Introduction
Os glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos e glicosaminoglicanos constituem as quatro classes principais de hidratos de carbono complexos, heterogéneos colectivamente conhecidas como glicanos. Como componentes omnipresentes e integral da membrana do plasma, glicocálice, e a matriz extracelular e fluidos, glicanos participar em tais processos bioquímicos diversos como a endocitose, o tráfico intracelular, motilidade celular, a transdução de sinal, reconhecimento molecular, a activação do receptor, a adesão celular, a interacção hospedeiro-patogénio , intercelular comunicação, vigilância imunológica, e iniciação resposta imune. 1 Presente em quase todos os domínios da vida, enzimas conhecidas como glicosiltransferases que constroem polímeros glicano agir em conjunto com glicosídeo hidrolases (também conhecido como glicosidases, que quebram glicanos) para a construção, remodelação, e finalmente produzir polímeros finalizado glicano 2. Embora cada glicosiltransferase pode operar em diferentes glicoconjugados, uma glicosiltransferasegeralmente forja uma ligação glicosídica e linkage--anómero específico através da transferência do radical monossacárido de um determinado nucleótido activado dador de açúcar (por exemplo, GDP-fucose) a uma certa categoria de aceitadores nucleofílicos (por exemplo, um lípido, polipéptido, ácido nucleico, ou o cultivo oligossacárido). Estima-se que mais de 50% de proteínas (especialmente de membrana e proteínas secretoras) são pós-tradução modificada por glicosilação 3 cálculos combinatórios rudimentares fornecer uma apreciação para a variabilidade considerável, versatilidade e especificidade reconhecida às glicoproteínas de glicosilação.; Por exemplo, se um substrato de polipéptido tem apenas 10 locais de glicosilação e de cada local pode formar uma ligação glicosídica com uma das extremidades redutoras apenas 3 de monossacárido diferentes, então, teoricamente, a glicoproteína final pode assumir 3 10 = 59049 identidades distintas. Em glicoproteínas, ligações glicosídicas geralmente formar com a cadeia lateral de azoto óf resíduos de asparagina na sequência Asn-X-Ser / Thr (X pode ser qualquer aminoácido excepto prolina) para se obter N-glicanos e 2-hidroxilos de cadeia lateral de resíduos de serina e treonina para se obter ó-glicanos 4. A composição da glycome de uma célula (ou seja, o seu complemento de produtos de glicosilação) é único e limitado, porque, com poucas exceções, glicosiltransferases exibem doador estrito, receptor, e especificidade de ligação. 5 glicoproteínas importante e abundante no plasma sanguíneo sofre glicosilação aberrante como consequência a jusante de expressão glycosyltransferase anormal e atividade devido a muitas condições patológicas, especialmente câncer e doenças inflamatórias 6-24.
Principalmente devido a factores epigenética, o glycome é significativamente mais diverso, dinâmico e complexo do que o proteoma e transcriptoma 25,26. Enquanto cerca de 1% do genoma de mamífero codifica a formação, modificação, emontagem de glicanos, 27 de glicosilação procede de uma forma um contraste marcante-não-modelo orientado para polipéptido e biossíntese do ácido nucleico. A interação entre a quantidade relativa e atividade de enzimas de glicosilação e tais fatores ambientais como a disponibilidade de nutrientes e precursor em última instância, determina a natureza, taxa e extensão da glicosilação. 5,28 embriogênese (por exemplo, determinação e diferenciação), ativação celular e progressão através a expressão do gene influência do ciclo celular (isto é, transcrição e tradução) e alterar a identidade e quantidade de glicosiltransferases disponíveis, cuja actividade é o determinante a montante imediata do perfil de glicano da célula. Porque (algumas das) a proliferativa, adesivo e propriedades invasivas das células cancerosas se assemelham aos de células embrionárias normais, alterações específicas em vias biossintéticas glicano (por exemplo, a acumulação de precursor, expressão desregulada, aberranmodificação t, truncamento estrutural, ou formação de romance) servem biomarcadores de câncer como universais que indicam várias etapas da formação do tumor, progressão, migração e invasão de 29 Apesar de glicosilação é altamente complexo, é evidente que só algumas alterações na glicosilação pode habilitar carcinogênese e metástase.; Aparentemente, certos "aberrantes" produtos de glicosilação, de facto beneficiar células cancerosas, permitindo-lhes escapar reconhecimento imunológico e sobreviver às demandas de migração em ambientes intravascular e metastáticos inóspitas. 28,30,31 Não surpreendentemente, os experimentos revelaram que interromper ou prevenir padrões de alteração a expressão do gene e a formação de glicano aberrante pode interromper a tumorigénese. 29 no entanto, os glicanos aberrantes detectados numa amostra biofluid (por exemplo, urina, saliva, e o plasma sanguíneo ou no soro) pode não ser indicadores directos de cancro (ou outra doença), mas sim a jusante resultados de sutil, mas significativaalterações no sistema imunitário ou ramificações quantificáveis de uma condição perniciosa num órgão imprevisível. 32
Embora eles fornecem informações universal sobre a glycome, muitas técnicas Glycomics baseada em interação molecular (por exemplo, a lectina / matrizes de anticorpos e metabólica / rotulagem covalente) dependem da detecção de estruturas de glicano inteiros e não fornecem informações estruturais detalhadas sobre glicanos individuais. Em contraste acentuado, de espectrometria de massa (MS) pode ajudar a identificar e quantificar as estruturas de glicano individuais e revelar a informação estrutural como os sítios de ligação para núcleos de polipéptido. expressão ou actividade de uma única glicosiltransferase desregulada pode iniciar uma cascata de eventos moleculares prejudiciais em múltiplas vias de glicosilação. Porque cada glicosiltransferase pode operar em mais de um substrato glicoconjugada e em diferentes polímeros glicano crescimento, cascatas biossintéticas desregulados deu disproporcionalmente aumento da quantidade de apenas um produto glicano mas várias classes heterogêneas de glicanos aberrantes em fluidos intra ou extracelulares. 33 No entanto, tais glicanos aberrantes originais são por vezes considerada impraticável como biomarcadores para o câncer ou outras patologias glicano-afetiva, porque, em comparação com o grande piscina de glicanos bem regulamentado, estes glicanos aberrantes representam uma fração muito pequena que pode muitas vezes permanecem indetectáveis mesmo por técnicas tais altamente sensíveis como espectrometria de massa. Por exemplo, em fluidos corporais intra- e extracelulares, o amplo espectro de proteína de concentração (que abrange as oito ordens de grandeza) pode impedir a detecção de glicoproteínas escassos que são mascarados por as espécies mais abundantes. 32 Além disso, a determinação da actividade de glicosiltransferase continua a ser uma prática considerável e desafio teórico, porque muitas glicosiltransferases estão ausentes em fluidos biológicos clínicos ou se tornam inativos ex vivo. Apesar da dificuldade de consistenTLY detectar e quantificar quantidades ultra-pequenas de glicanos todo único, os praticantes de espectrometria de massa têm feito enormes progressos em direção a empregar glicanos intactas como marcadores clínicos. Desenvolvemos recentemente uma abordagem complementar à análise de glicanos intactos que, empregando GC-MS, facilita a detecção de todas as filiais-ponto constituinte e monossacarídeos específicos de ligação ( "nós glicano") que em conjunto conferem especificidade para cada glicano e em muitos casos servem directamente substitutos como moleculares que quantificam a atividade relativa do glycosyltransferase culpado (s).
Desde a sua primeira aplicação directa relatado para análise de glicano, em 1958, a cromatografia gasosa (GC) provou ser uma técnica poderosa para analisar per-metilada mono- e dissacáridos, 34 determinar a sua anomericity e a configuração absoluta, e separá-los por análise de espectrometria de massa subsequente. 35 entre 1984 e 2007, Ciucanu e colegasintroduzida e refinado uma técnica permetilação glicano à fase sólida que empregue o hidróxido de sódio e de iodometano, seguido por extracção líquido / líquido de glicanos permetilado utilizando água e clorofórmio. 35,36 Entre 2005 e 2008, Kang e co-trabalhadores integrado um spin-horário abordagem -column na etapa permetilação. 37,38 Em 2008, o grupo de pesquisa Goetz concebeu uma fase sólida quantitativa permetilação método glicano-profiling usando laser assistida por matriz dessorção de ionização (MALDI) espectrometria de massa para comparar e, eventualmente, caracterizar invasiva e não cancro da mama células -invasive; 39 em seguida, em 2009, a equipe Goetz combinada enzimática e técnicas de liberação químicos para clivar o glicanos de glicoproteínas intactas em um esquema de permetilação em fase sólida altamente alcalina 40 Embora o procedimento Goetz facilitado permetilação simultânea e liberação química. de glicanos S, foi aplicada apenas a glico pré-isoladoproteínas. Nós modificamos essa técnica em 2013 e adaptou-o para fluidos biológicos não fraccionadas inteiros e amostras de tecidos homogeneizados através da incorporação de ácido trifluoroacético (TFA) a hidrólise, redução e acetilação etapas. 33 Estes passos adicionais também liberam glicanos de glycolipids e N -ligada glicanos de glicoproteínas e convertê -los em acetatos parcialmente metilados alditol (PMAAs, Figura 1), cujos padrões de metilação-e-acetilação distintivo facilitar a análise por GC-MS e exclusivamente caracterizar os nós de glicano constituintes no polímero glicano intacta inicial 41 (Figura 2). 33 por fim, esta procedimento produz um retrato compósito de todos os glicanos de uma biofluid complexo baseado em quantificação directa, relativa de glicano características únicas, tais como "fucosilação núcleo", "6-sialilação", "GlcNAc bissector", e "beta 1-6 ramificação" - cada um derivado a partir de um único chromatograp CG-eMpico hic. Este artigo apresenta uma maior optimização do permetilação, acetilação, isolamento, e fases de limpeza, juntamente com a melhoria do modo de quantificação relativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Atenção: Evite contato com a pele / olho com qualquer um dos reagentes utilizados neste experimento. Após a exposição, lave bem a área afetada com água e procurar assistência médica imediata.
1. permetilação e Glycan Extração
- Preparação coluna
- Obter um número de unidades de coluna de microcentrífuga de centrifugação das amostras a ser analisadas. Quebrar e retirar as tampas de tubos de reservatório de plástico. Colocar um filtro de microcentrífuga de mini em cada tubo de reservatório. Colocar as colunas de centrifugação de microcentrífuga montados (contendo o mini-filtros) num suporte de tubos de microcentrífuga.
- Obter um stock de hidróxido de sódio (NaOH) esferas (20-40 mesh). Transferir parte NaOH para um pequeno barco de pesagem ou, se a umidade está causando aglomeração, um almofariz de porcelana quente como o estoque de trabalho de NaOH. Evitar o uso de aglomerados de grânulos de NaOH / NaOH ou esmagadas em pó.
Cuidado: NaOH é uma toxina potente e base corrosivo. Lavar a pele exposta / olhos com água durante 15 min. Thoroughly limpar a bancada de trabalho após a conclusão do experimento. - Usando uma colher pequena ou espátula, transferir contas de NaOH a partir do estoque trabalhando para preencher as microcentr�ugos mini-filtros com NaOH até o primeiro bisel exterior (~ 5 mm abaixo da borda). Toque os filtros de microcentrífuga cheias na bancada para embalar / condensar as contas de NaOH.
Nota: Durante esta experiência, para minimizar a adsorção de água em excesso por grânulos de NaOH higroscópicos, manter o nível de todos os líquidos adicionados (por exemplo, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, a solução de analito) acima da superfície do empacotamento de coluna de NaOH e limitar o contacto directo com o ar. - Obter um estoque de acetonitrilo (ACN). Transferência de ~ 350 mL ACN para cada mini-filtro microcentrífuga NaOH-embalados. Mantenha o NaOH submerso em ACN e remover grandes bolhas de ar por agitação com um gel de carregamento de ponta da pipeta ponta revirada.
Cuidado: Acetonitrilo é um irritante inflamável. - A centrifugação coluna
- Organizar as colunas de microcentrífuga simetricamente dentro de uma centrífuga; utilizar um tubo de equilíbrio se necessário. Evite derramar grânulos de NaOH dentro da centrífuga. Fechar a tampa do centrifugador.
- Centrífuga as colunas (contendo NaOH e ACN) para ~ 15 segundos a 2.400 × g.
- Após a conclusão da centrifugação, remover colunas de microcentrífuga da centrífuga, e descartar a ACN em um recipiente de resíduos perigosos. Manter a coluna de NaOH a embalagem intacta.
- Adicionar ~ 350 ul de dimetilsulfóxido (DMSO) a cada mini-filtro de microcentrífuga NaOH-embalado. Mantenha o NaOH submerso em DMSO e remover quaisquer bolhas de ar grandes, com uma ponta de pipeta. Como descrito anteriormente, as colunas de centrifugação para ~ 15 segundos a 2400 x g, e o descarte de DMSO, mantendo a NaOH a embalagem intacta.
Cuidado: DMSO é um mutagéneo e de irritabilidade e é facilmente absorvida através da pele. - Ligue todos os mini filtros de microcentrífuga com as fichas incluídas no filtro de spinkit. Transferir ~ 350 ul de DMSO para cada mini filtro de microcentrífuga de NaOH embalado e utilizar uma ponta de pipeta de 200 uL para remover as bolhas de ar na embalagem de NaOH de modo que o DMSO atinge todas as regiões dentro da embalagem, em seguida, NaOH. Evitar o esmagamento ou excessivamente raspando as contas NaOH; De NaOH em pó é indesejável. Terminar este passo tão rapidamente quanto possível.
- Preparação de Plasma de Controlo de Qualidade (QC) amostra (s)
Nota: Para garantir resultados consistentes em lotes experimentais, considerar o uso de pelo menos uma alíquota de uma amostra retirada de uma coleção em massa grande e homogênea do material biológico de interesse para ser analisado em cada lote. Por exemplo, se a análise do plasma sanguíneo, usar alíquota (s) de um conjunto de grandes quantidades de plasma sanguíneo do que a amostra (s) de CQ em cada lote. Processo de amostras QC na mesma maneira que as amostras desconhecidas.- Centrífuga uma amostra de estoque de plasma QC durante 4 min a ~ 10.000 × g. Durante a centrifugação, alguns precipitado de alta densidade pode resolver a the inferior e algum precipitado de baixa densidade pode flutuar para o topo do plasma. Evitar tanto ao retirar alíquota (s) de plasma.
- Passe para "1.3) Preparação de Amostras" abaixo. Em seguida, retornar a esta etapa após a centrifugação de plasma está completa.
- Retirar 9 ul de plasma QC centrifugado e transferir para um tubo de ensaio de 1,5 ml de polipropileno devidamente rotulados equipado com uma cápsula snap-fechada (doravante referida como "de 1,5 ml tubo de ensaio de plástico"). Adicionar 1 ml de água deionizada para cada alíquota; Se desejado, usar isto como um portador para o padrão interno (s).
- Adicionar 270 mL de DMSO a este controle plasma. Vortex para assegurar a dissolução completa.
- Preparação de amostra
- Obter tantos tubos de ensaio de plástico de 1,5 ml, como o número de amostras biológicas (analito).
- Transferência de 9 ul de cada (analito) para a sua amostra biológica 1,5 ml tubo de ensaio de plástico correspondente. Transferir 1 ml de água desionizada e 270 uL de DMSO a cada tubo de amostra.
- Misturar vigorosamente (por exemplo, vortex e / ou várias vezes pipeta cima e para baixo) as amostras para assegurar a completa dissolução em DMSO.
Atenção: Execute as seguintes etapas dentro de um exaustor. Utilizado nas etapas seguintes, adicionou-se iodometano (CH3 I), diclorometano (CH 2 Cl 2, também conhecido como cloreto de metileno), e clorofórmio (CHCl 3, triclorometano), são líquidos voláteis, capazes de dissolver determinados tipos de plástico (por exemplo, luvas de borracha nitrílica) . Certifique-se de usar luvas resistentes a solventes. Devido à sua baixa viscosidade, e alta pressão de vapor, estes reagentes podem escorrer a partir de uma ponta da pipeta durante a transferência. Minimizar a perda de reagente e exposição potencial, mantendo a solução estoque ao lado do navio receptor. - Transferir um volume total suficiente de iodometano para um pequeno tubo, limpo. Cada amostra de analito exigirá 105 ul de iodometano. Transferência de ~ 500 mL de diclorometano em another tubo limpo. Para evitar o entupimento da seringa, lavar a seringa com diclorometano imediatamente após a transferência de iodometano.
Cuidado: iodometano é fotossensível, volátil e potente toxina capaz de danificar o sistema nervoso central ou causar a morte se inalado ou ingerido. Diclorometano é um potencial cancerígeno, mutagênico reprodutiva e potente capaz de irritabilidade de danificar vários órgãos ou causar a morte. - Use uma seringa de analítica para adicionar 105 ul iodometano a cada amostra de analito. Cap tubos de analitos imediatamente para minimizar a evaporação iodometano. Agitar bem em vórtice e, se necessário, Centrifugar brevemente todas as amostras para assegurar que nenhum líquido permanece na tampa. Qualquer mudança de cor (por exemplo, ao marrom, roxo ou amarelo) sinaliza degradação iodometano, o que pode comprometer a seguinte reação permetilação.
- Lavar a seringa analítica utilizada para transferir iodometano com diclorometano, pelo menos, 3 vezes. Isto irá impedi-lo from entupimento. Eliminar este lavagem, juntamente com iodometano extra e diclorometano em um vaso de resíduos perigosos orgânica. Coloque tubos de ensaio utilizados em um recipiente de resíduos perigosos.
- Obter um novo conjunto de 2 ml tubos de reservatório de plástico. Remover snap-caps, se desejar.
- Desligue os filtros microcentrífuga Mini. Centrífuga as colunas desligado por 15 segundos a 2.400 × g, e em seguida, descartar os tubos do reservatório juntamente com o efluente DMSO.
- Re-ligar as colunas de spin centrifugadas, e colocá-los dentro dos tubos novos reservatórios. Número cada coluna de rotação e a sua correspondente tubo-reservatório com o mesmo número de amostra. Certifique-se que os mini tampões de filtro são apertados; potencial fuga pode ter impacto no passo seguinte. Minimizar o tempo entre a remoção de DMSO a partir das colunas de centrifugação e transferência das amostras de analito para as colunas de centrifugação.
- permetilação
- Transferir quantitativamente cada solução de amostra para seu correspondente NaOH-bead-cheia co microcentrífuga de spinlumn. Utilizar uma ponta de pipeta de 1.000 ul para este passo. Após transferência, friso aproximadamente 2 mm da extremidade de uma ponta de 200 ul e deixá-lo em o conteúdo da coluna para usar como um agitador. Repita o procedimento para todas as amostras.
Nota: A baixa viscosidade de iodometano pode causar a perda de amostra, porque a solução de analito pode escorrer a partir da ponta da pipeta durante a transferência. Segurar o tubo de amostra e a coluna de spin adjacentes uns aos outros com uma mão, e rapidamente transferir a solução de amostra, com a outra mão. - Permitir que a reacção permetilação prosseguir durante 11 min. Agita-se cada uma das amostras, pelo menos, 4-5 vezes durante este período. Para facilitar a permetilação eficiente, que ocorre na superfície dos grânulos de NaOH, utilizar pontas de carregamento de gel de ponta de pipeta-frisado como agitadores para misturar suavemente o conteúdo da coluna. mistura agressivo pode perfurar o filtro de rotação, pulverizar e suspender grânulos de NaOH (que podem reduzir a eficácia da subsequente extracção líquido / líquido), e / ou causar perda de amostra (como o SAmple-embebido grânulos de NaOH pode transbordar a partir da coluna).
- Na preparação para a etapa de extracção líquido / líquido subsequente, preparar uma quantidade suficiente de M de cloreto de sódio (NaCl) solução de 0,5 num tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,0), para ser armazenada à temperatura ambiente. Cada amostra requererá um total de ~ 12 ml de solução de NaCl para todos os três ciclos de extracção líquido / líquido.
- Após a conclusão do período de permetilação 11 min, imediatamente ainda retire cuidadosamente as colunas e centrifugar-los por 15 segundos a 2.400 × g. Descarte as fichas.
- Transferir quantitativamente cada solução de amostra para seu correspondente NaOH-bead-cheia co microcentrífuga de spinlumn. Utilizar uma ponta de pipeta de 1.000 ul para este passo. Após transferência, friso aproximadamente 2 mm da extremidade de uma ponta de 200 ul e deixá-lo em o conteúdo da coluna para usar como um agitador. Repita o procedimento para todas as amostras.
- Remover imediatamente colunas de rotação da centrífuga e colocá-los em um novo conjunto de tubos de centrifugação reservatórios vazios, deixando a solução de fluxo contendo glicanos recém-permetilado trás. Não descartar nada.
- Logo que possível, adicione 300 mL de acetonitrilo (ACN) para os filtros, rotação NaOH-cheias secas. Centrifugar os filtros de spin durante 30 segundos a 9600 × g.
- immediatelY depois, transferir a solução permetilação principal (ou seja, a solução que foi incubada com as pérolas de NaOH para 11 min, em seguida, girado por meio do filtro de rotação para um tubo de centrífuga antes da adição de 300 ul de ACN na etapa anterior) para silanizada 13 x 100 mm tubos de ensaio de vidro de 42 contendo 3,5 ml de tampão 0,2 M de fosfato de sódio contendo 0,5 M de NaCl, pH 7,0 e misturar (vórtice) imediatamente. Evitar transferir qualquer resíduo sólido branco durante este passo. Faça isso para cada amostra antes de prosseguir para a próxima etapa.
- Sem demora, a transferência (combinar) do ACN-rotação através de cada tubo reservatório de (com) o resto da amostra de líquido no seu respectivo tubo de vidro silanizada e misturar (vórtice) imediatamente. Mais uma vez, evitar a transferência de qualquer resíduo sólido branco durante este passo. Cap, shake, e vortex o tubo de vidro. Repita o procedimento para cada amostra. Descartar as colunas NaOH e pipetas Pasteur em lixeiras apropriadas.
- Líquido / líquido extraction e Glycan Purificação
- No interior do exaustor de fumos, adicionar 1,2 ml de clorofórmio para cada amostra. Imediatamente depois disso, a tampa os tubos de vidro silanizadas e misturar vigorosamente o conteúdo.
- Pré-aquecer blocos de metal a cerca de 75 ° C num colector de evaporação. Use blocos de aquecimento com poços que podem acomodar os 13 mm × 100 mm tubos de vidro.
- Obter um novo conjunto de pipetas silanizadas Pasteur, pipetas Pasteur não-silanizadas, e tubos de ensaio de vidro silanizadas com tampas.
Cuidado: clorofórmio (CHCl3) é um irritante, mutagênico e carcinogênico potencial capaz de permear através de alguns tipos de luvas. - Centrifugar brevemente (~ 3000 x g) tubos de vidro contendo a amostra para separar as camadas aquosa e orgânica.
- Usar uma pipeta de Pasteur silanizada não o suficiente para extrair a camada aquosa de topo de tal modo que ~ 3 mm a camada aquosa permanece acima da camada orgânica inferior.
- Adicionar 3,5 ml de Na a 0,5 MCl solução num tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 7) a cada tubo de vidro, misturar vigorosamente, e centrifuga-se brevemente (~ 3000 x g). Tal como na etapa anterior (1.4.3), utilizar uma pipeta de Pasteur silanizada não-extrair a camada aquosa.
- Repetir o passo anterior (1.4.4), mas deixe ~ 1 ml da camada aquosa.
- Usar uma pipeta de Pasteur silanizada limpa para transferir a camada orgânica para um tubo de ensaio de vidro silanizada mm limpa e adequadamente rotulada 13 × 100. Evitar contaminação aquosa extraindo-se da seguinte forma:
- Segurar ambos os tubos de ensaio de vidro silanizada e actuais novos adjacentes uns aos outros numa das mãos. Com a outra mão, pressione o bolbo de pipeta para criar bolhas durante a inserção da pipeta para baixo através da camada aquosa.
- Uma vez dentro da camada orgânica, parar de criar bolhas, e mantenha a lâmpada pipeta estável para permitir que as camadas orgânica e aquosa e para estabilizar a separar-se novamente. Em seguida, libertam lentamente a lâmpada para retirar o máximo de organicamada c possível, sem qualquer contaminação aquosa.
- Subir rapidamente a ponta da pipeta através da camada aquosa, e resistir ao reflexo natural de libertar ligeiramente a lâmpada (o que resulta na retirada alguma contaminação aquoso) ao aumentar a pipeta para fora do tubo.
- Rapidamente transferir a camada orgânica de baixa viscosidade para o novo tubo adjacente. Qualquer contaminação aquosa serão visíveis como pequenas gotículas de líquido na parte superior da camada orgânica extraiu-se nos novos tubos de vidro. Se a contaminação aquosa / NaCl é visível, removê-lo com uma pipeta; centrifugar se necessário para reunir as gotículas aquosas em uma única gota.
- Devidamente dispor de tubos antigos de vidro, pipetas, e aquosa e soluções de resíduos orgânicos. Lave e reciclar tampas de tubos de vidro.
- Seca-se todas as amostras sob uma corrente suave de azoto e constante num colector de evaporação pré-aquecido a 75 ° C durante ~ 5 min dentro de um extractor de fumo. Para garantir o resfriamento evaporativo durante todo ste seca-downps, um fluxo suave e constante de azoto deve perturbar a superfície do líquido, sem respingos ou salpicos do líquido. Retirar amostras a partir do colector de evaporação após a secagem completa da amostra final. manchas brancas na parte inferior do tubo de vidro secas indicam tampão contaminação / NaCl.
- Pause o procedimento aqui se não há tempo suficiente remanescente no dia para completar a etapa de hidrólise de TFA. Temporariamente (isto é, durante a noite) armazenar amostras secas a -20 ° C. Para continuar o procedimento após o armazenamento, retire as amostras do freezer -20 ° C e permitir-lhes para aquecer completamente antes uncapping.
- Embora as amostras quente, em preparação para a hidrólise ácido trifluoroacético (TFA) (fase seguinte), definir a manta de aquecimento de tal modo que a temperatura dos conteúdos de proveta líquido irá atingir 121 ° C. Prepare a solução de TFA a partir de ações TFA (ver Passo 2.1 abaixo).
2. Ácido trifluoroacético (TFA) Hidrólise
3. Redução 4. A acetilação (realizada em um Fume Hood) 5. Cromatografia Gasosa - Espectrometria de Massa (GC-MS) Análise 6. Os dados
Cuidado: borohidreto de sódio (NaBH4) é uma toxina higroscópico, reativa-água e potente irritante que liberta-upon contato com vapores inflamáveis altamente água que causam graves queimaduras por contacto inalação, ingestão ou olhos / pele.
Cuidado: hidróxido de amônio (NH 4 OH) é um irritante corrosivo e toxina capaz de causar queimaduras graves e danos irreversíveis de órgãos após contacto inalação, ingestão ou olhos / pele. Lave as áreas afetadas com água durante 30 min, e impedir a vítima de esfregar ou coçar as áreas afetadas.
Nota: Para distinguir as bolhas de ar a partir de gotas de líquido, inclinar o tubo de ensaio. Somente gotículas de líquido vai passar depois de inclinar, mas o inverso não é sempre verdadeiro: se uma bolha não se move, ele ainda pode ser um (muito pequeno) gota de líquido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um cromatograma iónico total de corrente (TIC) que mostra permetilação bem sucedida, hidrólise, redução, e acetilação das amostras de plasma de sangue humano relativamente aos casos em que dois passos críticos permetilação foram incorrectamente executadas são mostrados na Figura 3.
Rendimento absoluto do HexNAc Relativo ao Hexoses:
N -acetylhexosamine (HexNAc) acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs) tendem a ter um rendimento inferior a hexoses. 43 Para estimar o rendimento absoluto de HexNAc relação ao hexoses, seis amostras de 10 ug de acetilactosamina N (um dissacarídeo Gal1-4GlcNAc) em foram analisados 10 ul de água. as áreas dos picos de TIC de galactose terminal (T-Gl) e 4-GlcNAc foram integrados. A percentagem de 4-GlcNAc em relação à quantidade total de t-Gal e 4-GlcNAc era 11,3 ± 0,7%(MEV). Embora os rendimentos são reprodutíveis HexNAc (ver abaixo), o facto de que este valor é muito menos do que o valor teórico de 0,5 indica que o rendimento do HexNAc é fundamentalmente mais baixa do que a de hexoses. (O rendimento teórico é 0,5 HexNAc porque N acetilactosamina é um 1:. 1-hexose HexNAc dissacárido)
Intra e inter-Reprodutibilidade:
Reprodutibilidade intra e inter-ensaios para todos os nós de glicano que contribuem, pelo menos, 1% do total de hexose ou sinal HexNAc são fornecidos na Tabela 1. Estes dados foram adquiridos por analistas separadas 3 em 3 dias separados, utilizando o mesmo conjunto de plasma com EDTA. Autosampler dados de estabilidade no âmbito deste protocolo optimizado para os nodos 18 glicano mais abundante no plasma humano (isto é, aqueles com> 1% do total de hexose ou sinal HexNAc) são fornecidas na Figura 4.
Outras observações notáveis:
Além de otimizar a metodologia permetilação, descobrimos que não é necessário para evitar a adsorção de água pelas contas de NaOH antes da primeira lavagem com acetonitrilo. Nós também descobrimos que a presença de uma pequena quantidade de água durante o passo de acetilação final em combinação com um breve período de aquecimento com anidrido acético sem TFA ajuda a facilitar a reacção estava completa. Finalmente, a fonte de alta resolução de tempo-de-voo (TOF) espectrometria de massa, não é necessária para a análise do nó glicano bem sucedida: Os resultados iniciais com base em injecção paralela do mesmo conjunto de amostras num GC-TOF-MS e um quadrupolo transmissão tradicional com base na GC-MS operado em monitoramento de íons selecionados de modo (SIM) apresentam resultados semelhantes em termos de hexose normalizada final, e abundância relativa HexNAc.
er.within-page = "1"> 
. Figura 1. Visão Molecular do procedimento de análise de metilação glicano mundial An O -ligada glicano é ilustrado; estes forem lançados durante o processo permetilação, que foi adaptado a partir Goetz. 40 Seguindo permetilação e hidrólise, monossacarídeos são reduzidos e grupos hidroxila nascentes "marcado" por acetilação. O padrão único de metilação e acetilação nas finais alditol acetatos parcialmente metilados (PMAAs) corresponde ao original "nó de glicano" no polímero intacta original e proporciona a base molecular para a separação e quantificação por GC-MS. N -linked e glicanos de glicolípidos são liberados como monossacarídeos marcado de ligação durante a hidrólise ácida. Adaptado de Borges et al. 33 com permissão.> Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. visão geral conceptual do conceito analítico. Um glicosiltransferase regulada positivamente (por exemplo, a GnT-V) provoca um aumento na quantidade de um resíduo de glicano específica, associada inequivocamente monossacárido (Manose um "nó" 2,6-ligada neste exemplo) -que, através da acção subsequente de outras glicosiltransferases, pode levar à formação de uma mistura de estruturas heterogéneas todo-glicano no baixo número de cópias de cada, todos dos quais podem ser difíceis de detectar e quantificar de forma rotineira. Analiticamente congregam os "nós glicano" de entre todas as estruturas de glicano aberrantes fornece uma medida substituta mais direta da atividade GnT-V do que qualquer glicano intactas. Medição simultânea de N -, O -, e lipídios ligado "Glyc um nós "no biospecimens integrais tal como descrito aqui (e inicialmente em outros lugares 33) representa um conceptualmente novos meios para detectar e monitorar as doenças glicano-afectivas, tais como o cancro. reais cromatogramas iónicos extraídos a partir de amostras de plasma sanguíneo de 10 microlitros mostrados. números adjacentes aos resíduos de monossacárido em estruturas de glicano indicam a posição na qual o resíduo superior está ligada ao resíduo inferior. Se não há posições de ligação estão indicados na anotação cromatograma o resíduo é quer na posição terminal ou livre em solução (por exemplo, glicose). Todos os resíduos . exceto ligação de ácido siálico para baixo através da sua posição 1; ligações de ácido siálico para baixo através da sua posição 2 Dividir no cromatograma indica mudança na cromatogramas de iões extraídos: m / z 117 129 para os resíduos de hexoses e m / z 116 + 158 para N - acetylhexosamine (HexNAc) resíduos. Adaptado de Borges et al. 33 com permissão.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os resultados representativos. Cromatogramas de corrente iónica total (TICs) para a análise do nó de glicano da mesma amostra de sangue com EDTA plasma humano, em que A) a amostra foi processada correctamente, B) o resíduo branco na solução permetilação que foi fiada através do NaOH coluna foi levada para a mistura subsequente de extracção líquido / líquido, e C) a solução permetilação que foi fiada através da coluna de NaOH foi adicionado ao tampão de fosfato, mas não muito bem misturados antes da adição de clorofórmio para a extracção líquido / líquido. Legend fornecido na Figura 2. Por favor, clique here para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Estabilidade Estabilidade Autosampler. Autosampler ao longo de 48 horas para os gânglios 18 glicano mais abundante no plasma humano. Em 22 horas, a amostra foi completamente seca e reconstituída em 120 ul de acetona. Cada grupo de pontos de dados representam quatro injecções consecutivas de uma mesma amostra. Linhas pretas abranger ± 15% do valor normalizado média para cada nó de glicanos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. reprodutibilidade intra e inter. Os valores representam% CV de hexose, total ou HexN total deAc-glicano normalizados nodos individuais. Todos os nós de glicano que contribuem, pelo menos, 1% do total de hexose ou sinal HexNAc são listados. Os dados foram adquiridos por analistas separadas 3 em 3 dias separados, utilizando o mesmo conjunto de plasma com EDTA. N = 6 amostras por lote. Por favor clique aqui para baixar esta tabela como uma planilha Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Em geral, a produção bem sucedida de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexoses é cheio com menos dificuldades e é mais robusta do que a produção bem sucedida de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. O mecanismo exato por trás desse fenômeno, uma vez que se desenrola em cada passo deste processo é desconhecida, mas devem estar relacionados com a química única do grupo acetil N (em vez de grupo hidroxila) que é exclusivo para HexNAc relação ao hexoses. O mecanismo subjacente a este fenómeno no que se refere à hidrólise ácida é explicado em outra parte. 43 Em resumo, a capacidade para a N-metilacetamido a tornar-se carregada positivamente durante a hidrólise de ácido faz com que a ligação glicosídica resistente à hidrólise ácida. Isto explica o baixo rendimento de HexNAc relação ao hexose (11,3% do sinal total HexNAc + hexose, em vez de 50% do total) tal como descrito anteriormente para a análise de N acetilactosamina. Notavelmente, este relativamente lrendimento ower de HexNAc não torná-los difíceis de detectar em fluidos biológicos e tecidos complexos, ou impede a detecção fácil de nós glicanos derivados de grandes, glicanos complexos (por exemplo, 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -Man, e 3,4-GlcNAc, Figura 2). 33 Dada a maneira pela qual as áreas dos picos de XIC nodos glicano são normalizados (Passo 6.3), desde que o rendimento relativo de cada HexNAc indivíduo permanece consistente em relação a outros HexNAc ( o que faz, ver Tabela 1), a informação útil sobre as quantidades relativas dos diferentes HexNAc entre diferentes amostras pode ser obtido. Isso vale para hexoses também. Além disso, temos mostrado previamente que os rácios de hexoses para HexNAc exibir comportamento quantitativa consistente bem 33 - um fenômeno que é continuamente monitorada através de incorporação de amostra (s) QC em cada lote.
A maneira pela qual é executada a permetilação tem o maior impacto naso rendimento global e reprodutibilidade da HexNAc PMAAs. Em particular, um grande cuidado deve ser tomado para evitar completamente a exposição dos glicanos permetilado para alcalino condições aquosas. Dois passos importantes neste sentido são: 1) deixando todo precipitado branco nas soluções através de spin-atrás (Passos 1.3.13 e 1.3.14), e 2) imediatamente misturar as soluções de spin-through, uma vez que são adicionados ao tampão fosfato ( passos 1.3.13 e 1.3.14). Um tampão em vez de solução de sal simples é incluído nesta etapa e para as etapas de líquido / líquido de extracção subsequentes para evitar a alcalinização inadvertida da solução aquosa. Nós suspeitamos que, sob condições alcalinas, o grupo acetilo do grupo 2-amino metilado e acetilada de HexNAc podem ser submetidos a hidrólise, o que resulta em uma amina secundária mais polar que diminui a eficiência global de extracção do glicano associada com clorofórmio.
A característica mais facilmente reconhecível da HexNAc sem sucesso permetilado éa intensidade da GlcNAc-4 ligada (4-GlcNAc) cromatográfica de pico relativa às de 6-Gal, 3,6-Homem, e a intensidade da linha de base do fundo durante a última coluna coza-a (Figura 3). Quando a abundância absoluta do 4-GlcNAc PMAA é baixa, a sua abundância normalizada em relação a todos os outros HexNAc também tende a ser baixo, com um aumento concomitante (mais visivelmente) de 3,4-GlcNAc.
Algumas mudanças projetadas para otimizar o rendimento e ensaio de robustez geral foram feitas desde a publicação inicial que descreve esta abordagem analítica 33 Uma dessas mudanças é a maneira pela qual os cromatogramas de iões extraídos integrados (XICS) são normalizados:. Por uma questão de simplicidade, agora dividir a área de cada indivíduo XIC hexose pela soma de todas as áreas de hexose XIC; Da mesma forma, a área de cada indivíduo HexNAc XIC é dividido pela soma de todas as áreas HexNAc XIC. Como pode ser visto na Tabela 1, inter geral / inter-analista reproducibildade para todos os nós de glicano que contribuem para> 1% das respectivas médias de hexose ou HexNAc de sinal 13% CV.
Para nosso conhecimento, esta é a única encarnação de glycomics verdadeiramente bottom-up em que glicanos são primeiro quebrados para baixo e, em seguida, seus componentes analisados para construir um retrato quantitativo toda a amostra da composição de glicanos. Aqui, em vez de liberação enzimática tradicional, o processo permetilação elimina não-redutora (lançamentos) O glicanos -Conectado de suas respectivas proteínas, 40, enquanto N -ligada glicanos são liberados durante a hidrólise ácida. 33 Como uma abordagem complementar ao glycomics top-down tradicionais , esta abordagem é capaz de reunir características de glicano únicas de interesse, como "fucosila�o core", "6-sialilação", "bisecting GlcNAc" e "beta 1-6 ramificação" em sinais analíticos individuais (ver, 4,6-GlcNAc , 6-Gal, 3,4,6-Man e 2,6-Man nós na Figura 2, respectively). Em abordagens de cima para baixo tradicionais, recursos como estes que em última análise, dependem das atividades exclusivas de uma ou duas glicosiltransferases chave 33 são normalmente distribuídos em dezenas de glicanos intactas e às vezes pode ser difícil ou impossível de resolver (por exemplo, 3-sialilação vs. 6-sialilação) devido à degenerescência de algumas massas de glicano intactas. Além disso, a abordagem bottom-up aqui apresentado tem demonstrado promessa inicial na detecção não invasiva câncer de pulmão. 33 Mais estudos estão em andamento para validar esses resultados iniciais, bem como resultados não publicados adicionais, mas que pertencem à detecção de outras formas de câncer.
A maior limitação da abordagem aqui descrita é que ela é limitada em termos de seus limites de detecção, se fosse para ser aplicado glicoproteínas de pré-isolados. Com base em análises inéditas de padrões de glicano individuais sem proteína transportadora, limites de quantificação for glicanos individuais parecem estar na faixa de baixa microgramas. Estes são, de forma alguma baixos limites de quantificação, em termos absolutos, mas este fato não importa no que diz respeito ao âmbito de aplicação inicialmente previsto do ensaio de que não foi projetado para e não tem necessidade de atingir baixos limites de quantificação (pelo menos para os fins descritos aqui e em nossa publicação anterior 33). Na verdade, o plasma humano / soro contém glicoproteínas das 10s de concentração mg / ml de gama-o que significa que para a análise de sangue de plasma / soro que injecta apenas ~ 1/100 do volume da amostra final e dividir 40 de 41 partes de que a quantidade pequena para o lixo no porto GC injector. Sem esta prática, alguns de nós de glicano pode saturar o detector. quantidades picomole de glicoproteínas que podem produzir sinais de glicano intactas adequados por métodos convencionais de cima para baixo MALDI-MS ou LC-MS abordagens baseadas não pode ser detectado com esta abordagem. Refinamento da metodologia está em andamento para resolver esta limitação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
| 0.9 ml Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
| GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps |
| 1.5 ml polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| 2 ml polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
| Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
| Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
| Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
| 13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
| Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
| Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
| Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
| Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
| Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
| Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0-30.0% |
| Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
| Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
| Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
| Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
| Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
| Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
| Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
| Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
| Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep) |
| Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
| Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
| Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
| DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
| Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
| *Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. | |||
References
- Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
- Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans (2009).
- Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
- Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
- Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
- Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
- An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
- Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
- Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
- Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
- Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
- Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
- Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
- Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
- Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
- Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
- Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
- Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
- Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
- Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
- Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
- Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
- Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
- Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
- Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
- Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
- Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
- Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
- Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
- Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
- Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
- Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
- Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
- Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
- Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
- Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
- Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
- Seed, B.
- Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).
