spitzenlängen von ~ 15 mm, setzen Sie den Abzieher auf die folgenden Parameter erhalten: Heat: 84, Sub Magnetkraft: 49, Hauptmagnetkraft: 38. Feinabstimmung diese Parameter entsprechend der speziellen Einrichtung, sowie nach dem Wechsel der Heizkörper.
- Ziehen Sie die Kapillare zwei Pipetten mit den Spitzen zu erhalten verschlossen. Montieren einer Pipette auf einem Objektträger mit Knetmasse und brechen die Pipettenspitze unter dem Mikroskop, bis der Außendurchmesser ~ 20 - 30 & mgr; m, mit einer feinen Schere oder Zange oder der flachen Seite eines Skalpells. Wenn der gebrochene Kante zu rau ist, verfeinern sie die Tetraboratraupentechnik in dem Schritt 1.7 beschrieben ist.
- Legen Sie eine Wolframelektrode (aus dem Abschnitt 1) in einer Halterung, die mit einer 20 G-Nadel am Ende einer 3-Achsen-Miniatur-Mikropositioniersystem montiert auf dem Mikroskop Hirsche. Mit einer Pinzette, biegen Sie das Ende der Elektrode von 5 bis 10 °, ~ 30 mm von der Spitze.
- Unter dem Mikroskop die Wolframelektrode über die mehrgehäusigen Spitze sorgfältig auszurichten. Einmal ausgerichtet sind, senken die Elektrode bis zur Berührung der mehrgehäusigen, passend in die Nut zwischen den beiden oberen Fässern. Schieben Sie die Spitze der Elektrode, bis er ragt ~ 15 bis 20 & mgr; m entfernt von der Spitze des mehrgehäusigen. Bilden den Winkel zwischen der Elektrode und dem mehrgehäusigen so klein wie möglich, eine bessere Bindung und einem dünneren Ensemble zu erhalten.
- Tragen Sie einen kleinen Tropfen lichthärtbaren Klebstoff ~ 5 mm von den Spitzen entfernt. Seien Sie vorsichtig, der Kleber nicht die Spitze nicht erreicht die mehrgehäusigen Kanäle zu vermeiden, blockiert.
- Cure den Kleber ein blaues Licht LED-Lampe verwendet wird. Wiederholen Sie die Beleimung / Härtung, wenn nötig, für eine bessere Bindung.
- Bewegen Sie den Mikroskoptisch sanft bis zum Ende der Wolframelektrode aus ihrer Halterung gelöst wird. Entfernen Sie die Huckepack-Ensemble aus der Folie.
- Wickeln Sie the mittleren Abschnitt der Elektrode Huckepack in einer kurzen Länge von Schrumpfschlauch und eine schnelle Aushärtung Epoxy geeignet für Glas gelten weiterhin die Wolframelektrode auf die mehrgehäusigen zu sichern.
3. Arzneimittel für Microiontophoresis
Anmerkung: Die Medikamente für microiontophoresis verwendet wird, muss eine elektrische Ladung, wenn sie in Wasser gelöst. Schauen Sie sich die Literatur, um zu sehen, ob das Medikament von Interesse für dieses Verfahren geeignet ist. Hier wird das Verfahren zur Gabazin, ein Antagonist des GABA A Rezeptor, beschrieben.
- Filter destilliertem Wasser mit einem 0,2 & mgr; m Spritzenfilter, um das Wasser zu sterilisieren und sichern keine gelösten Stoffe enthält. Bereiten Sie ~ 1000 ul 20 mM Gabazin diese mit destilliertem Wasser.
- Stellen Sie den pH-Wert der Verdünnung auf 4 mit 0,2 um filtriert NaOH eine fein Spitze pH-Elektrode.
- Lagern Sie 100 bis 200 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C. Auftauen am Tag der Aufnahme. An diesem Tag, bevor das Tier zurückhalten(- 5 ul 3) der mehrgehäusigen Elektrode mit den Drogen, mit einem 100 & mgr; l-Mikrospritze mit einem flexiblen Kunststoff-Nadel ausgestattet, die Fässer ed füllen.
4. Chirurgie und Headpost Implantierung
- Führen Sie Experimente in zwei männlichen CBA / J - Mäuse (Mus musculus) mit einem Gewicht von 27 und 30 g. Folgen Sie chirurgische und Aufnahmeverfahren von Bryant und Kollegen 29, Portfors und Mitarbeiter 30-32 und Duque und Malmierca 26.
- In den Tagen vor der Operation, behandeln die Tiere und gewöhnen sie an die Aufnahmekammer, indem sie frei zu erkunden. Führen Sie 3 Sitzungen pro Tag, jede Dauer von mindestens 30 min. Auf diese Weise werden die Tiere während der Aufnahmen ruhiger und bequem sein.
- Anesthetize die Maus eine Mischung aus Ketamin (50 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg) injiziert mit intramuskulär. Mit dieser Dosis ist das Tier tief narkotisierten für etwa 1 Stunde. Geben Sie ergänzende Dosen von einem third der ursprünglichen Dosis nach Bedarf.
- Legen Sie das Tier auf einer Heizdecke eingestellt mit einer Temperatur von 38 ± 1 ° C zu halten und zu stabilisieren, den Kopf des Tieres in einem stereotaktischen Rahmen mit Hilfe von zwei Ohr Bars und einen Happen bar. Achten Sie darauf, nicht das Trommelfell mit den Ohrstangen zu durchbohren.
- Schützen Sie die Augen, die durch einen Tropfen ophthalmische Gel anwenden.
- Rasieren Sie die Kopfhaut mit einer Schere und anwenden PVP-Jod, die Haut zu desinfizieren.
- Mit einem Skalpell machen einen Schnitt entlang der Mittellinie des Schädels zu entlarven und das Periost einfahren Abdeckung des parietalen und die mehr rostralen Teil der Hinterhauptsknochen.
- Kleben Sie ein leichtes Duraluminium headpost (Gewicht ~ 0,65 g, Länge 30 mm, 2A) mit einem runden und flachen Boden (5 mm Durchmesser) auf dem Schädel. Kleben Sie einen Silberdraht bis in die Mitte des headpost seinen Enden frei bleiben. Der Silberdraht als Referenzelektrode für die elektrophysiologische Aufzeichnung verwendet werden.
- Tragen Sie eine dünne Schicht aus light-härtbarer Klebstoff auf dem Schädel und der Basis des headpost. Warten Sie 10 Sekunden und legen Sie die headpost über den rostralen Bereich der Scheitelbeine, entlang der Mittellinie.
- Für eine effektive Bindungsstärke, kurieren Licht der Klebstoff eine blaue Lichtquelle für 20 Sekunden verwendet wird.
- Bohren Sie drei Löcher um und hinter der Basis des headpost mit einer elektrischen Bohrmaschine und einen kleinen Bohrer.
- Legen Sie zwei Uhr Schrauben (~ 2 mm Länge) in den Bohrungen als zusätzliche Kontaktpunkte zwischen dem Schädel und dem heads zu dienen. Die Schrauben benötigen 1½ Umdrehungen eine bequeme Passform zu erreichen. Testen Sie die Schrauben mit einer Pinzette, damit sie nicht lose sind.
- Legen Sie die Spitze des Silbererdungsdraht in das dritte Loch sicherstellen, dass es in Kontakt mit der Dura. Tragen Sie eine kleine Tropfen Wasser beständig Cyanacrylatkleber den Draht an den Schädel zu binden.
- Bewerben lichthärtenden Komposit die Bindung des headpost mit dem Schädel zu verstärken. Decken Sie die Basis des headpost, der geringe Teil des Silberdraht,und die Schrauben, wobei darauf geachtet, nicht hinter Lambda erweitern, um Zugang zu ermöglichen während der Aufnahme. Cure eine blaue Lichtquelle.
- Ziehen Sie den Muskel an der Rückseite des Halses in der Nähe seiner Einführung auf dem Schädel. Mit einem kleinen Stanze (2,35 mm Durchmesser), bohren Sie ein rundes Fenster knapp unter Lambda-Naht und lateral der Mittellinie, den Colliculus inferior (IC) zu belichten. Wenn die Grenzen lose sind, ziehen Sie die Abdeckung Knochen mit einer feinen Pinzette nach oben. Wenn die Blutung auftritt, mit kaltem steriler Kochsalzlösung, ihn zu stoppen.
- Machen Sie eine kleine (~ 1 mm breit und ca. 1 mm hoch) Wand um das Fenster mit Verbund und lichthärte es.
- Decken Sie den exponierten Schädel und Muskel mit antibiotischen Salbe. Dann benetzt die exponierte Oberfläche des IC mit steriler Kochsalzlösung und decken Sie es mit Vaseline, Füllen der gut erzeugt wird, nachdem die Mauer zu machen um das Aufnahmefenster.
- Injizieren Buprenorphin subkutan (0,03 mg / kg, verdünnt 1:10 in steriler Kochsalzlösung) als Analgetikum.
- Halten Sie das Tier auf ter Heizdecke, bis er aufwacht und sie wieder in die Gehäusekäfig von der Operation für drei Tage vor der Aufnahme-Sessions zu erholen. Haustieren in einzelnen rat's Gehäusekäfig zu verhindern Käfiggenossen das Gelee Reinigung aus und trennen Sie das Metallgitterabdeckung headpost berühren. Legen Sie eine Anreicherung in den Käfig, wenn das Tier einzelne untergebracht ist. Auch ändern sich täglich die Sägespäne-Infektion zu verhindern und sorgfältig prüfen, ob das Tier erholt sich richtig und zeigt keine Anzeichen von Unwohlsein. Prüfen Sie auch, ob Vaseline über das Aufnahmefenster ist die freiliegende Gehirn zu schützen.
5. Die elektrophysiologischen Aufzeichnung und Microiontophoresis
- Nach der Wiederherstellung geben das Tier Zeit, um die Aufnahmeumgebung zu akklimatisieren und zurückhaltend seinen Kopf. Akklimatisieren das Tier durch die headpost an der Halterung fixiert wird, während die Maus auf einem maßgeschneiderten gepolsterten Schaumstoff Verzögerer zu seiner Körpergröße (2B) geschnitzt sitzt. Dies wird limes die Bewegungen der Maus und wird auf seiner Ruhe beitragen.
- Beginnen Sie mit 10 Minuten-Sitzungen und erhöht sich schrittweise die Dauer bis 120 min auf. Während der Sitzung belohnen , die Tiere mit süßen Flüssigkeiten (Kondensmilch, verdünnt 30:70 in Wasser) in bestimmten Abständen 33. Später, während der Aufnahme-Session, geben den gleichen Lohn zu Beginn und am Ende der Sitzung oder während kein Neuron isoliert ist.
- Wenn Tier sehr wird vor der Aufnahme angeregt, injizieren die mildes Beruhigungsmittel Acepromazin (2 mg / kg, intraperitoneal). Nach dem neuronalen System von Interesse kann das Beruhigungsmittel Ihre Ergebnisse beeinflussen.
- 10 min - für 5 Lassen Sie das Tier frei die Aufnahmekammer erkunden.
- Platzieren Sie den Körper des Tieres in den Schaum nach Maß gepolsterten Verzögerer (2B).
- Sichern die headpost an einem Halter an dem stereotaktischen Rahmen (Abbildung 2C). Dies ist eine gute Zeit, um das Tier eine flüssige Belohnung zu geben.
- Cover Körper des Tieres mit einem Baumwolltuch und lose befestigen einen Plastikhalbzylinder und Klebeband.
- Entfernen Sie die Vaseline aus dem Aufnahmefenster und spülen Sie mit warmem steriler Kochsalzlösung.
- Nehmen Sie die neuronale Aktivität und iontophoretische Anwendung von Gabazin.
- Legen Sie die mehrgehäusigen Elektrode auf seiner Halterung, gesteuert durch einen Mikroantrieb und zu einem Mikromanipulator angebracht.
- Verbinden Sie die Kabel für die Aufnahme, mit kleinen Krokodilklemmen. Verbinden den positiven Anschluß an das Ende der Wolframelektrode und die Erdungsklemme an der Silberdraht der Dura, die Kontakte.
- Platzieren eines unbeschichteten Silberdraht in jedem Lauf, so das eine Ende in Kontakt mit der Lösung und das andere Ende zugänglich ist. Verbinden Sie diese Enden mit dem microiontophoresis Gerät gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Bewegen Sie die mehrgehäusigen Elektrode, bis die Spitze berührt die Oberfläche des Gehirns. Tragen Sie warme sterile Kochsalzlösung die Austrocknungs von th zu verhinderne Hirngewebe. An diesem Punkt einen Erhaltungsstrom gelten (-10 nA für Gabazin, überprüfen Sie die Literatur für das jeweilige Arzneimittel) die Freisetzung des Wirkstoffs zu vermeiden, von der Zylinderspitze, während für Single-Unit-Aktivität suchen.
- Verwenden von Standardtechniken für einzelne Neuron extrazelluläre Aktivität zu isolieren. Besorgen Sie sich die Frequenzantwortbereich (FRA) des Neurons, dh die Kombination von Frequenzen und Intensitäten der Lage zu evozieren eine Antwort , weil das Neuron zu diesen Klängen 34-36 empfindlich ist.
- Wählen Sie zwei Frequenzen (f1 und f2), die ein ähnliches Feuerrate und Muster hervorzurufen. jede dieser Frequenzen als selten und wiederkehrenden Reiz unter dem oddball Paradigma präsentieren.
Hinweis: In Kürze, in der oddball Paradigma, einer Frequenz (f1) als die wiederkehrenden Reiz mit einer hohen Wahrscheinlichkeit des Auftretens präsentiert wird, während die zweite (f2) die selten auftretenden abweichendes Stimulus, dazwischen zufällig unter den sich wiederholenden Einsen. In einer zweiten oddball Sequenz, die relativeWahrscheinlichkeiten der beiden Reize umgekehrt sind. Einzelheiten des Stimulations Paradigma wurden zuvor 22,37 beschrieben. - Lassen Sie die Gabazin den Strom auf positive Werte Verschiebung (10 - 20 nA). Erhalten Sie erneut die FRA und wiederholen Sie den oddball Paradigma unter dem Gabazin Anwendung. Pflegen Sie den Auswurf, bis eine sichtbare Wirkung in der Feuerrate beobachtet wird; Es dauert in der Regel 5 bis 20 min, abhängig von der speziellen Droge, ihre Konzentration und die Größe des Ausstoßstromes. Wiederholen des Aufzeichnungsprotokolls die Werte unter der Wirkung des Arzneimittels zu erhalten.
- Stoppen Sie die Injektion durch den Strom auf Retentionswerte zurück. Warten, bis die Wirkung des Medikaments abzuwaschen durch die Überwachung, dass die FRA oder Antwort auf das oddball Paradigma gibt Werte zu steuern.
Hinweis: Die Aufnahme-Sessions dauern kann 2 - 3 Stunden pro Tag und sollte früher beendet werden, wenn das Tier Anzeichen von Beschwerden zeigt oder zu kämpfen. Geben Belohnung Flüssigkeit und decken die Aufnahme chBernstein mit Vaseline.
6. Datenanalyse
- Messen Sie die FRA vor und während der Gabazin Einspritzung sowie die Höhe der SSA.
- Quantifizieren die Stärke der SSA Antwort durch die Common-SSA - Index (CSI) und der frequenzspezifischen SSA - Index (SI) , wie zuvor beschrieben 19,22,23,38,39. Die CSI und SI spiegeln die normierte Differenz zwischen dem neuronalen Reaktion auf den seltenen Stimulus und die Antwort auf die sich wiederholenden eins. Positive CSI und SI-Werte geben die neuronale Antwort (Spikes pro Stimulus) war höher als selten, um sich wiederholende Töne.
- Vergleichen von Daten aus der Steuerung und Drogen Abwerfzustand.
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Representative Results
Wir nahmen die Single-Unit-Aktivität von 4 gut isolierte Neuronen des IC. Typische Signal-zu-Rausch - Verhältnisse bei der extrazellulären Aufzeichnungen in wach Mäusen sind in 3B gezeigt. 4A zeigt den Frequenzgang Bereich (FRA) jedes Neurons vor und während der Blockade der GABA A -Rezeptoren mit Gabazin. Ein Inkrement in der Antwortstärke (spikes / Stimulus) sowie einer Verbreiterung der spektralen Verschiebung beobachtet. Das Inkrement in der evozierten Reaktion zeigte sich auch in den akkumulierten peri-Stimuluszeit Histogramme von dem neuronalen Reaktion auf allen Frequenzen und Intensitäten dargestellt (4B) erhalten.
Ein oder zwei Paare von Frequenzen innerhalb der FRA Neuron (Kreuze in 4A) wurden ausgewählt , als sich wiederholende oder seltene Töne in einem oddball Paradigma präsentiert werden, zu study das Niveau der SSA in ihren Antworten. Beispiel für zwei Neuronen, die schall evozierten Reaktionen auf jeder Frequenz (f1 und f2) vor und während der Injektion Gabazin werden als Punktrastern in 5A, B gezeigt. Für die beiden Beispiel Neuronen, gab es eine deutliche Veränderung in der Klang evozierten Reaktion wie im Punktraster und PSTHs beobachtet.
Ebenso erhöht die lokale Blockade der GABA A -Rezeptoren die neuronale Reaktion auf die große Mehrheit der seltenen und sich wiederholende Töne (5C) in Übereinstimmung mit unseren früheren Studie 16. Verschiedene Ebenen der SSA wurden in den neuronalen Reaktionen auf f1 und f2 beobachtet, die in positive CSI widerspiegelte (CSI-Intervall: -0,26 bis 0,43, 0,25 ± 0,23) und SI-Werte (SIs Intervall: -0,41 bis 0,83, 0,25 ± 0,23) . Bei den meisten der Fälle, verursacht die erhöhte Reaktion auf die sich wiederholenden Ton eines Tropfens in diesen Indizes wie in 5D beobachtet
Abbildung 1. Das Material für die Herstellung von Wolframelektroden. (A) Elektrodenausrichtungswerkzeug, mit einigen Wolframdrähten an Ort und Stelle. Das leichtere Stück auf der linken Seite ist ein Anschlag für die Drähte. Die Scherenspitze zeigt die Seite als Leitfaden verwendet , um die Drähte auf die gewünschte Länge zu schneiden. (B) Spindel entleeren. (C) Spindel mit einer Charge von Elektroden angebracht ist , und an einem Halter ruhen. Bitte hier klicken , um eine größere Version zu sehen dieser Figur.
Abbildung 2. Zubehör für Awake Mäuse Recordings. (A) Headpost. (B) Nach Maß gepolsterte Schaum Verzögerer. Platz ter Maus zwischen den beiden Stücken, so dass der Kopf außerhalb. (C) Änderungen am Stereotaxierahmen. Der headpost Halter (obere Leiste) hilft bei headpost Implantation und hält den Kopf während der Aufnahmen. Die Aufbisseinsatz (untere Leiste) wird nur während der headpost Implantation verwendet. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Beispiel für Aufnahme in die Awake Maus. (A) Frequenzantwortbereich eines Neurons von der Maus IC. (B) Die Wellenformen der von diesem Neuron aufgezeichnet Spikes. (C, D) Dot - Raster und peristumulus Zeit - Histogramm aus diesem Neuron verzeichnete ein oddball Paradigma bei den Frequenzen verwendet wurden, zeigten durch die Punkte in (A). Gezeichnet von Datenin Duque und Malmierca 26 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Auswirkung der Blockade des GABA A -Rezeptoren auf der spektralen und zeitlichen Antworteigenschaften. (A) Frequenzantwortbereich der vier IC aufgezeichnet Neuronen vor und während der Injektion von microiontophoretic Gabazin. Die schwarzen Kreuze in (A) zeigen die Frequenzen so selten und repetitive Klänge präsentiert werden ausgewählt. (B) , um den Antwortbereich peri-Stimuluszeit Histogramme der neuronalen Reaktion auf allen Frequenzen und Intensitäten dargestellt Gesammelte zu konstruieren vor und während der Einspritzung von Gabazin. Die schwarzen Balken zeigen die Tondauer.Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Wirkung der Blockade der GABA - A - Rezeptoren auf der Antwort auf Repetitive und Rare Sounds. (A, B) Dot Rastern des spiking Reaktion auf ein Paar von Frequenzen , wie selten (rot, 10%) vorgelegt und wiederkehrenden Reiz (blau, 90%) vor und während der Anwendung von Gabazin. Jede Frequenz wird in zwei Sequenzen gegeneinander, so daß ein jeder wurde als Seltenen und repetitive dargestellt. Die schattierten Hintergrund gibt die Dauer des Reizes. (C). Single-neuron Antworten auf sieben Paare von Frequenzen als die seltenen und als sich wiederholende Ton präsentiert vor und während der Anwendung von Gabazin. (D) Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die microiontophoresis von neuroaktiven Substanzen in wachen Tieren ist eine leistungsstarke Technik zur Sonde und die Rolle der spezifischen synaptischen Eingaben auf die Aktivität der einzelnen Neuronen 40,41 sezieren. Noch wichtiger ist, ermöglicht dieses Verfahren die Bestimmung der Auswirkungen der Neurotransmitter und Neuromodulatoren auf neuronale Schaltkreise ohne die mögliche Störung von Anästhetika. Hier zeigen wir , dass die Anwendung von Gabazin in dem IC von wach Mäusen robust die Frequenzeinstellung (4A) geändert wird , um die zeitliche Antwortmuster (4B) und die SSA (Abbildung 5).
Die Haupteinschränkung des beschriebenen Verfahrens ist die relativ kurze Aufnahmezeit (~ 3 h), die durch die Höhe der Gewöhnung des Tieres zu den Aufnahmen bestimmt. Auf der anderen Seite können mehrere Aufnahmen auf dem gleichen Tier durchgeführt werden. Mit microiontophoresis unklar ist, wie weitdie angewandten neuroaktiven Substanzen diffundieren in das umgebende Gewebe. Daher kann eine mögliche Wirkung auf die neuronale Netzwerkaktivität hervorgerufen werden, indem nicht nur das aufgezeichnete Neurons zu beeinflussen, sondern auch die umgebenden Glia und neuronalen Zellen. Zum Beispiel, Süßigkeiten und Kollegen 42 haben gezeigt , dass bestimmte iontophoretisch abgegeben Moleküle, die nicht schnell entfernt werden, bis 600 & mgr; m diffundieren können. In den Mäusen IC würde dieser Bereich den größten Teil des Umfangs der dendritischen Dorne decken, sondern auch die neuronale Antwort benachbarter Zellen beeinflussen. Zusammenfassend wird das Arzneimittel durch Iontophorese freigesetzt nicht als intrazelluläre Arzneimittel Dialyse räumlich beschränkt ist , die die Dissektion in feineren Details der synaptischen Eingaben in das Zielneurons und Test lokalen Netzwerk ermöglicht verarbeitet 16,43, sie präziser als andere experimentelle ist Verfahren verwendet, um das Niveau der Neurotransmission oder Neuromodulation, wie systemische Injektionen, die Verwendung von optogenetischen Techniken, oder Push-pul zu manipulierenl Dialyse.
Der Spitzendurchmesser der Glaspipetten und das Ausmaß der Retention und Injektionsströme sind Schlüsselfaktoren, um zu vermeiden, nicht-spezifische Arzneimittel Leckage in das Gewebe zu überwachen. Die niedrigen Injektionsströme (in der Größenordnung von mehreren zehn nA) begrenzen die Ausbreitung des Medikaments Tonaufzeichnung von Neuronen nahe beieinander. Beispielsweise drei der vier Neuronen, die als Beispiele (Neuronen 1 - 3) wurden auf der gleichen Spur mit Abständen von 16 bis 800 um zwischen ihnen aufgezeichnet. Trotz der kurzen Abstand von 16 um zwischen Neuron 1 und 2 ist eine deutlich unterschiedliche Reaktion des Neurons 2 beobachtet (Abbildung 4).
Einige Alternativen zu den vorgeschlagenen Huckepack-Konfiguration zuvor verwendet worden. Eine von ihnen besteht in der Verwendung eines der mehrgehäusigen Pipetten zur Aufnahme, anstelle einer separaten Elektrode. Während die Konstruktion der Ensembles in diesem Fall weniger kompliziert ist, gibt es Nachteile. First, alle Kanäle den gleichen Öffnungsdurchmesser an der Spitze haben, die nicht für Aufnahme und Medikamentenabgabe optimal sein kann. Auch verhindert der vorstehende Elektrodenspitze in der Huckepack Konfiguration eine Beschädigung der Zielzelle wahrscheinlich durch die breitere Spitze des mehrgehäusigen verursacht. Die zweite gemeinsame Alternative ist die Verwendung von Single-Barrel Glaspipetten für 15,44 anstelle von Wolframelektroden aufnehmen. Glaselektroden sind einfach auf die erforderlichen Abmessungen herzustellen, sondern neigen dazu, bei langen Aufnahmen zu verstopfen oder wenn tief in das Gehirn wandern, so in unserer Erfahrung Wolframelektroden bieten zuverlässiger Aufnahmen. Darüber hinaus wird durch Wolframelektroden ist es möglich , elektrolytische Läsion zu erzeugen , die Aufnahmestellen zu lokalisieren, ohne die weiteren aufwendigen histologischen Verfahren erforderlich , wenn ein neuronales Tracerinjektion 45 verwendet wird. Die Verwendung von Glaspipetten mehrgehäusigen ermöglicht die Freigabe von mehreren Agonisten und / oder -Antagonisten in unmittelbarer Nähe der AufzeichnungsWebsite, die ein großer Vorteil ist, wenn die Wechselwirkung zwischen Neurotransmitter-Systeme auf die sensorische Verarbeitung untersucht ist.
Die Verfahren in der vorliegenden Protokoll für die Herstellung der Huckepack beschriebenen Elektroden machen es möglich, Aufzeichnungselektroden entsprechend den spezifischen Anforderungen des Experiments und der Eigenschaften des Zielbereichs von Interesse in einer systematischen, noch angepasst Weise herzustellen. Darüber hinaus werden die Materialien für die headpost Fixierung üblicherweise in der Zahnheilkunde verwendet, so dass sie leicht verfügbar sind. Somit sind die kritischen Schritte in dem Protokoll das Tier Gewöhnung und das Ätzen der Wolframelektroden, welche die Hauptfaktoren sind, um gut isolierte Neuronen und stabile elektrophysiologische Aufzeichnungen beiträgt. Insgesamt ist diese Technik ist relativ einfach, kostengünstig und sehr zuverlässig, wie ein Mittel, um die Rolle von mehreren neuro Substanzen auf Einzel- oder Multi-Unit-neuronale Aktivität in wach zu studieren, Kopf-verhaltene Mäuse.
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Acknowledgments
Dieses Projekt wurde von der Mineco finanziert gewährt BFU201343608-P und PSI2013-49348-EXP und die JCYL Zuschuss SA343U14 zu MSM und MRC Kernfinanzierung ARP. YAA hielt eine CONACyT (216.106) und SEP-Stipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten wire | Harvard Apparatus LTD | 33-0099 | 0.005 inches x 3 inches |
| Borosilicate glass capillary | Harvard Apparatus LTD | 30-0053 | Borosilicate standard wall without filament, 1.5 mm OD, 0.86 mm ID, 100 mm long |
| Multibarrel glass capillaries | World Precision Instruments | 5B120F-4 | 5-barrel capillary, 4 inches long, 1.2 mm OD, with filament |
| Diaplus | DiaDent | 2001-2101 | Light-curing adhesive, used to attach the tungsten electrode to the glas multibarrel pipette |
| G-Bond | GC Corporation | 2277 | Light-curing adhesive, used to attach the headpost to the animal's skull |
| Charisma | Heraeus Kulzer | 66000087 | Light-curing composite, used to reinforce the bond of the headpost with the skull |
| Araldit Cristal | Ceys | 2-component expoxy, used to further secure the attachment of the tungsten electrode to the glass multibarrel pipette | |
| Heating blanket | Cibertec | RTC1 | |
| Stereotactic frame | Narishige | SR-6N | Modified for mice |
| Microiontophoretic device | Harvard Apparatus LTD | Neurophore BH-2 | Including IP-2 iontophoresis pumps (one for each drug delivery channel) and a balance module |
| Multibarrel glass pipette puller | Narishige | Model PE-21 | |
| LED lamp | Technoflux | CV-215 | 5 W, 430-485 nm |
| MicroFil | World Precision Instruments | MF34G-5 | Flexible plastic needle, 34 AWG |
| Imalgene | Merial | Ketamine, 100 mg/mL | |
| Rompun | Bayer | Xylazine, 20 mg/mL | |
| Gabazine / SR-95531 | Sigma | S106 | Prepare ~ 1000µl of 20 mM gabazine in distilled water and adjust the pH to 4 |
References
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