Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Published: May 22, 2016 doi: 10.3791/53961
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Introduction

Glycolipiden, glycoproteïnen, proteoglycanen en glycosaminoglycanen vormen de vier hoofdklassen van complexe heterogene koolhydraten gezamenlijk bekend als glycanen. Zo alomtegenwoordig en een integraal onderdeel van het plasmamembraan, glycocalyx, en extracellulaire matrix en vloeistoffen, glycanen deel te nemen aan zulke uiteenlopende biochemische processen als endocytose, intracellulaire mensenhandel, celmotiliteit, signaaltransductie, moleculaire herkenning, receptor activering, celadhesie, gastheer-pathogeen interactie , intercellulaire communicatie immunosurveillance en immuunrespons initiëren. 1 aanwezig in bijna elk gebied van het leven, enzymen bekend als glycosyltransferasen die glycan polymeren bouwen handelen combinatie met glycoside hydrolasen (ook bekend als glycosidases, wat neerkomt glycanen breken) te bouwen, verbouwen, en uiteindelijk produceren afgerond glycan polymeren 2. Hoewel elk glycosyltransferase kan werken op verschillende glycoconjugaten, een glycosyltransferaseAldus wordt een algemeen linkage- en anomeer specifieke glycosidische binding in door de monosaccharide-eenheid met een bepaalde geactiveerde nucleotidesuiker donor (bijvoorbeeld GDP-fucose) een bepaalde categorie nucleofiele acceptoren (bijvoorbeeld een lipide, polypeptide, nucleïnezuur, of groeien oligosaccharide). Er wordt geschat dat meer dan 50% van de eiwitten (in het bijzonder membraan en secretorische eiwitten) zijn post-translationeel gemodificeerd door glycosylering 3 Rudimentary combinatorische berekeningen geven een waardering voor de grote variabiliteit, veelzijdigheid en specificiteit die aan glycoproteïnen door glycosylering.; bijvoorbeeld als een polypeptide substraat in 10 glycosylatieplaatsen en elke plaats kan een glycosidische binding met 1 van slechts 3 verschillende monosacharide-reducerende uiteinden te vormen, dan het theoretisch uiteindelijke glycoproteïne kan aannemen 3 10 = 59.049 verschillende identiteiten. In glycoproteïnen glucosidebindingen algemeen vormen de zijketen stikstof of asparagine residuen in de sequentie Asn-X-Ser / Thr ter verkrijging van N-glycanen 2 en zijketen hydroxylgroepen van serine en threonine residuen verkregen O-glycanen 4 (X kan elk aminozuur behalve proline is). De samenstelling van glycome een cel (dat wil zeggen, het complement van glycosylering producten) is uniek en beperkt, omdat, op enkele uitzonderingen na, glycosyltransferases vertonen strenge donor, acceptor, en koppeling specificiteit. 5 Belangrijke en overvloedige bloed plasma glycoproteïnen lijden afwijkende glycosylering als downstream gevolg glycosyltransferase van abnormale expressie en activiteit als gevolg van vele pathologische aandoeningen, met name kanker en infectieziekten. 6-24

Voornamelijk als gevolg van epigenetische factoren, de glycome aanzienlijk meer divers, dynamisch en complex dan het proteoom en transcriptoom. 25,26 Terwijl ongeveer 1% van het zoogdiergenoom codeert de vorming, modificatie enassemblage van glycanen, 27 glycosylering verloopt in een niet-matrijs-gestuurde wijze-een schril contrast met polypeptide en nucleïnezuur biosynthese. De interactie tussen de relatieve hoeveelheid en activiteit van glycosylering enzymen en dergelijke omgevingsfactoren als voedingsstof en voorloper beschikbaarheid bepaalt uiteindelijk de aard, de snelheid en de omvang van glycosylering. 5,28 embryogenese (bv, vastberadenheid en differentiatie), cellulaire activatie, en progressie door middel van de celcyclus invloed genexpressie (dwz transcriptie en vertaling) en wijzigen van de identiteit en de hoeveelheid beschikbare glycosyltransferases, waarvan de activiteit is de onmiddellijke stroomopwaarts determinant van de cel glycaan-profiel. Omdat (een deel van) de proliferatieve, lijm, en invasieve eigenschappen van kankercellen lijken op die van gewone embryogene cellen, specifieke veranderingen in glycan biosynthetische routes (bijv voorloper accumulatie, gedereguleerde expressie, aberrant modificatie structurele afknotting of nieuwe vorming) dienen als universele kanker biomarkers die verschillende stadia van tumorvorming, progressie, migratie en invasie 29 geven Hoewel glycosylering is zeer complex, blijkbaar op enkele verbeteringen in glycosylering kunnen carcinogenese en metastase mogelijk.; blijkbaar, bepaalde "afwijkende" glycosyleringsproducten inderdaad kankercellen profiteren door hen in staat om het immuunsysteem erkenning ontwijken en overleven de eisen van de migratie in onherbergzame intravasculaire en metastatische omgevingen. 28,30,31 Niet verrassend, hebben experimenten aangetoond dat de patronen van veranderde verstoren of voorkomen genexpressie en afwijkende glycan vorming kan het ontstaan ​​van tumoren Toch halt toe te roepen. 29, de afwijkende glycanen gedetecteerd in een Biofluid monster (bijvoorbeeld, urine, speeksel en bloed plasma of serum) misschien niet direct indicatoren van kanker (of een andere ziekte), maar stroomafwaarts uitkomsten van subtiele, maar belangrijkeveranderingen in het immuunsysteem of meetbare vertakkingen van een kwaadaardige aandoening bij een onvoorspelbare orgaan. 32

Hoewel ze bieden universele informatie over de glycome, vele moleculaire interactie gebaseerde glycomics technieken (bijvoorbeeld lectine / antilichaam-arrays en metabole / covalente etikettering) afhankelijk van de detectie van de hele glycan structuren en geen gedetailleerde structurele informatie over de verschillende glycanen niet te verstrekken. In contrast, kunnen massaspectrometrie (MS) te identificeren en kwantificeren van individuele glycan structuren en dergelijke structurele informatie de bevestigingsplaatsen om kernen polypeptide te onthullen. Gedereguleerde expressie of activiteit van één glycosyltransferase kan een cascade van schadelijke moleculaire gebeurtenissen in meerdere glycosyleringsroutes initiëren. Omdat elke glycosyltransferase kan werken op meer dan één glycoconjugaat substraat en in verschillende groeiende glycan polymeren, gedereguleerde biosynthese cascades opleveren disproportioneel verhoogde hoeveelheden van één glycan product maar verschillende heterogene klassen van afwijkende glycanen in intra- of extracellulaire vloeistoffen. 33 Dergelijke unieke afwijkende glycanen worden soms onpraktisch als biomarkers voor kanker of andere glycan-affectieve aandoeningen, omdat, vergeleken met de grote pool van goed gereguleerde glycanen, deze afwijkende glycanen slechts een zeer klein deel dat kan vaak niet detecteerbaar blijven zelfs dergelijke zeer gevoelige technieken zoals massaspectrometrie. Bijvoorbeeld in intra- en extracellulaire lichaamsvloeistoffen, het brede eiwitconcentratie spectrum (waarvan acht ordes van grootte overspant) kan detectie van schaarse glycoproteïnen die worden gemaskeerd door de meer voorkomende soort voorkomen. 32 Bovendien bepalen glycosyltransferase activiteit blijft een aanzienlijke praktische en theoretische uitdaging, omdat veel glycosyltransferases afwezig zijn in klinische biovloeistoffen of inactief ex vivo worden. Ondanks de moeilijkheid consistenTLY opsporen en kwantificeren van ultra-kleine hoeveelheden uniek geheel glycanen, hebben beoefenaars van massaspectrometrie enorme vooruitgang geboekt in de richting van het gebruik van intact glycanen klinische markers. Recent hebben wij als aanvulling op de analyse van intacte glycanen dat gebruik GC-MS, vergemakkelijkt de detectie van alle samenstellende branch-point en koppeling-specifieke monosacchariden ( "glycan nodes ') die samen uniciteit verlenen aan elke glycan en in vele gevallen rechtstreeks dienen als moleculaire surrogaten dat de relatieve activiteit van de verwijtbare glycosyltransferase (s) te kwantificeren.

Sinds zijn eerste directe toepassing op glycaan analyse in 1958 gemeld, is gaschromatografie (GC) bewezen een krachtige techniek om per-gemethyleerd mono- en disachariden te analyseren, 34 bepalen hun anomericity en absolute configuratie, en ze te scheiden voor daaropvolgende massaspectrometrische analyse. 35 tussen 1984 en 2007, Ciucanu en collega'singevoerd en geraffineerd een vaste fase glycan permethylation techniek die natriumhydroxide en joodmethaan toegepast, gevolgd door vloeistof / vloeistofextractie of gepermethyleerd glycanen met water en chloroform. 35,36 Tussen 2005 en 2008, Kang en medewerkers geïntegreerd een tijdbesparende rotatie -column aanpak in de permethylation stap. 37,38 In 2008, het Goetz onderzoeksgroep bedacht een kwantitatieve vaste fase permethylation glycaan-profilering methode met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie-ionisatie (MALDI) massaspectrometrie om te vergelijken en mogelijk onderscheid invasieve en niet -invasive borstkankercellen; 39 toen, in 2009, de Goetz team gecombineerde enzymatische en technieken chemische stof in klieven O-glycanen uit intacte glycoproteïnen in een sterk basische vaste fase permethylation regeling 40 Hoewel de Goetz procedure vergemakkelijkt gelijktijdige permethylation en chemische release. van O-glycanen, was het alleen van toepassing op pre-geïsoleerde glycoeiwitten. We pasten deze techniek in 2013 en aangepast voor de hele niet-gefractioneerde biovloeistoffen en monsters gehomogeniseerd weefsel door het opnemen van trifluorazijnzuur (TFA) hydrolyse, reductie en acetylering stappen. 33 Deze extra stappen ook glycanen van glycolipiden en N los gebonden glycanen van glycoproteïnen en om te zetten ze in gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs, figuur 1), waarvan de karakteristieke methylatie-en-acetylering patronen analyse door GC-MS en uniek vergemakkelijken kenmerken de samenstellende glycan knooppunten in de oorspronkelijke intacte glycan polymeer 41 (figuur 2). 33 Uiteindelijk is dit procedure levert een samenstelling portret van de glycanen in een complex Biofluid door directe relatieve kwantificatie van glycan unieke eigenschappen zoals "kern fucosylatie", "6-sialylering", "splitsend GlcNAc" en "beta 1-6 vertakking" - elk afgeleid van een GC-MS chromatographic piek. Dit artikel geeft verdere optimalisatie van het permethylation, acetylering, isolatie, en clean-up fase, samen met verbeteringen in de wijze van relatieve kwantificatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Let op: Vermijd huid en / of oogcontact met een van de reagentia gebruikt in dit experiment. Bij blootstelling, grondig spoelen het getroffen gebied met water en onmiddellijk een arts raadplegen.

1. Permethylation en Glycan Extraction

  1. Column Voorbereiding
    1. Verkrijgen zoveel microfuge spinkolom eenheid waarin het te analyseren monsters. Breek en maak de plastic reservoir buis caps. Plaats een microfuge mini filter in elk reservoir buis. Plaats de gemonteerde microfuge spinkolommen (met de mini filters) in een microfugebuis rek.
    2. Het verkrijgen van een voorraad van natriumhydroxide (NaOH) kralen (20-40 mesh). Transfer sommige NaOH om een ​​kleine wegen boot of, indien de vochtigheid wordt veroorzaakt klonteren, een hot porseleinen mortier als de werkvoorraad van NaOH. Vermijd het gebruik van massa's van NaOH of geplet / poedervorm NaOH kralen.
      Let op: NaOH is een krachtige toxine en corrosieve basis. Spoel de blootgestelde huid / ogen met water gedurende 15 min. ThorougHLY het reinigen van de werkbank na het voltooien van het experiment.
    3. Met behulp van een klein bolletje of een spatel, transfer NaOH kralen uit de werkvoorraad aan de microfuge mini filters met NaOH te vullen tot aan de eerste buitenste afschuining (~ 5 mm onder de rand). Tik op de gevulde microfuge filters op de bank-top in te pakken / condenseren de NaOH kralen.
      Opmerking: In dit experiment, waardoor hinderlijke adsorptie minimaliseren hygroscopische NaOH korrels, het niveau van de toegevoegde vloeistoffen (bijvoorbeeld, acetonitril, dimethylsulfoxide, analytoplossing) boven het oppervlak van de NaOH Celite behouden en direct contact met de lucht te beperken.
    4. Het verkrijgen van een voorraad van acetonitril (ACN). Transfer ~ 350 pi ACN aan elke NaOH-verpakt microfuge mini filter. Houd de NaOH ondergedompeld onder ACN en verwijder grote luchtbellen door roeren met een tip-gekrompen gel-loading pipet tip.
      Let op: Acetonitril is een brandbaar irriterend.
    5. Column Centrifugeren
      1. Schik de microfuge kolommen symmetrisch in een centrifuge; Gebruik een balansbuis indien nodig. Mors geen NaOH korrels in de centrifuge. Sluit het deksel centrifuge.
      2. Centrifugeer de kolommen (dat NaOH en ACN) voor ~ 15 sec bij 2400 x g.
      3. Na voltooiing van het centrifugeren, verwijder microfuge kolommen uit de centrifuge, en gooi de ACN in een gevaarlijk afvalcontainer. Houd de kolom NaOH verpakking intact.
    6. Voeg ~ 350 gl dimethylsulfoxide (DMSO) aan elke NaOH verpakte microcentrifuge mini filter. Houd de NaOH ondergedompeld onder DMSO en verwijder eventuele grote luchtbellen met een pipet tip. Zoals eerder beschreven, centrifuge kolommen voor ~ 15 sec bij 2400 x g en verwijder het DMSO terwijl de NaOH verpakking intact.
      Let op: DMSO is mutageen en irriterende en wordt gemakkelijk geabsorbeerd door de huid.
    7. Sluit alle microfuge mini filters met de stekkers in de spin-filterkit. Transfer ~ 350 ul DMSO aan elk NaOH-verpakt microfuge mini filter en gebruik maken van een 200 ul pipet tip om luchtbellen te verwijderen in de NaOH verpakking, zodat DMSO alle regio's binnen dan NaOH verpakking bereikt. Vermijd breken of overmatig schrapen van de NaOH kralen; NaOH poeder ongewenst. Beëindig deze stap zo snel mogelijk.
  2. Voorbereiding van de Plasma Quality Control (QC) Monster (s)
    Let op:     Om ervoor te zorgen consistente resultaten over experimentele batches, overwegen gebruik te maken van ten minste één portie van een monster genomen van een grote, homogene massa collectie van het biologisch materiaal van belang te analyseren in elke partij. Als bijvoorbeeld de analyse van bloedplasma, gebruikt monster (s) van een bulkverzameling bloedplasma als QC monster (s) per cyclus. Werkwijze QC monsters op dezelfde wijze als onbekende monsters.
    1. Centrifuge een stock sample van QC plasma voor 4 min bij ~ 10.000 x g. Tijdens het centrifugeren, kunnen sommige high-density neerslag bezinken aan The onderkant en een aantal lage dichtheid neerslag kunnen drijven naar de top van het plasma. Vermijd zowel bij het verwijderen van monster (s) van plasma.
    2. Ga verder met "1.3) Monstervoorbereidingstesten" hieronder. Vervolgens terug naar deze stap na centrifugeren plasma voltooid.
    3. Trekken 9 pl plasma QC gecentrifugeerd en overgebracht naar een geschikt gemerkte 1,5-ml polypropyleen proefbuis met een snap-cap shut (hierna "1,5-ml plastic reageerbuis"). Voeg 1 pl gedeïoniseerd water aan elk monster; desgewenst gebruiken als drager voor interne standaard (s).
    4. Voeg 270 ul DMSO om dit plasma controle. Vortex om volledige oplossing te verzekeren.
  3. monstervoorbereiding
    1. Verkrijgen veel 1,5-ml plastic testbuisjes het aantal biologische (analyt) monsters.
    2. Overdracht 9 pi van elke biologische (analyt) monster de bijbehorende 1,5 ml plastic reageerbuis. Breng 1 pl gedeioniseerd water en 270 ul DMSO aan elk monster buis.
    3. Krachtig mengen (bijvoorbeeld vortex en / of herhaaldelijk pipet op en neer) van de monsters naar volledige oplossing te garanderen in DMSO.
      Let op: Voer de volgende stappen in een zuurkast. Gebruikt in de volgende stappen, joodmethaan (CH 3 I), dichloormethaan (CH 2Cl 2, aka methyleenchloride) en chloroform (CHCl3, trichloormethaan), zijn vluchtige vloeistoffen kan oplossen bepaalde kunststof (bijvoorbeeld nitril) . Zorg ervoor dat u handschoenen bestand tegen oplosmiddelen gebruiken. Vanwege hun lage viscositeit en hoge dampdruk kunnen deze reagentia druppelen van een pipetpunt tijdens overdracht. Minimaliseren reagens verlies en de mogelijke blootstelling door het houden van de voorraad oplossing grenzend aan het ontvangende vaartuig.
    4. Transfer voldoende totale joodmethaan een kleine, schone buis. Elk analyt monster zal 105 pl joodmethaan vereisen. Transfer ~ 500 ul dichloormethaan in another schone buis. Om spuit verstoppingen te voorkomen, spoel de spuit met dichloormethaan onmiddellijk na joodmethaan overdracht.
      Voorzichtig: Joodmethaan fotogevoelig is, vluchtig en potente toxine tasten het centrale zenuwstelsel of het veroorzaken van de dood bij inademing of ingeslikt. Dichloormethaan is een potentieel kankerverwekkend, mutageen voor reproductieve en krachtige irriterende staat beschadiging van verschillende organen of het veroorzaken van de dood.
    5. Gebruik een analytische spuit om 105 pl joodmethaan toe te voegen aan elk te analyseren monster. Cap analyseren buizen onmiddellijk joodmethaan verdamping te minimaliseren. Grondig vortex en eventueel kort centrifuge alle monsters zodat er geen vloeistof in de kap overblijft. Elke kleur veranderen (bijvoorbeeld om bruin, paars of geel) signaleert joodmethaan degradatie, waarin de volgende permethylation reactie kan in gevaar brengen.
    6. Spoel de analytische spuit gebruikt om joodmethaan brengen met dichloormethaan minstens 3 keer. Dit maakt het weer voorkomenm verstopping. Gooi deze spoelen, samen met extra joodmethaan en dichloormethaan in een organisch vat gevaarlijk afval. Plaats gebruikte reageerbuisjes in een gevaarlijk afvalcontainer.
    7. Vraag een nieuwe set van 2 ml plastic reservoir buizen. Verwijder snap-caps indien gewenst.
    8. Koppel de microfuge mini filters. Centrifuge de unplugged kolommen voor 15 sec bij 2400 x g, en dan gooi het reservoir buizen samen met de DMSO effluent.
    9. Re-plug de gecentrifugeerd spin-kolommen, en leg ze in de nieuwe reservoir buizen. Nummer elke spin kolom en de bijbehorende reservoir buis met hetzelfde monster nummer. Zorg ervoor dat het mini filter stekkers zijn strak; mogelijke lekkage kan de volgende stap beïnvloeden. Minimaliseren de tijd tussen het verwijderen van DMSO uit de spinkolommen en overdracht van de analyt monsters op de spin kolommen.
    10. Permethylation
      1. Kwantitatief elke monsteroplossing over aan de overeenkomstige NaOH-bead-gevulde microfuge rotatie column. Gebruik een 1000-ul pipet tip voor deze stap. Na overdracht golfplaat ~ 2 mm van het uiteinde van een 200 ul tip en laat de inhoud kolom te gebruiken als een roerder. Herhaal dit voor alle monsters.
        Opmerking: De lage viscositeit van joodmethaan kunnen sample veroorzaken omdat de analyt oplossing kan druppelen van de pipetpunt tijdens de overdracht. Houd de monsterbuis en de spin kolom naast elkaar met één hand en de monsteroplossing met de andere hand snel overdragen.
      2. Laat de permethylation reactie verlopen gedurende 11 min. Roer elk monster ten minste 4-5 keer tijdens deze periode. Efficiënte permethylation, die optreedt aan het oppervlak van NaOH korrels vergemakkelijken, gebruik tip gekrompen gel-loading pipetpunten als roerwerken meng de inhoud kolom mengen. Agressieve mengen kan het rotatiefilter doorboren, verpulveren en schorten NaOH korrels (die de effectiviteit van verdere vloeistof / vloeistofextractie kan verminderen), en / of laat verlies van monster (de sample doordrenkte NaOH korrels kunnen overstromen van de kolom).
      3. Ter voorbereiding van de volgende vloeistof / vloeistof extractiestap, stelt een voldoende hoeveelheid 0,5 M natriumchloride (NaCl) oplossing in een 0,2 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,0), bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Elk monster wordt in totaal ~ 12 ml NaCl-oplossing voor alle drie cycli van vloeistof / vloeistofextractie nodig.
      4. Na voltooiing van de 11-min permethylation periode onmiddellijk maar voorzichtig de stekker uit de kolommen en centrifugeren ze gedurende 15 sec bij 2400 x g. Gooi de pluggen.
    11. Verwijder onmiddellijk spin-kolommen uit de centrifuge en leg ze in een nieuwe reeks van lege spin-reservoir buizen, waardoor de flow-through-oplossing voorzien van vers gepermethyleerd glycanen achter. Doe niets weggooien.
    12. Zo snel mogelijk, voeg 300 ul acetonitril (ACN) voor de droge, NaOH gevulde rotatie filters. Centrifugeer de rotatie filters gedurende 30 seconden bij 9600 x g.
    13. immediately daarna breng de belangrijkste permethylation oplossing (dat wil zeggen, de oplossing werd geïncubeerd met NaOH kralen voor 11 min versponnen gecentrifugeerd filter in een centrifugebuis voor de toevoeging van 300 ul van ACN in de vorige stap) tot 13 ​​x gesilaniseerd 100 mm reageerbuizen 42 met 3,5 ml van 0,2 M natriumfosfaat buffer die 0,5 M NaCl, pH 7,0 en mengen (vortex) onmiddellijk. Vermijd de overdracht van eventuele stevige witte residu tijdens deze stap. Doe dit voor elk monster voordat u verder gaat met de volgende stap.
    14. Onverwijld overdracht (combineer) de ACN spin-door middel van in elk reservoir buis (met) de rest van het vloeibare monster in hun respectievelijke gesilaniseerde glazen buis en meng (vortex) onmiddellijk. Nogmaals, vermijd de overdracht van eventuele stevige witte residu tijdens deze stap. Cap, schudden, en vortex de glazen buis. Herhaal dit voor elk monster. Gooi de NaOH kolommen en Pasteurpipetten in geschikte afvalcontainers.
  4. Vloeistof / vloeistof Extractie en Glycan Purification
    1. Binnen in de zuurkast, voeg 1,2 ml chloroform aan elk monster. Onmiddellijk daarna, cap de gesilaniseerde glazen buizen en krachtig de inhoud te mengen.
    2. Voorverwarmen metaalblokken tot ongeveer 75 ° C per verdamping verdeelstuk. Gebruik verwarming blokken met putten die is geschikt voor de 13 mm x 100 mm glazen buizen.
    3. Zorg voor een nieuwe reeks van gesilaniseerde Pasteurpipetten, non-gesilaniseerd Pasteur pipetten en gesilaniseerd reageerbuizen met kappen.
      Voorzichtig: Chloroform (CHCI3) een irriterend, mutageen en potentieel carcinogeen kunnen permeëren door sommige soorten handschoenen.
    4. Kort centrifuge (~ 3000 xg)-monster bevattende glazen buisjes aan de waterige en organische lagen scheiden.
    5. Gebruik een niet-gesilaniseerd Pasteur pipet genoeg van de bovenste waterlaag zodanig dat extraheren ~ 3 mm van de waterlaag boven de onderste organische laag blijft.
    6. Voeg 3,5 ml van de 0,5 M NaCl oplossing in een 0,2 M natriumfosfaatbuffer (pH 7) aan elk glazen buis krachtig mengen en kort centrifugeren (~ 3000 xg). Zoals in de vorige stap (1.4.3), gebruikt een niet-gesilaniseerd Pasteur pipet om de waterige laag te extraheren.
    7. Herhaal de vorige stap (1.4.4), maar laat ~ 1 ml van de waterige laag.
    8. Gebruik een schone gesilaniseerd Pasteur pipet om de organische laag te dragen aan een schone en gemerkte gesilaniseerd 13 x 100 mm glazen testbuis. Vermijd waterverontreiniging door extractie op de volgende wijze:
      1. Houd de huidige en nieuwe gesilaniseerd reageerbuizen naast elkaar in één hand. Met de andere hand, druk op de pipet bol om bellen te maken, terwijl het plaatsen van de pipet naar beneden door de waterlaag.
      2. Eenmaal in de organische laag, stoppen met het maken bellen, houdt u de pipet bol gestage om de organische en waterige lagen te stabiliseren en weer scheiden. Vervolgens langzaam de lamp vrij om zoveel mogelijk van de organi trekkenc layer mogelijk zonder waterverontreiniging.
      3. Snel verhogen de pipetpunt door de waterlaag en weerstaan ​​de natuurlijke reflex van de lamp (waardoor intrekking sommige waterverontreiniging) enigszins los, terwijl tegelijkertijd de pipet uit de buis.
      4. Een snelle overdracht van de lage viscositeit organische laag aan de aangrenzende nieuwe buis. Eventuele waterverontreiniging wordt getoond als kleine druppeltjes vloeistof bovenop de geëxtraheerde organische laag in de nieuwe glazen buisjes. Als waterig / NaCl besmetting zichtbaar is, verwijder deze dan met een pipet; centrifugeren indien nodig waterige druppeltjes bundelen tot een enkele druppel.
    9. Gooi oude glazen buizen, pipetten, en waterig en organisch afval oplossingen. Was en recyclen glazen buis caps.
    10. Droog alle monsters in een lichte en constante stroom van stikstof in een voorverwarmde verdamping verdeelstuk bij 75 ° C gedurende ~ 5 minuten in een zuurkast. Om verdampingskoeling te garanderen tijdens alle droge-down steps, moet een zachte en constante stroom van stikstof de vloeistof oppervlak verstoren zonder spatten of spatten van de vloeistof. Verwijder monsters uit de verdamping spruitstuk na volledige droging van de uiteindelijke steekproef. Witte vlekken op de bodem van een gedroogde glazen buizen geven buffer / NaCl besmetting.
    11. Pauzeren procedure hier als er onvoldoende resterende tijd op de dag om de TFA hydrolysestap voltooien. Tijdelijk (dat wil zeggen, 's nachts) op te slaan droog monsters bij -20 ° C. Om de procedure voort te zetten na de opslag, de monsters uit de -20 ° C vriezer en laat ze volledig warmen voor uncapping.
    12. Terwijl monsters warm, ter voorbereiding van trifluorazijnzuur (TFA) hydrolyse (volgende stap), de verwarmingsmantel zodanig dat de temperatuur van de vloeibare inhoud reageerbuis zal 121 ° C bereikt. Bereid de TFA-oplossing van TFA voorraad (zie stap 2.1 hieronder).

2. trifluorazijnzuur (TFA) Hydrolyse

  1. Bereid een voldoende hoeveelheid van een 2,0 M oplossing in TFA in gedeïoniseerd water. Elk analysemonster wordt 325 pl 2,0 M oplossing in TFA vereisen. Geconcentreerde TFA is 13,0 M.
  2. Voeg 325 ul van 2,0 M TFA elke analyt monster. Om TFA verdamping en het monster te voorkomen tijdens de daaropvolgende droogstap (2.3), strak cap elk monster buis onmiddellijk na het toevoegen van TFA. Markeer de oplossing in alle glazen buizen. Vortex elk monster grondig voor de volgende stap.
  3. Incubeer de goed afgesloten monsterbuizen gedurende 2 uur in een geschikt voorverwarmde verwarmingsblok of oven zodat de inhoud bereikt een temperatuur van 121 ° C. Bij gebruik van een verwarmingsblok plaats van een oven, cover monsterbuizen met aluminiumfolie om condensatie van TFA aan de bovenkant van de buis en gedeeltelijk drogen van het monster residu op de bodem van de buis te voorkomen. Controleer het monster oplossing niveaus na 20-30 min.minimale TFA verdamping verzekeren. Indien nodig, draai de doppen verdere of doppen te vervangen voor een strakkere pasvorm.
  4. Gedurende de 2-uur laten wachten, stelt een verdamping spruitstuk 75 ° C voor de volgende stap (zie 2.4).
  5. Wanneer de 2-uur verwarmingsperiode volledig droge monsters bij 75 ° C onder een voorzichtige stroom stikstofgas gedurende ~ 15 minuten. Niet monsters onbeheerd voor meer dan 15 minuten vertrekken. Controleer regelmatig monsters, en stoppen met verwarmen en drogen zodra alle monsters droog zijn.
  6. Pauzeren procedure hier als er onvoldoende resterende tijd op de dag om de reductiestap voltooien. Tijdelijk (dat wil zeggen, 's nachts) op te slaan monsters bij -80 ° C. Om de procedure voort te zetten na de opslag, de monsters uit de -80 ° C vriezer, en hen in staat stellen om volledig te warmen voor uncapping.

3. Vermindering

  1. In een zuurkast, stelt een voldoende hoeveelheid van een 10 g / l natriumboorhydride (NaBH4) oplossing in 1 M ammonium hydroxide (NH4OH). Elk monster wordt 475 ul van deze oplossing vereist. Maak een nieuwe oplossing voor elke partij van de monsters. Geconcentreerd ammoniumhydroxide (27-30% w / w NH 3) ongeveer 14,5 M.
    Let op: Natriumboorhydride (NaBH4) is een hygroscopisch, reactief met water toxine en krachtige irriterende dat releases-upon contact met water licht ontvlambare dampen die ernstige brandwonden bij contact inademing, inslikken of oog- / huidirritatie veroorzaken.
    Let op: ammoniumhydroxide (NH 4 OH) is een bijtend irriterend en toxine kunnen veroorzaken ernstige brandwonden en onomkeerbare orgaanschade bij contact inademing, inslikken, of de ogen / huid. Spoel de getroffen gebieden met water gedurende 30 minuten, en te voorkomen dat het slachtoffer van wrijven of krassen op de getroffen gebieden.
  2. Aan elk monster, voeg 475 ul van de 10 g / l NaBH4 in 1 M NH4OH. Mix monsters grondig om eventuele resten te ontbinden. Cap reageerbuizen enkan de reductiereactie nog voor 1 uur.
  3. Gedurende de 1-uur wachten, stelt het verwarmde verdampingsoppervlak verdeelstuk 75 ° C. Gebruik een verwarmings-blok met geschikte putjes voor de glazen buizen (zie 3.4 hieronder).
  4. Als de 1-uur reactieperiode is voltooid, voeg 63 ul methanol (MeOH) aan elk monster. Deze stap en de volgende stap Resten boor of trimethylboraat - een relatief vluchtige vloeistof die kookt bij 68 ° C.
  5. Droge monsters (in de voorverwarmde verdeelstuk) bij 75 ° C onder een voorzichtige stroom stikstofgas gedurende ~ 15 minuten. Controleer regelmatig monsters en ze niet onbeheerd achter. Kleine vloeistofdruppels op de bodem van de glazen buizen is het monster nog niet droog.
    Opmerking: Om luchtbellen te onderscheiden van vloeibare druppeltjes, kantelt de reageerbuis. Alleen vloeibare druppels zal bewegen na het kantelen, maar het omgekeerde is niet altijd waar: als een luchtbel niet beweegt, kan het nog steeds een (heel klein) vloeistofdruppel zijn.
  6. Zodra samples helemaal droog zijn, voor te bereiden een 9: 1 (v / v) oplossing van methanol (MeOH) en azijnzuur (AcOH). Voeg 125 ul van deze MeOH: AcOH oplossing aan elk monster.
  7. Droge monsters (in een voorverwarmde verdeelstuk) bij 75 ° C onder een voorzichtige stroom stikstofgas.
  8. Wanneer monsters helemaal droog zijn, vacuüm-drogen van de monsters gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur: Leg monsters in een plastic vacuum bad (zoals die verkocht door FoodSaver), sluit het vacuüm deksel, zet het vacuüm draaiknop om "vacuüm", sluit de zuigslang, en zet het vacuüm. Om het vacuüm te demonteren in omgekeerde volgorde te werk gaan. Wacht totdat het systeem volledig decomprimeren alvorens het vacuüm deksel te openen.
  9. Pauzeren procedure hier als er onvoldoende resterende tijd op de dag om de reductiestap voltooien. Tijdelijk (dat wil zeggen, 's nachts) op te slaan monsters bij -80 ° C. Om de procedure voort te zetten na opslag, verwijder de monsters uit de -80 ° C vriezer, en laat ze volledig opwarmen voordat uncapping.
  10. In afwachting van monsters aan vacuüm drogen (of warm, na opslag), bereid de reagentia voor de volgende stap. Het verkrijgen en het nummer van een gesilaniseerd conische bodem autosampler (AS) flacon (met dop) voor elk monster. Bovendien voorverwarmen zowel ondiepe putjes AS-flacon verwarmingsblok en een diepe putjes glazen buis blokkeren zodat de inhoud glasbuis een temperatuur van 50 ° C bereikt.

4. Acetylation (Uitgevoerd in een zuurkast)

  1. Voeg 18 ul gedemineraliseerd water aan elk monster. Cap en grondig vortex alle buizen om eventuele neerslag volledig op te lossen.
  2. Voeg 250 ul azijnzuuranhydride aan elk glazen buis. Cap grondig vortex en ultrasone trillingen in een waterbad gedurende 2 min tot volledige oplossing van residuen en precipitaten te waarborgen.
  3. Dekglas buizen met aluminiumfolie en incubeer bij een inwendige temperatuur van 50 ° C gedurende 10 minuten.
  4. Voeg 230 ul geconcentreerd trifluorazijnzuur (TFA) aan elk monster. Onmiddellijk cap eend meng de monsters. Dan, incubeer de monsters bedekt met aluminiumfolie gedurende 10 min bij een inwendige temperatuur van 50 ° C.
  5. Na incubatie, voeg 1,8 ml dichloormethaan (CH 2Cl 2) aan elk monster. Cap en meng goed.
  6. Voeg 2,0 ml gedemineraliseerd water aan elk monster. Cap en mix monsters ook. Centrifuge van 0 tot 3000 xg om de lagen te scheiden. Gebruik een niet-gesilaniseerd Pasteur pipet vloeistof / vloeistof extractie uit te voeren zoals beschreven in stap 1.4.6, het vermijden van waterverontreiniging.
  7. Herhaal de extractie nog een keer, voor een totaal van twee extracties. Gebruik gesilaniseerd Pasteur pipetten om de organische laag in gelabelde gesilaniseerd AS flesjes (stevig vastgehouden in een AS rack) over te dragen. Vul het AS flesjes tot net onder de rand.
  8. Gebruik een voorverwarmde, ondiepe putjes verwarmingsblok op droge monsters (in AS flesjes) gedurende 15 minuten bij 40 ° C onder stikstofgas. Niet te drogen. Final producten staan ​​bekend als gedeeltelijk gemethyleerd alditol acetaten (PMAAs).

5. gaschromatografie - massaspectrometrie (GC-MS)

  1. Reconstitueer elk monster in 100 ul van aceton en meng goed. Gebruik een autosampler tot 1 pl van elk monster in split-modus te injecteren in de GC split-modus liner (gehandhaafd op 280 ° C en met een kleine prop gesilaniseerde glaswol). Gebruik een splitsingsverhouding van 40. Gebruik helium als draaggas bij constante stroom modus bij 0,8 ml / min door een 30-m DB-5ms GC kolom met een 0,25 mm ID en 0,25 micron filmdikte.
  2. Houd de aanvangstemperatuur GC oven bij 165 ° C gedurende 0,5 min. Na de eerste wachttijd, het programma van de oven om de temperatuur oprit, voor elke run, van 165 ° C tot 265 ° C met een snelheid van 10 ° C / min (waarvan 10 minuten duurt) en vervolgens onmiddellijk opvoeren van de temperatuur 265 ° C tot 325 ° C met een snelheid van 30 ° C / min (waarvan 2 min draait) en de temperatuur op 325 ° C gedurende 3 minuten handhaven. De totale looptijd per monster is 15,5 min.
  3. Gebruik een proPerly afgestemd en gekalibreerd massaspectrometer de monstercomponenten elueren van de GC-kolom onderwerpen aan elektronen ionisatie (EI, 70 eV bij 250 ° C). Voor een TOF massa-analysator, analyseren fragmenten van m / z 40 m / z 800 met een 0,1-sec puls sommatie tarief. Stel een EI-filament oplosmiddel vertragingstijd van 2,5 min.

6. Data Analysis

  1. Bij gebruik van een TOF massa-analysator, tel de meest voorkomende en / of diagnostisch fragment ionen per PMAA door een massa raam van 0,15 Da een geëxtraheerde ionenchromatogram verkrijgen. Target-ionen voor elke PMAA zijn elders gepubliceerd, 33 maar de volgende wijzigingen aangebracht: t-Glc ionen zijn nu 145,1 + 205,1; 2-Man ionen 161,1 + 189,1; 3-Gal ionen 161,1 + 233,1, 6-Gal ionen 161,1 + 189,1 + 233,1; 2,6-Man ion 189,1; 3,6-Man ionen 189,1 + 233,1.
  2. Gebruik QuanLynx of andere software om automatisch te integreren piekoppervlakken voor elk opgeteld gewonnen ion chromatogram.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een totale ionenstroom chromatogram (TIC) weergegeven succesvol permethylation, hydrolyse, reductie en acetylering van humaan bloedplasma monsters ten opzichte van gevallen waarin twee belangrijke stappen permethylation correct zijn uitgevoerd zijn getoond in figuur 3.

Absolute Opbrengst van HexNAcs Ten opzichte van hexosen:

N -acetylhexosamine (HexNAc) gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs) hebben de neiging om lagere opbrengst dan hexosen hebben. 43 Om de absolute rendement van HexNAcs ten opzichte van hexosen schatten, zes 10 ug monsters van N-acetyllactosamine (a Gal1-4GlcNAc disaccharide) in 10 pl water werden geanalyseerd. TIC piekoppervlakken voor eindstandige galactose (t-Gal) en 4-GlcNAc geïntegreerd. Het percentage 4-GlcNAc betrokken op de totale hoeveelheid aan T-Gal en 4-GlcNAc was 11,3 ± 0,7%(SEM). Hoewel HexNAc opbrengsten reproduceerbaar (zie hieronder), dat deze waarde veel lager dan de theoretische waarde van 0,5 geeft aan dat de opbrengst van HexNAcs fundamenteel lager dan die van hexosen. (De HexNAc theoretische opbrengst is 0,5 omdat de N-acetyllactosamine een 1:. 1 hexose-HexNAc disaccharide)

Intra- en inter-reproduceerbaarheid:

Intra- en inter-reproduceerbaarheid voor alle knooppunten glycan dragen ten minste 1% van de totale hexose of HexNAc signaal wordt gegeven in tabel 1. Deze gegevens werden op 3 verschillende dagen door 3 afzonderlijke analisten verkregen met dezelfde voorraad EDTA plasma. Autosampler stabiliteitsgegevens krachtens deze geoptimaliseerd protocol voor de 18 meest voorkomende glycaan knooppunten in humaan plasma (bijvoorbeeld door met> 1% van de totale hexose of HexNAc signaal) worden gegeven in Figuur 4.

Andere opmerkelijke waarnemingen:

Waarbij optimaal permethylation methodologie, vonden we dat het niet nodig is om adsorptie van water te voorkomen door de NaOH korrels voor het wassen met acetonitril initiële. We vonden ook dat de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid water tijdens de laatste stap acetylering in combinatie met een korte periode van verwarming met azijnzuuranhydride zonder TFA helpt om volledige reactie te vergemakkelijken. Tenslotte hoge oplossend vermogen van time-of-flight (TOF) massaspectrometrie is niet noodzakelijk voor een succesvolle glycaan knooppunt analyse: De eerste resultaten gebaseerd op parallelle injectie van hetzelfde stel monsters op een GC-TOF-MS een traditioneel transmissie quadrupole gebaseerde GC-MS geëxploiteerd geselecteerd ionen (SIM) modus tonen vergelijkbare resultaten met betrekking tot de uiteindelijke genormaliseerde hexose en HexNAc relatieve abundanties.

er.within-page = "1"> Figuur 1
. Figuur 1. Moleculaire overzicht van de wereldwijde glycaan methylatie analyse procedure Een O-gebonden glycan is geïllustreerd; die vrijkomen tijdens het permethylation proces, dat is aangepast uit Goetz. 40 Na permethylation en hydrolyse, zijn monosacchariden verminderd en ontluikende hydroxylgroepen door acetylering "gemarkeerd". Het unieke patroon van methylatie en acetylering in het uiteindelijke gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs) komt overeen met de unieke "glycan knooppunt" in het oorspronkelijke intacte polymeer en verschaft de moleculaire basis voor scheiding en kwantificering van GC-MS. N-gebonden glycanen en glycolipide worden uitgebracht als-koppeling gemarkeerd monosachariden tijdens zure hydrolyse. Aangepast van Borges et al. 33 met toestemming.> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Conceptueel overzicht van het analytisch concept. Een opgereguleerd glycosyltransferase (bijvoorbeeld GnT-V) veroorzaakt een toename van de hoeveelheid van een bepaalde, unieke gelinkte glycan monosaccharide residu (2,6-gekoppelde mannose "knooppunt" in dit voorbeeld) -die door de daaropvolgende werking van andere glycosyltransferasen, kan leiden tot vorming van een mengsel van heterogene hele-glycaan structuren klein aantal kopieën per-allemaal kunnen moeilijk te detecteren en te kwantificeren routineus. Analytisch bundelen de "glycan nodes" van onder alle afwijkende glycan structuren zorgt voor een meer directe surrogaat meting van GnT-V activiteit dan een enkele intact glycan. Gelijktijdige meting van N - O - en lipide gekoppeld "glyc een nodes "geheel biostalen zoals hier beschreven (en oorspronkelijk elders 33) een conceptueel nieuwe middel om te detecteren en bewaken glycan-affectieve aandoeningen zoals kanker. Werkelijke geëxtraheerd ion chromatogrammen van 10 microliter bloed plasmamonsters getoond. nummers naast monosaccharideresten in glycan structuren geven de positie waarop de hogere residu wordt gekoppeld aan het onderste residu. Als geen verband posities in het chromatogram annotatie aangegeven het residu hetzij in de terminale positie of vrij in oplossing (bijvoorbeeld glucose). Alle residuen . behalve siaalzuur koppeling naar beneden via hun 1-positie; sialinezuur koppelingen naar beneden via zijn 2-positie in Split chromatogram geeft verandering in geëxtraheerd ion chromatogrammen: m / z 117 129 voor hexose residuen en m / z 116 + 158 voor N - acetylhexosamine (HexNAc) residuen. Aangepast van Borges et al. 33 met toestemming.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Representatieve resultaten. Totale ionenstroom chromatogrammen (TIC) voor glycaan knooppunt analyse van dezelfde menselijk bloed EDTA plasma monster waarin A) het monster correct verwerkt, B) het witte residu in de permethylation oplossing werd versponnen via NaOH kolom werd gedragen naar de daaropvolgende mengsel vloeistof / vloeistofextractie, en C) het permethylation oplossing werd gesponnen door de kolom NaOH werd toegevoegd aan fosfaatbuffer maar grondig gemengd, voorafgaande aan de toevoeging van chloroform voor vloeistof / vloeistofextractie. Legend verschaft in Figuur 2. Klik here om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Autosampler Stabiliteit. Autosampler stabiliteit meer dan 48 uur voor de 18 meest voorkomende glycan knooppunten in menselijk plasma. Bij 22 uur werd het monster volledig gedroogd en opgelost in 120 pl aceton. Elk cluster datapunten vertegenwoordigt vier opeenvolgende injecties van hetzelfde monster. Zwarte lijnen omvat ± 15% van de gemiddelde genormaliseerde waarde voor elke glycan knooppunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

tafel 1
Tabel 1. Intra- en inter-reproduceerbaarheid. De waarden vertegenwoordigen% CV van de totale hexose of totale HexNAc-genormaliseerde individuele glycan knooppunten. Alle glycan nodes dragen ten minste 1% van de totale hexose of HexNAc signaal weergegeven. De gegevens werden overgenomen door 3 afzonderlijke analisten op 3 verschillende dagen, met behulp van dezelfde voorraad van EDTA plasma. N = 6 monsters per batch. Klik hier om deze tabel te downloaden als een Excel-spreadsheet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In het algemeen is de succesvolle productie van partieel gemethyleerde alditol acetaten (PMAAs) vanaf hexosen is beladen met minder problemen en is robuuster dan de succesvolle productie van N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. Het exacte mechanisme achter dit fenomeen speelt in elke stap van deze procedure is niet bekend, maar moet betrekking hebben op de unieke chemie van de N-acetyl groep (in plaats hydroxylgroep) die uniek is HexNAcs opzichte van hexosen. Het mechanisme achter dit verschijnsel betrekking hebbend op zuurhydrolyse wordt elders. 43 toegelicht Kortom, de capaciteit voor het N -methylacetamido positief geladen tijdens zuurhydrolyse werd, maakt de glycosidische binding bestand tegen zure hydrolyse. Dit verklaart de lage opbrengst van HexNAc opzichte van hexose (11,3% van de totale HexNAc + hexose-signaal, in plaats van 50% van het totaal) zoals hierboven beschreven voor de analyse van N-acetyllactosamine. Met name deze relatief lower opbrengst van HexNAcs maakt hen niet moeilijk op te sporen in complexe biovloeistoffen en weefsels, of beletsel voor gemakkelijke detectie van glycan nodes afkomstig van grote, complexe glycanen (bijvoorbeeld 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 maken -man, en 3,4-GlcNAc, figuur 2). 33 aangezien de wijze waarop XIC piekoppervlakten van glycan knopen genormaliseerd (stap 6,3), zolang de relatieve opbrengst van elke afzonderlijke HexNAc consistent blijft ten opzichte van andere HexNAcs ( die het doet, zie tabel 1), nuttige informatie over de relatieve hoeveelheden van de verschillende HexNAcs tussen verschillende monsters kunnen worden verkregen. Dit geldt voor hexosen ook. Bovendien hebben we eerder aangetoond dat de verhoudingen van hexosen tot HexNAcs samenhangende kwantitatieve functie en 33 tonen - een fenomeen dat voortdurend via op- QC monster (s) in elke batch wordt gecontroleerd.

De wijze waarop permethylation is uitgevoerd heeft de grootste invloed opde totale opbrengst en reproduceerbaarheid van HexNAc PMAAs. In het bijzonder moet grote zorg worden genomen om blootstelling van gepermethyleerd glycanen volledig te vermijden aan waterige omstandigheden alkalisch. Twee belangrijke stappen in dit verband zijn: 1) waarbij alle wit neerslag in de spin-through oplossingen achter (Stappen 1.3.13 en 1.3.14), en 2) onmiddellijk mengen van de spin-through oplossingen wanneer ze worden toegevoegd aan het fosfaat buffer ( stappen 1.3.13 en 1.3.14). Een buffer in plaats van eenvoudige zoutoplossing opgenomen in deze fase en daaropvolgende vloeistof / vloeistofextractie stappen om onbedoelde basisch van de waterige oplossing te voorkomen. We vermoeden dat onder alkalische omstandigheden de acetylgroep van de gemethyleerde en geacetyleerde 2-aminogroep van HexNAcs hydrolyse kan ondergaan, wat resulteert in een meer polair secundair amine dat de totale extractie-efficiëntie van de bijbehorende glycan met chloroform afneemt.

De meest herkenbare kenmerk van succes gepermethyleerd HexNAcs isde intensiteit van de 4-gekoppelde GlcNAc (4-GlcNAc) chromatografische piek ten opzichte van die van 6-Gal, 3,6-Man, en de basislijn intensiteit van de achtergrond tijdens laatste kolom wegbakken (figuur 3). Wanneer de absolute overvloed van de 4-GlcNAc PMAA laag, de genormaliseerde overvloed opzichte van alle andere HexNAcs ook de neiging laag te zijn, met een gelijktijdige toename (meest merkbaar) 3,4-GlcNAc.

Enkele veranderingen ontworpen om totale opbrengst en assay robuustheid optimaliseren zijn aangebracht sinds onze eerste publicatie beschrijft deze analytische benadering 33 Een van deze veranderingen is de wijze waarop de geïntegreerde geëxtraheerde ion chromatogrammen (XICs) zijn genormaliseerd. Omwille van de eenvoud we nu verdelen het oppervlak van elke individuele hexose XIC door de som van hexose XIC gebieden; evenzo is het oppervlak van elke individuele HexNAc XIC gedeeld door de som van alle HexNAc XIC gebieden. Zoals blijkt uit tabel 1, algemene interassay / inter-analyst reproducibility voor glycan nodes die tot> 1% van de respectievelijke hexose of HexNAc signaal gemiddeld 13% CV dragen.

Voor zover wij weten, is dit de enige incarnatie van echte bottom-up glycomics waarin glycanen eerst worden afgebroken en vervolgens hun componenten geanalyseerd om een ​​kwantitatief monster-brede portret van glycan samenstelling te construeren. Hier, in plaats van de traditionele enzymatische release, de permethylation proces niet-reductief elimineert (releases) O-gebonden glycanen uit hun respectievelijke eiwitten, 40, terwijl N-gebonden glycanen vrijkomen bij zure hydrolyse. 33 als een complementaire benadering van de traditionele top-down glycomics deze benadering kan glycaan unieke eigenschappen van belang zoals "kern fucosylatie", "6-sialylering", "splitsend GlcNAc" en "beta 1-6 branching" in één analytische signalen (zie, 4,6-GlcNAc pool , 6-Gal, 3,4,6-Man en 2,6-Man knooppunten in figuur 2, respectively). In traditionele top-down benadering, worden functies zoals deze die uiteindelijk afhangen van de unieke activiteiten van een of twee belangrijke glycosyltransferasen 33 meestal verdeeld over tientallen intacte glycanen en kan soms moeilijk of onmogelijk te lossen (bijvoorbeeld 3-sialylering vs. 6-sialylering) door de degeneratie van sommige intacte glycan massa. Bovendien heeft de bottom-up benadering hier gepresenteerde aanvankelijke belofte in niet-invasief het opsporen van longkanker aangetoond. 33 Verdere studies zijn aan de gang om deze eerste bevindingen, evenals extra, nog niet gepubliceerde resultaten met betrekking tot het opsporen van andere vormen van kanker te valideren.

De grootste beperking van de aanpak die hier beschreven is dat het beperkt qua detectiegrenzen indien het zou worden toegepast op vooraf geïsoleerde glycoproteïnen. Op basis van de gepubliceerde analyses van individuele glycan normen zonder dragereiwit, bepaalbaarheidsgrenzen for individuele glycanen lijken te liggen in het lage microgram bereik. Deze zijn geenszins lage LOQ in absolute termen, maar dit feit is niet van belang met betrekking tot de oorspronkelijk beoogde reikwijdte van de bepaling die niet is ontworpen voor en heeft geen behoefte om lage LOQ bereiken (althans voor de doeleinden beschreven en in onze eerdere publicatie 33). Het menselijk plasma / serum bevat glycoproteïnen in de 10s van mg / ml concentratiebereik-betekent dat voor de analyse van bloedplasma / serum we alleen injecteren ~ 1/100 van het uiteindelijke monstervolume en split 40 uit 41 delen dat kleine hoeveelheid afval in de GC injector poort. Zonder deze praktijk, kan een deel van de glycan nodes de detector verzadigen. Picomol hoeveelheden glycoproteïnen die voldoende intact glycan signalen te produceren door conventioneel bovenaanzicht MALDI-MS of LC-MS gebaseerde benaderingen kunnen niet worden gedetecteerd met deze benadering. Verdere verfijning van de methodiek is aan de gang om deze beperking te verhelpen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide beads  367176 Sigma-Aldrich  20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 ml Spin column 69705 Pierce division of ThermoFisher Scientific  Includes  plugs and polyethylene frits 
GC-MS autosampler vial (silanized)* C4000-9 ThermoFisher Scientific Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 ml polypropylene test tubes 05-402-25 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
2 ml polypropylene test tubes 05-408-138 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D8418 Sigma-Aldrich  BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane  I8507 Sigma-Aldrich  Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile A955-4 ThermoFisher Scientific  Optima LC/MS
Microcentrifuge 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge ThermoFisher Scientific  24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)* 53283-800 VWR 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes 14-930-15D ThermoFisher Scientific  Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride  S7653 Sigma-Aldrich  >99.5% pure
Chloroform 4440-08 Macron Fine Chemicals 
Trifluoroacetic acid  299537 Sigma-Aldrich  99% purified by redistillation for protein sequencing 
Sodium borohydride 71321 Fluka Analytical  99%
Ammonium hydroxide solution  320145 Sigma-Aldrich  NH3 content: 28.0-30.0%
Methanol AH230-4 Honeywell Burdick & Jackson HPLC grade
Acetic acid  320099 Sigma-Aldrich  99.70%
Plastic vacuum desiccator  Any model of adequate size FoodSaver
Acetic anhydride  539996 Sigma-Aldrich  99.50%
Dichloromethane  D143SK-4 ThermoFisher Scientific  Stabilized HPLC grade
Acetone  9006-03 J.T.Baker Baker Analyzed 
Heated evaporation manifold (main unit) pi18823 ThermoFisher Scientific  Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) pi18826 ThermoFisher Scientific  ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold pi18816 ThermoFisher Scientific  Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep)
Gas chromatograph Model A7890 Agilent  Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer  GCT Premier (Time-of-Flight) Waters 
Split-mode liner (deactivated / silanized) 5183-4647 Agilent Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column 122-5532 Agilent 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane 95541 Sigma-Aldrich 
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) EW-06536-30 Cole-Parmer 12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
  2. Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans (2009).
  3. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  4. Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
  5. Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
  6. Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
  7. An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
  8. Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
  9. Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
  10. Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
  11. Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
  12. Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
  13. Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
  14. Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
  15. Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
  16. Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
  17. Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
  18. Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
  19. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
  20. Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
  21. Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
  22. Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
  23. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  24. Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
  25. Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
  26. Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
  27. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
  28. Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
  29. Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
  30. Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
  31. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  32. Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
  33. Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
  34. Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
  35. Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
  36. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
  37. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  38. Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
  39. Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
  40. Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
  41. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
  42. Seed, B. Silanizing glassware. Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).
  43. Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).

Tags

Chemie Glycobiology glycanen glycosyltransferase kanker permethylation massaspectrometrie (MS) gaschromatografie (GC) glycoproteïnen,
Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y.,… More

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y., Ferdosi, S., Borges, C. R. Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics. J. Vis. Exp. (111), e53961, doi:10.3791/53961 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter