Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics

Published: May 22, 2016 doi: 10.3791/53961
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Introduction

Glycolipids, גליקופרוטאינים, proteoglycans, ו glycosaminoglycans מהווים ארבעת הסוגים העיקריים של פחמימות מורכבות, הטרוגניות הידוע קולקטיבי גליקנים. כמו רכיבים בכל מקום ובלתי נפרדים של קרום הפלזמה, glycocalyx, ואת תאי מטריקס ונוזלים, גליקנים להתכבד תהליכי ביוכימיים מגוונים כגון אנדוציטוזה, סחר תאי, תנועתיות תא, אות תמרה, הכרה מולקולרית, הפעלת קולטן, הידבקות תא, אינטראקציה לפתוגן המארח , תקשורת, immunosurveillance אינטר, וייזום התגובה החיסונית. 1 הווה כמעט בכל תחום של החיים, אנזימים המכונה glycosyltransferases הבונות לפעול פולימרים glycan בד בבד עם hydrolases glycoside (הידוע גם בשם glycosidases, אשר לשבור גליקנים) לבנות, לשפץ, ובסופו של דבר לייצר סופית פולימרים glycan 2. למרות שכל glycosyltransferase יכול לפעול על glycoconjugates אחר, glycosyltransferaseבדרך כלל קרנות קשר glycosidic ספציפי אנומר linkage- ועל ידי העברת מחצית monosaccharide של תורם סוכר בפרט מופעל נוקלאוטיד (למשל, תוצר-פוקוז) לפי קטגוריה מסוימת של acceptors nucleophilic (למשל, חומצת שומנים, פוליפפטיד, גרעין, או גדלנו oligosaccharide). הערכה הוא כי יותר מ -50% של חלבונים (במיוחד הממברנה וחלבוני הפרשה) הם פוסט-translationally שונה על ידי glycosylation 3 חישובים קומבינטורית בסיסיים לספק הערכת ההשתנות הניכרת, הצדדית, וספציפיות מוענקות גליקופרוטאינים ידי glycosylation.; למשל, אם מצע פוליפפטיד יש רק 10 אתרים glycosylation וכל אתר יכול ליצור הצמדה glycosidic עם 1 מתוך 3 רק הקצוות צמצום monosaccharide שונה, אם כן, באופן תיאורטי, גליקופרוטאין הסופי ניתן להניח 3 10 = 59,049 זהויות נפרדות. בשנת גליקופרוטאינים, קשרים glycosidic יוצרים בדרך כלל עם o חנקן-שרשרת הצדשאריות f asparagine ברצף ASN-X-שירו / Thr (X יכול להיות כל חומצת אמינו למעט פרולין) להניב N -glycans 2 ו-שרשרת הצד hydroxyls של שאריות סרין ו תראונין להניב O -glycans 4. הרכב של של glycome תא (כלומר, המשלים שלו של מוצרי glycosylation) הוא ייחודי ומוגבל כי, עם כמה יוצא מן הכלל, glycosyltransferases להפגין תורם קפדן, acceptor, וספציפיות הצמדה. 5 גליקופרוטאינים פלזמה בדם חשובים ורב סובלים glycosylation סוטה כתוצאה במורד זרם ביטוי ופעילות glycosyltransferase החריגים בשל במצבים פתולוגיים רבים, במיוחד סרטן ומחלות דלקתיות. 6-24

בעיקר בשל גורמים אפיגנטיים, את glycome הוא משמעותי יותר מגוון, דינאמית, ומורכב מאשר proteome ו transcriptome. 25,26 בעוד כ 1% של הגנום היונק המקודד את ההיווצרות, השינוי,הרכבה של גליקנים, 27 תמורת glycosylation בתוך בניגוד בולט-באופן מונחה שאינה תבנית פוליפפטיד וביוסינטזה חומצות גרעין. משחק הגומלין בין כמות הפעילות היחסית של אנזימי glycosylation וגורם סביבתיים כגון זמינות תזונתיות מבשרות שקובע בסופו של דבר את האופי, שיעור, והיקף של glycosylation. 5,28 עובר (למשל, נחישות בידול), הפעלה סלולרית, והתקדמות דרך גן ביטוי השפעת תא המחזור (כלומר, שעתוק ותרגום) ולשנות את הזהות וכמות הזמין glycosyltransferases, שפעילותם היא הגורם המכריע נגד הזרם המיידי של פרופיל glycan של התא. בגלל (חלק) את השגשוג, דבק, ומאפיינים פולשנית של תאים סרטניים דומים לאלה של תאי embryogenic רגילים, שינויים ספציפיים במסלולי biosynthetic glycan (למשל, הצטברות מבשרת, ביטוי ושוחרר, aberranשינוי t, עיצור מבני, או היווצרות רומן) לשרת סמנים לסרטן אוניוורסלי המציינים בשלבים שונים של היווצרות גידולים, התקדמות, הגירה, ופלישה 29 למרות glycosylation הוא מורכב מאוד, כנראה רק כמה שינויים glycosylation יכולים לאפשר היווצרות סרטן וגרורות.; כנראה, מוצרי glycosylation "סוטים" מסוימים אכן נהנים תאים סרטניים בכך שהיא מאפשרת להם להתחמק הכרה חיסונית לשרוד את הדרישות של הגירה בסביבות intravascular ו גרורתי ועוין. 28,30,31 באופן לא מפתיע, ניסויים חשפו כי לשבש או למנוע דפוסי שינה ביטוי גנים והיווצרות glycan סוטה יכולים לעצור tumorigenesis. 29 עם זאת, גליקנים הסוטים זוהו מדגם biofluid (למשל, שתן, רוק, פלזמת דם או בסרום) לא יכולים להיות אינדיקטורים ישיר של הסרטן (או מחלה אחרת), אלא במורד זרם תוצאות של עדין אך משמעותישינויים במערכת החיסונית או השלכות לכימות של מצב הרסני באורגן צפוי. 32

למרות שהם מספקים מידע אוניוורסלי על glycome, טכניקות glycomics מבוסס אינטראקציה מולקולריות רבות (למשל, לקטינים / מערכי נוגדן ומטבוליות / תיוג קוולנטיים) תלוי זיהוי של מבני glycan כולו ואל תספקו מידע מבני מפורט על גליקנים פרט. בניגוד בולט, ספקטרומטריית מסה (MS) יכולה לעזור לזהות ולכמת ומבני glycan פרט לחשוף מידע מבני כגון אתרים מצורפים ליבות פוליפפטיד. ביטוי או פעילות פיקוח ממשלתי של glycosyltransferase רק אחד יכול ליזום מפל של אירועים מולקולריים מזיקים במסלולי glycosylation מרובים. מכיוון שכל glycosyltransferase יכול לפעול על יותר מ המצע glycoconjugate אחד ועל פני פולימרים glycan גדל שונים, מפלי biosynthetic deregulated להניב disproportionally כמויות גדולות יותר של המוצר glycan אבל כמה היחיד בכיתות הטרוגניות של גליקנים סוטה בנוזלי התוך או תאיים. 33 עם זאת, גליקנים סוטה ייחודי כזה לפעמים נחשבים מעשי כסמנים ביולוגיים לסרטן או פתולוגיות glycan-רגשיים אחרים, שכן בהשוואה הבריכה הגדולה של היטב מוסדר גליקנים, גליקנים הסוטים אלה מייצגים רק חלק קטן מאוד היא, לעתים קרובות להישאר לגילוי אפילו בטכנולוגיות כגון רגישות גבוהה כמו ספקטרומטריית מסה. לדוגמא, בנוזלי גוף תוך תאיים, ספקטרום חלבון-הריכוז הרחב (אשר משתרע על פני שמונה סדרי גודל) יכול למנוע זיהוי של גליקופרוטאינים נדירים כי הם רעולים פנים על ידי המינים שופעים יותר. 32 יתר על כן, בקביעת פעילות glycosyltransferase נשארה ניכר מעשי ואתגר תיאורטית כיוון glycosyltransferases רב נעדר biofluids הקליני או להיות פעיל vivo לשעבר. למרות הקושי של consistently גילוי וכימות כמויות אולטרה-דקות של גליקנים שלם ייחודי, מתרגלים של ספקטרומטריית מסה עשו צעדים עצומים כלפי העסקת גליקנים שלמים כסמנים קליניים. פתחנו לאחרונה גישה משלים לניתוח של גליקנים שלם כי, העסקת GC-MS, מקלה על זיהוי של כל סניף נקודות המכוננות מונוסכרידים ספציפי הצמדה ( "צומת glycan") שיחד להקנות ייחודיים לכל glycan ובהרבה במקרים ישירות לשרת פונדקאי מולקולרית כמו זה לכמת את הפעילות היחסית של glycosyltransferase האשם (הים).

מאז שלה דיווח לראשונה בפנייה ישירה ניתוח glycan בשנת 1958, גז כרומטוגרפיה (GC) הוכיחה טכניקה רבת עוצמה כדי לנתח שידורי מפוגל מונו ו disaccharides, 34 לקבוע anomericity שלהם ותצורה מוחלט, ולהפריד אותם לניתוח spectrometric הבאים המוני. 35 בין השנים 1984 ו -2007, Ciucanu ועמיתיוהציג ומעודן טכניקה permethylation glycan-שלב מוצק שהעסיקה הידרוקסיד נתרן iodomethane, ואחריו מיצוי נוזלי נוזלי / של גליקנים permethylated באמצעות מים כלורופורם. 35,36 בין השנים 2005 ו -2008, קאנג ועמיתים לעבודה משולבת ספין חוסך זמן הגישה -column לתוך צעד permethylation. 37,38 בשנת 2008, קבוצת המחקר גץ המציאו-שלב מוצק כמותית permethylation שיטת glycan-פרופיל משתמש יינון-desorption לייזר בסיוע מטריקס (MALDI) ספקטרומטריית מסה כדי להשוות ואפשרות להבחין פולשנית ובלתי תאי -invasive סרטן השד; 39 אז, בשנת 2009, האנזימטית גץ צוות המשולבת וטכניקות שחרור כימיות לדבוק O -glycans מ גליקופרוטאינים שלם בתכנית permethylation מוצק שלב בסיסית מאוד 40 למרות הליך גץ הקל permethylation סימולטני ושחרור כימי. של O -glycans, יושם זה רק כדי glyco טרום מבודדחלבונים. שינינו את הטכניקה הזו בשנת 2013 והתאימה אותו עבור biofluids unfractionated כולו דגימות רקמה הומוגני ידי שילוב חומצה trifluoroacetic (TFA) הידרוליזה, הפחתה, ואת acetylation צעדים. 33 צעדים נוספים אלה גם לשחרר גליקנים מ glycolipids ו- N -linked גליקנים מ גליקופרוטאינים ולהמיר אותם acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs, איור 1), שדפוסי מתילציה-ו-acetylation ייחודי להקל על ניתוח על ידי GC-MS ייחודי לאפיין את בלוטות glycan מכוננת בפולימר glycan ללא פגע המקורי 41 (איור 2). 33 בסופו של דבר, זה הליך מייצר דיוקן מורכב של כל גליקנים בתוך biofluid מורכב הבוסס על ישירה, כימות יחסית של תכונות glycan ייחודיות כגון "ליבת fucosylation", "6-sialylation", "שחצה GlcNAc", ו "בטא 1-6 הסתעפות" - כל נגזר chromatograp GC-MS יחידשיא יק. מאמר זה מציג אופטימיזציה נוספת של permethylation, acetylation, בידוד, ושלב לנקות יחד עם שיפורים במצב של כימות יחסית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

זהירות: הימנע העור / קשר עין עם כל של חומרים כימיים המשמשים בניסוי זה. בחשיפה, ביסודיות לשטוף את האזור הפגוע במים ולפנות לעזרה רפואית מיידית.

1. Permethylation ו glycan הפקת

  1. הכנת טור
    1. השג כמה שיותר יחידות microfuge ספין טור כמו הדגימות להיות מנותחות. לשבור ולנתק את כמוסות צינור מאגר הפלסטיק. מקום מסנן מיני microfuge בצינור אחד המאגר. מניחים את עמודות ספין microfuge התאספו (המכיל את מסנני מיני) ב מתלה צינור microfuge.
    2. השג מלאי של נתרן הידרוקסידי (NaOH) חרוזים (20-40 רשת). העבר כמה NaOH לסירה במשקל קטן או, אם לחות גורמת להתנהל בכבדות, במכתש פורצלן חם כמו מניות העבודה של NaOH. הימנע משימוש גושים של חרוזי NaOH או כתוש / אבקת NaOH.
      זהירות: NaOH הוא רעלן חזק בסיס מאכל. סומק חשוף עור / עיניים עם מים במשך 15 דקות. Thoroughly לנקות את שולחן העבודה לאחר סיום הניסוי.
    3. באמצעות כף או מרית קטנה, להעביר חרוזי NaOH הממלאים עובדים למלא את מסנני מיני microfuge עם NaOH עד שפוע החיצוני הראשון (~ 5 מ"מ מתחת אפס המקום). הקש על מסנני microfuge מלא על-גבי ספסל לארוז / לעבות את החרוזים NaOH.
      הערה: במהלך הניסוי הזה, כדי למזער ספיחת מים מופרזת על ידי חרוזי NaOH היגרוסקופי, לשמור על רמת נוזלים הוסיפו (למשל, אצטוניטריל, sulfoxide דימתיל, אנליטי פתרון) מעל פני השטח של אריזת עמודת NaOH ולהגביל מגע ישיר עם אוויר.
    4. השג מלאי של אצטוניטריל (ACN). העברה ~ 350 μl ACN לכל מסנן מיני NaOH וגדוש microfuge. שמור את NaOH השקוע מתחת ACN ולהסיר בועות אוויר גדולות על ידי ערבוב עם קצה פיפטה טיפ-crimped ג'ל טעינה.
      זהירות: אצטוניטריל הוא מגרה דליק.
    5. צנטריפוגה טור
      1. מסדרים את עמודות microfuge סימטרי בתוך צנטריפוגות; להשתמש בצינור איזון במידת הצורך. הימנע שופך גרגרי NaOH בתוך צנטריפוגות. סגור את המכסה צנטריפוגות.
      2. צנטריפוגה עמודות (המכיל NaOH ו ACN) עבור ~ 15 שניות ב g × 2,400.
      3. עם השלמת צנטריפוגה, להסיר עמודות microfuge מתוך צנטריפוגה, וזורקים את ACN לתוך מיכל פסולת מסוכנת. שמור את הטור NaOH אריזה ללא פגע.
    6. הוסף את ~ 350 sulfoxide דימתיל μl (DMSO) לכל מסנן מיני NaOH וגדוש microfuge. שמור את NaOH שקוע מתחת DMSO והסר בועות אוויר גדולות עם קצה פיפטה. כפי שתואר קודם לכן, עמודות צנטריפוגות במשך ~ 15 שניות ב- 2400 × g, וזורקים את DMSO, תוך שמירה על NaOH אריזה ללא פגע.
      זהירות: DMSO היא mutagen עצבה והוא נספג בקלות דרך העור.
    7. חבר את כל המסננים מיני microfuge עם אטמי הכלולים מסנן ספיןקִיט. העבר ~ 350 μl DMSO לכל מסנן NaOH וגדוש microfuge מיני ולהשתמש קצה פיפטה 200 μl להסיר בועות אוויר בתוך אריזה NaOH כך DMSO מגיע כל האזורים בתוך אריזה NaOH אז. הימנע ריסוק או מוגזם מגרד את חרוזי NaOH; אבקת NaOH אינה רצויה. סיים שלב זה במהירות האפשרית.
  2. הכנת בקרת איכות פלזמה (קוו) לדוגמא (ו)
    הערה:     כדי להבטיח תוצאות עקביות על פני קבוצות ניסוי, שקלו להשתמש aliquot אחד לפחות של דגימה שנלקחה מאוסף נפח גדול, הומוגנית של החומר הביולוגי עניין להיות מנותח כל אצווה. לדוגמה, אם ניתוח הפלזמה בדם, השתמש aliquot (ים) של אוסף עיקר הפלזמה בדם כמו המדגם QC (ים) בכל אצווה. תהליך QC דגימות באותו אופן כמו דגימות ידועות.
    1. צנטריפוגה מדגם המניות של פלזמה QC עבור 4 דקות ב ~ 10,000 g ×. במהלך צנטריפוגה, כמה משקע בצפיפות גבוהה עשוי לחדור אל thבתחתית דואר וכמה משקע בצפיפות נמוך עלולות לצוף למעלה של הפלזמה. הימנע הן בעת ​​הסרת aliquot (ים) של פלזמה.
    2. המשך אל "1.3) הכנת דוגמאות" להלן. לאחר מכן, חזור לשלב זה לאחר צנטריפוגה פלזמה הושלמה.
    3. משיכת 9 μl של פלזמת QC centrifuged ולהעביר אותו אל מבחנת פוליפרופילן 1.5 מיליליטר שכותרתו כראוי מצוידת כובע צמד עצום (להלן המכונה "1.5 מיליליטר מבחנת פלסטיק"). הוסף 1 μl של מים ללא יונים לכל aliquot; אם תרצה בכך, להשתמש בזה כנשא התקן פנימי (ים).
    4. להוסיף 270 μl DMSO לשליטת פלזמה זו. וורטקס כדי להבטיח פירוק מוחלט.
  3. לדוגמא הכנה
    1. השג כמה מבחנות פלסטיק 1.5 מ"ל כמספר דגימות ביולוגיות (אנליטי).
    2. ההעברה 9 μl של כל דגימה ביולוגית (אנליטי) כדי המבחנה המקבילה 1.5 מיליליטר הפלסטיק שלה. העברת 1 μl של מים ללא יונים ו -27DMSO 0 μl על צינור אחד מדגם.
    3. במרץ לערבב (למשל, מערבולת ו / או עד פיפטה שוב ושוב ושוב) דגימות כדי להבטיח פירוק מוחלט ב DMSO.
      זהירות: בצע את השלבים הבאים בתוך במנדף. משמש את השלבים הבאים, iodomethane (אני CH 3), dichloromethane (CH 2 Cl 2, aka מתילן כלוריד), ו כלורופורם (CHCl 3, trichloromethane), הם נוזלים נדיפים המסוגל המסת סוגים מסוימים של פלסטיק (למשל, כפפות ניטריל) . הקפד להשתמש בכפפות ממס עמידות. בשל לחץ הצמיגות גבוה אדים הנמוך שלהם, ריאגנטים אלה יכולים לטפטף מתוך קצה פיפטה במהלך העברה. להקטין את האיבוד מגיב חשיפה פוטנציאלית ידי החזקת מניות הפתרון סמוך כלי המקבל.
    4. העבר בנפח כולל מספק של iodomethane לצינור קטן, נקי. כל דגימת אנליטי תדרוש 105 iodomethane μl. העברה ~ 500 dichloromethane μl לתוך anothאה צינור נקי. כדי למנוע סתימת מזרק, לשטוף את המזרק עם dichloromethane מיד לאחר העברת iodomethane.
      זהירות: Iodomethane הוא רגיש, הפכפך, רעלן חזק המסוגל לפגוע במערכת העצבים המרכזית או גרימת מוות אם נשאף או בליעה. Dichloromethane הוא קרצינוגן פוטנציאלי, mutagen רבייה, ומסוגל מגרה חזק של פגיעה כמה איברים או גרימת מוות.
    5. השתמש מזרק אנליטיים להוסיף iodomethane 105 μl מדגם אנליטי. צינורות אנליטי שווים מייד כדי למזער אידוי iodomethane. ביסודיות מערבולת, אם כל הדגימות צנטריפוגות הצורך, בקצרה, כדי לוודא ששום נוזל נשאר בכובע. כל שינוי צבע (למשל, עד חום, סגול, צהוב או) מסמן שפל iodomethane, ודבר זה עלול לסכן את תגובת permethylation הבאה.
    6. יש לשטוף את המזרק אנליטי המשמש להעברת iodomethane עם dichloromethane לפחות 3 פעמים. פעולה זו תמנע את זה הלוך ושובסתימה מ. השלך שטיפה זו, יחד עם iodomethane נוסף dichloromethane לתוך כלי פסולת מסוכן אורגני. מניחים מבחנות בשימוש לתוך מיכל פסולת מסוכנת.
    7. השג סט חדש של צינורות מאגר פלסטיק 2 מיליליטר. הסרה של Snap-כמוסות אם תרצה בכך.
    8. נתק את מסנני מיני microfuge. צנטריפוגה עמודות unplugged במשך 15 שניות ב- 2400 גרם ×, ולאחר מכן למחוק את צינורות המאגר יחד עם שפכי DMSO.
    9. חבר מחדש את עמודות ספין centrifuged, ומניח אותם בתוך צינורות המאגר החדשים. מספר כל עמודת ספין צינור המאגר המתאים עם אותו מספר המדגם. ודא כי מצת המסננים המיניים חזקים; דליפה פוטנציאלית יכולה להשפיע על השלב הבא. לצמצם את הזמן בין הסרת DMSO מטורי ספין והעברת הדגימות אנליטי על עמודות ספין.
    10. Permethylation
      1. כמותית להעביר כל פתרון מדגם שיתוף NaOH-חרוז מלא microfuge הספין המתאים לוlumn. השתמש קצה פיפטה 1,000-μl של שלב זה. בעקבות העברה, crimp ~ 2 מ"מ של סוף טיפ 200 μl ולהשאיר אותה בתכני הטור להשתמש בתור בוחש. חזור על הפעולה עבור כל הדגימות.
        הערה: צמיגות נמוכה של iodomethane יכול לגרום לאובדן מדגם כי הפתרון אנליטי יכול לטפטף מקצה פיפטה במהלך ההעברה. החזק את הצינור מדגם ואת ספין עמודה סמוך זה לזה ביד אחת, במהירות להעביר את הפתרון המדגם ביד השנייה.
      2. אפשר תגובת permethylation להמשיך במשך 11 דקות. מערבבים כל דגימה לפחות 4-5 פעמים במהלך תקופה זו. כדי להקל permethylation היעיל, אשר מתרחש על פני השטח של חרוזי NaOH, השתמש טיפי פיפטה טיפ-crimped ג'ל טעינה כמו stirrers לערבב את תוכן העמודה בעדינות. ערבוב אגרסיווי יכול לנקב את מסנן הספין, לכתוש ולהשעות חרוזי NaOH (אשר יכול להפחית את היעילות של מיצוי נוזלי עוקב נוזלי /), ו / או לגרום לאובדן מדגם (כמו sample ספוג גרגרי NaOH יכולים לפלוש מהעמודה).
      3. לקראת צעד החילוץ נוזלי / נוזל עוקב להכין כמות מספקת של 0.5 נתרן כלורי M פתרון (NaCl) חיץ פוספט 0.2 M נתרן (pH 7.0), כדי להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר. כל דגימה תדרוש סך של ~ 12 מיליליטר פתרון NaCl עבור כל שלושת המחזורים של מיצוי נוזלי / נוזל.
      4. עם השלמת תקופת permethylation 11 דקות, מיד עדיין בזהירות לנתק את העמודים ואת צנטריפוגה אותם במשך 15 שניות ב- 2400 גרם ×. מחק את המצתים.
    11. מייד להסיר עמודות ספין מתוך צנטריפוגה ולהכניס אותם לתוך קבוצה חדשה של צינורות מאגר ספין ריקים, עוזב את פתרון הזרימה דרך המכיל גליקנים טריים permethylated מאחור. אל תמחק שום דבר.
    12. בכל ההקדם האפשרי, להוסיף 300 אצטוניטריל μl (ACN) אל המסננים היבשים, ספין NaOH המלא. צנטריפוגה מסנן ספין במשך 30 שניות 9,600 גרם ×.
    13. Immediately ואילך, להעביר את הפתרון permethylation הראשי (כלומר, הפתרון כי הודגר עם חרוזים NaOH עבור 11 דקות ולאחר מכן סובב דרך המסנן ספין לתוך צינור צנטריפוגות לפני תוספת של 300 μl של ACN בשלב הקודם) כדי silanized 13 x 100 מ"מ צינורות זכוכית הבדיקה 42 המכיל 3.5 מ"ל של 0.2 M חיץ פוספט נתרן המכיל 0.5 M NaCl, pH 7.0 ומערבבים (מערבולת) מיד. הימנע העברת שאריות לבנות מוצקות במהלך שלב זה. בצע פעולה זו עבור כל דגימה לפני שתמשיך לשלב הבא.
    14. ללא דיחוי, העברה (לשלב) את הספין-דרך ACN בצינור אחד מאגר (עם) שאר המדגם נוזל בצינור זכוכית silanized שלו בהתאמה ומערבבת (מערבולת) מייד. שוב, למנוע העברה של כל משקע לבן מוצק במהלך שלב זה. שווי, שייק, מערבולת צינור הזכוכית. חזור על הפעולה עבור כל דגימה. מחק את עמודות NaOH ו טפטפות פסטר במיכלים פסולת המתאים.
  4. נוזלי / נוזל אקסטרהction וטיהור glycan
    1. בתוך מכסה המנוע קטר, להוסיף 1.2 מ"ל כלורופורם מדגם זה. מייד לאחר מכן, מכסים את צינורות זכוכית silanized נמרצות ערבב את התוכנה.
    2. גושי מתכות טרום חום כ 75 מעלות צלזיוס יריעת אידוי. השתמש בלוקים חימום עם בארות שיכול להכיל 13 מ"מ × 100 מ"מ צינורות זכוכית.
    3. השג סט חדש של טפטפות פסטר silanized, הלא silanized טפטפות פסטר, ומבחנות זכוכית silanized עם כובעים.
      זהירות: כלורופורם (CHCl 3) הוא חומר מגרה, mutagen, ופוטנציאל קרצינוגן מסוגל המחלחל דרך סוגים מסוימים של כפפות.
    4. צנטריפוגה בקצרה (~ 3,000 גרם ×) צינורות זכוכית המכיל מדגם להפריד את השכבות המימיות ואורגניות.
    5. השתמש פיפטה פסטר שאינם silanized לחלץ מספיק של השכבה העליונה מימית כך ~ 3 מ"מ של השכבה המימית נשאר מעל השכבה האורגנית התחתונה.
    6. להוסיף 3.5 מ"ל של 0.5 M NaCl פתרון חיץ פוספט 0.2 M נתרן (pH 7) על צינור אחד זכוכית, לערבב נמרצות, ו צנטריפוגות בקצרה (~ 3,000 גרם ×). כמו בשלב הקודם (1.4.3), להשתמש פיפטה פסטר שאינם silanized לחלץ את השכבה המימית.
    7. חזור על השלב הקודם (1.4.4), אבל להשאיר ~ 1 מ"ל של השכבה המימית.
    8. השתמש פיפטה פסטר silanized נקי להעביר את השכבה האורגנית כדי מבחנת מ"מ זכוכית נקיה שכותרתו כראוי silanized 13 × 100. הימנע זיהום מימייה ידי לחילוץ באופן הבא:
      1. אחוז בשני זכוכית מבחנות silanized קיימות וחדשים הסמוכים זה לזה ביד אחת. בעזרת היד השנייה, לחץ על נורת פיפטה ליצור בועות תוך שהוא מחדיר את הצינורית למטה דרך השכבה המימית.
      2. פעם בתוך השכבה האורגנית, להפסיק ליצור בועות, והחזק את נורת פיפטה היציבה לאפשר שכבות האורגניות מימיות לייצב ולהפריד שוב. לאחר מכן, שחרר את הנורה לאט לסגת כמה שיותר אורגנישכבת ג ככל האפשר ללא כל זיהום מימי.
      3. במהירות להעלות את קצה פיפטה דרך השכבה המימית, ולהתנגד הרפלקס הטבעי של שחרור הנורה מעט (שתוצאתה במשיכה כמה זיהום מימי) תוך העלאת פיפטה מתוך הצינור.
      4. במהירות להעביר את השכבה האורגנית-צמיגות נמוכה אל הצינור החדש הסמוך. כל זיהום מימי יהיה גלוי כמו טיפות נוזל קטנות על גבי השכבה האורגנית חילוץ צינורות הזכוכית החדשים. אם הזיהום מימי / NaCl גלוי, להסיר אותו עם טפטפת; צנטריפוגות במידת הצורך לרכז את טיפות מימיות לתוך אגל יחיד.
    9. כראוי להשליך צינורות זכוכית ישנים, טפטפות, ו מימית ותמיסות פסולות אורגניות. לשטוף ולמחזר כמוסות שפופרת זכוכית.
    10. לייבש את כל דגימות תחת זרם עדין וקבוע של חנקן סעפת אידוי שחומם מראש ב 75 מעלות צלזיוס במשך ~ 5 דקות בתוך במנדף. כדי להבטיח קירור באידוי במהלך כל STE יבש למטהps, זרימה עדינה מתמדת של חנקן חייב להדיר פני הנוזל ללא התזה או מכתים את הנוזל. הסר דגימות סעפת האידוי על ייבוש מלא של המדגם הסופי. כתמים לבנים בתחתית של צינורות זכוכית יבשים מצביעים חיץ / זיהום NaCl.
    11. השהה את ההליך כאן אם אין מספיק זמן שנותר היום כדי להשלים את שלב הידרוליזה TFA. זמנית (כלומר, לילה) לאחסן דגימות יבשות ב -20 ° C. כדי להמשיך את ההליך לאחר האחסון, להסיר את הדגימות מהמקפיא -20 ° C ולאפשר להם לחמם לחלוטין לפני הפתיחה והכלה.
    12. בעוד דגימות חמות, כהכנת חומצת trifluoroacetic (TFA) הידרוליזה (השלב ​​הבא), להגדיר את מעטפת החימום כך הטמפרטורה של תכולת המבחנה הנוזלת תגיע 121 מעלות צלזיוס. הכן את הפתרון TFA ממלאי TFA (ראה שלב 2.1 להלן).

2. trifluoroacetic חומצה (TFA) הידרוליזה

  1. הכינו כמות מספקת של פתרון 2.0 M TFA במים deionized. כל דגימת אנליטי תדרוש 325 μl של פתרון 2.0 M TFA. מרוכז TFA הוא 13.0 מ '
  2. להוסיף 325 μl של 2.0 M TFA מדגם אנליטי. כדי למנוע TFA אידוי ואובדן מדגם במהלך שלב הייבוש עקב (2.3 להלן), בחוזקה כובע צינור אחד מדגם מייד לאחר הוספת TFA. סמן את רמת הפתרון בכל צינורות זכוכית. וורטקס כל דגימה ביסודיות לפני השלב הבא.
  3. דגירה דוגמיות כתרים בחוזקה במשך שעה 2. בתוך גוש חימום מחומם מראש מתאים או בתנור כזה שהתכנים להגיע לטמפרטורה של C ° 121. אם באמצעות בלוק חימום במקום בתנור, דוגמיות מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע התעבות של TFA בראש הצינור וייבוש חלקי של שאריות מדגם בתחתית של התחתית. בדיקת מפלסי הפתרון המדגם לאחר 20-30 דקות.כדי להבטיח אידוי TFA מינימלי. במידת הצורך, להקטין את מכסות נוספות או להחליף כובעים להתאמה הדוקה.
  4. במהלך ההמתנה 2-hr, להגדיר אחרת סעפת אידוי כדי 75 מעלות צלזיוס למשך לשלב הבא (ראה 2.4 להלן).
  5. כאשר תקופת החימום 2-hr הושלמה, דגימות יבשות ב 75 מעלות צלזיוס מתחת זרם עדין של גז חנקן עבור ~ 15 דקות. אין להשאיר דגימות ללא השגחה במשך יותר מ -15 דקות. לעתים קרובות לבדוק דגימות, ולהפסיק חימום וייבוש פעם כל הדגימות יבשות.
  6. השהה את ההליך כאן אם אין מספיק זמן שנותר היום כדי להשלים את שלב ההפחתה. זמנית (כלומר, לילה) דגימות חנות ב -80 ° C. כדי להמשיך את ההליך לאחר האחסון, להסיר את הדגימות מהמקפיא -80 ° C, ולאפשר להם לחמם לחלוטין לפני הפתיחה והכלה.

הפחתת 3.

  1. בתוך במנדף, להכין כמות מספקת של borohydride נתרן 10 גר '/ ל (NaBH 4) פתרון 1 M ammoniהידרוקסיד אממ (NH 4 OH). כל דגימה תדרוש 475 μl של פתרון זה. בצע פתרון טרי עבור כל אצווה של דגימות. אמוניום הידרוקסיד מרוכז (27-30% w / w NH 3) הוא כ -14.5 מ '
    זהירות: borohydride נתרן (NaBH 4) הוא רעלן היגרוסקופי, מים-reactive עצבים חזק שתתפרסם-במגע עם אדי מים-דליק מאוד הגורמות לכוויות חמורות על שאיפה, בליעה, או עין / מגע עם העור.
    זהירות: הידרוקסיד אמוניום (NH 4 OH) היא מגרה מאכל רעלן מסוגל לגרום לכוויות קשות נזק לאיבר הפיך על שאיפה, בליעה, או עין / מגע עם העור. שטוף האזורים הנגועים במים במשך 30 דקות, ולמנוע את הקורבן מן שפשוף או גירוד באזורים הנגועים.
  2. מדגם זה, להוסיף 475 μl של 10 גר '/ ל NaBH 4 ב 1 M NH 4 OH. דגימות מערבבים היטב כדי לפזר כל שאריות. מבחנות Cap ולאפשר צמצום התגובה להמשיך במשך שעה 1.
  3. במהלך ההמתנה 1-hr, להגדיר את סעפת אידוי מחומם ל -75 מעלות צלזיוס. השתמש בלוק חימום עם בארות מתאימות צינורות הזכוכית (ראה 3.4 להלן).
  4. במקרים בהם תקופת התגובה 1-hr תושלם, להוסיף 63 מתנול μl (MeOH) מדגם זה. צעד זה והצעד הבא להסיר בורון שיורית כמו borate trimethyl - נוזל נדיף יחסית כי שחין 68 ° C.
  5. דגימות יבשות (ב הסעפת המחוממת מראש) על 75 מעלות צלזיוס תחת זרם עדין של גז חנקן עבור ~ 15 דקות. לעתים קרובות לבדוק דגימות ואל תשאיר אותם ללא השגחה. טיפות נוזל קטנות בתחתית צינורות הזכוכית לציין כי המדגם הוא עדיין לא יבש.
    הערה: כדי להבחין בועות אוויר טיפות נוזלות, הטה את המבחנה. רק טיפות נוזלות תעבורנה לאחר ההטיה, אבל ההפך הוא לא תמיד נכון: אם בועה לא זזה, הוא עדיין יכול להיות טיפה נוזלית (קטנה מאוד).
  6. לאחר samples יבש לחלוטין, להכין 9: פתרון 1 (V / V) של מתנול (MeOH) וחומצה אצטית (AcOH). להוסיף 125 μl של MeOH זו: פתרון AcOH מדגם זה.
  7. דגימות יבשות (ב סעפת מחוממת מראש) על 75 מעלות צלזיוס תחת זרם עדין של גז חנקן.
  8. כאשר דגימות יבשות לחלוטין, ואקום לייבש את הדגימות למשך 20 דקות בטמפרטורת חדר: דגימות מקום לגיגית ואקום פלסטיק (כמו אלה הנמכרים על ידי FoodSaver), לסגור את מכסת הוואקום, כוון את חוגת הוואקום "ואקום", לחבר את צינור ואקום, ולהדליק את הוואקום. כדי לפרק את הוואקום, להפוך את השלבים הבאים. המתן עד שהמערכת לשחרר לחלוטין לפני שתנסה לפתוח את המכסה ואקום.
  9. השהה את ההליך כאן אם אין מספיק זמן שנותר היום כדי להשלים את שלב ההפחתה. זמנית (כלומר, לילה) דגימות חנות ב -80 ° C. כדי להמשיך את ההליך לאחר האחסון, להסיר את הדגימות מהמקפיא -80 ° C, ולאפשר להם לחמם לחלוטין לפני uncappinז.
  10. בזמן ההמתנה דגימות ואקום-יבש (או חם, לאחר אחסון), להכין את ריאגנטים עבור לשלב הבא. השג מספר autosampler חרוטי התחתונה silanized בקבוקון (AS) (עם כובע) עבור כל דגימה. יתר על כן, מראש בחום גם רדוד-גם-בקבוקון בלוק חימום בלוק-שפופרת זכוכית עמוקה היטב כך את תוכן שפופרת הזכוכית יהיה להגיע לטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס.

4. acetylation (הנערכת במנדף)

  1. להוסיף 18 μl מים deionized מדגם זה. שווי וביסודיות מערבולת כל הצינורות כדי לפזר כל משקעים לחלוטין.
  2. הוסף 250 μl אצטית אנהידריד לכל שפופרת זכוכית. שווי, מערבולת ביסודיות, sonicate באמבט מים למשך 2 דקות כדי להבטיח פירוק מוחלט של כל שאריות משקעים.
  3. מכסה צינורות זכוכית עם רדיד אלומיניום, דגירה בטמפרטורה פנימית של 50 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  4. להוסיף 230 μl מרוכזים חומצה trifluoroacetic (TFA) מדגם זה. מיד כובעd לערבב דגימות. ואז, דגירת דגימות מכוסות נייר אלומיניום-למשך 10 דקות בטמפרטורה פנימית של 50 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר דגירה, להוסיף 1.8 מ"ל dichloromethane (CH 2 Cl 2) מדגם זה. כיסוי או ומערבבים היטב.
  6. להוסיף 2.0 מ"ל deionized מדגם זה. שווי דגימות ומערבבים היטב. צנטריפוגה מ -0 עד 3,000 גרם × להפריד בין השכבות. השתמש פיפטה פסטר שאינם silanized לבצע מיצוי נוזלי / נוזל כפי שמתואר שלב 1.4.6, הימנעות זיהום מים.
  7. חזור על חילוץ פעם נוסף, עבור סכום כולל של שתי עקירות. השתמש טפטפות silanized פסטר להעביר את השכבה האורגנית לתוך שכותרתו silanized AS בקבוקונים (שנערך מאובטח במעמד AS). מלא את בקבוקוני AS ממש מתחת אפס המקום.
  8. השתמש בלוק חימום מחומם מראש, רדוד היטב כדי דגימות יבשות (צלוחיות AS) במשך 15 דקות ב 40 מעלות צלזיוס מתחת גז חנקן. לא יותר מדי יבש. תוצרים סופיים ידועים כמו acetates alditol המפוגל חלקית (PMAAs).

5. גז כרומטוגרפיה - ספקטרומטריית מסה (GC-MS)

  1. מחדש כל דגימה ב 100 μl של אצטון ומערבבים היטב. השתמש autosampler להזריק 1 μl של כל דגימה במצב לפצל את האונייה מפוצלת במצב GC (שמור על 280 מעלות צלזיוס, המכיל תוסף קטן של צמר זכוכית silanized). השתמש ביחס פיצול של הליום השתמש 40. כגז המוביל במצב זרימה קבועה 0.8 מ"ל / דקה דרך עמודה GC 30 מטר DB-5ms עם מזהה 0.25 מ"מ ועובי הסרט 0.25 מיקרון.
  2. החזק את טמפרטורת התנור GC הראשונית לפי 165 מעלות צלזיוס במשך 0.5 דקות. בעקבות הזמן בהמתנה הראשונית, תוכנית בתנור להגביר את הטמפרטורה, עבור כל מחזור, מ 165 ° C עד 265 ° C בשיעור של 10 ° C / min (אשר לוקח 10 דקות) ולאחר מכן מיד כבש את הטמפרטורה 265 ° C ל -325 מעלות צלזיוס בשיעור של 30 ° C / min (אשר לוקחת 2 דקות) ולשמור הטמפרטורה ב 325 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. שעת הריצה הכוללת לדגימה היא 15.5 דקות.
  3. השתמש פרוPerly מכוון מכויל ספקטרומטר מסה להכפיף את הרכיבים המדגמים משחררים מעמודת GC אלקטרוני יינון (EI, 70 eV ב 250 מעלות צלזיוס). עבור מסת Analyzer TOF, לנתח קטעים מתוך m / z 40 עד m / z 800 עם שיעור סיכום דופק 0.1-שניות. הגדרת זמן שהיית ממס EI-נימה של 2.5 דקות.

6. ניתוח נתונים

  1. אם באמצעות נתח מונית TOF, סכם את הנפוץ ביותר ו / או יוני שבר אבחון לכל PMAA ידי החלת חלון המוני של 0.15 Da להשיג chromatogram יון חילוץ. יוני יעד עבור כל PMAA פורסמו במקום אחר, 33 אך השינויים הבאים נעשו: יוני t-Glc כיום 145.1 + 205.1; יוני 2-Man הם 161.1 + 189.1; יוני 3-גל הם 161.1 + 233.1, 6-גל יונים הם 161.1 + 189.1 + 233.1; 2,6-Man יון הוא 189.1; 3,6-Man יונים הם 189.1 + 233.1.
  2. השתמש QuanLynx או תוכנות אחרות כדי לשלב אזורי שיא אוטומטי עבור כל סכם חילוץ הכרומתוגרמה יון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הכרומתוגרמה שוטף יון (TIC) מראה permethylation המוצלח, הידרוליזה, הפחתה, ואת acetylation של דגימות פלזמת דם אדם ביחס למקרים בם שני צעדי permethylation קריטיים הוצאו להורג באופן שגוי מוצגת באיור 3.

מוחלטים תשואה של HexNAcs יחסית Hexoses:

N -acetylhexosamine (HexNAc) acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs) נוטים להיות בעלי תשואה נמוכה לעומת hexoses. 43 כדי להעריך את התשואה מוחלטת של יחסי HexNAcs כדי hexoses, שש דגימות של 10 מיקרוגרם של N -acetyllactosamine (א disaccharide Gal1-4GlcNAc) ב 10 μl של מים נותחו. אזורי שיא TIC עבור גלקטוז מסוף (t-גל) ו -4-GlcNAc שולבו. אחוז 4-GlcNAc ביחס לסכום הכולל של t-גל 4-GlcNAc היה 11.3 ± 0.7% (SEM). למרות תשואות HexNAc הן לשחזור (ראה להלן), את העובדה כי ערך זה הוא הרבה פחות מהערך התיאורטי של 0.5 עולה כי התשואה של HexNAcs נמוכה באופן מהותי מזה של hexoses. (התשואה התיאורטית HexNAc הוא 0.5 בגלל N -acetyllactosamine הוא 1:. Disaccharide 1 hexose-HexNAc)

שחזור תוך Interassay:

תוך שחזור interassay עבור כל צומת glycan תורמים לפחות 1% של hexose המוחלט או אות HexNAc ניתן בטבלה 1. נתונים אלה נרכשו על ידי 3 אנליסטים נפרדים ב -3 ימים נפרדים, תוך שימוש באותה המניות של פלזמת EDTA. נתוני יציבות autosampler תחת פרוטוקול אופטימיזציה זה עבור 18 הצמתים glycan בשכיחותו מפלסמה אנושית (כלומר, אלה עם> 1% של hexose מוחלט או אות HexNAc) ניתנים באיור 4.

ילדה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> הערות חשובות אחרות:

תוך אופטימיזציה של המתודולוגיה permethylation, מצאנו כי אין זה הכרחי כדי למנוע ספיחה של מים על ידי חרוזי NaOH לפני שיתחיל כביסה עם אצטוניטריל. גם מצאנו כי הנוכחות של כמות קטנה של מים במהלך השלב הסופי acetylation בשילוב עם תקופה קצרה של חימום עם אנהידריד אצטית ללא TFA עוזרת להקל תגובה מלאה. לבסוף, המתח הגבוה בפתרון זמן של טיסה (TOF) ספקטרומטריית מסה אין צורך לניתוח צומת glycan מוצלח: תוצאות ראשוניות מבוססים על הזרקה מקבילה של אותה הקבוצה של דגימות על GC-TOF-MS ו quadrupole שידור מסורתי מבוסס GC-MS פעל ניטור יון נבחר (SIM) מצב להפגין תוצאות דומות מבחינת hexose המנורמל סופית שכיחותם יחסית HexNAc.

er.within-page = "1"> איור 1
. סקירה באיור 1. מולקולרית של הליך ניתוח מתילציה glycan העולמי ב- O -linked glycan מודגם; אלה משתחררים במהלך תהליך permethylation, אשר הותאם מ גץ. 40 בעקבות permethylation הידרוליזה, מונוסכרידים מופחתים וקבוצות הידרוקסיל המתהווה "מסומנים" על ידי acetylation. הדפוס הייחודי של מתילציה acetylation בתוך acetates alditol המפוגל חלקי הסופי (PMAAs) תואם את "צומת glycan" הייחודית בפולימר ללא פגע המקורי ומספק את הבסיס המולקולרי פרדה וכימות ידי GC-MS. N -linked ו גליקנים glycolipid משתחררים כמו מונוסכרידים מסומן הצמדה במהלך הידרוליזה חומצית. מעובד מתוך ואח בורחס. 33 באישורו.> אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
סקירה מושגית איור 2. מושג אנליטי. Glycosyltransferase שהוגבר (למשל, GnT-V) גורמת לעלייה בכמות משקע monosaccharide glycan ספציפי, מקושר באופן ייחודי (א "צומת" 2,6 צמוד מנוז בדוגמא זו) "שפירושו, דרך הפעולה הבאה של glycosyltransferases האחר, יכול להוביל להיווצרות של תערובת של מבנים הטרוגנית כל-glycan בבית המספר נמוך עותק כל-כל מה שיכול להיות קשה לזהות ולכמת בצורה שיגרתית. אנליטית איגום יחד את "צומת glycan" מבין כל מבני glycan הסוטים מספקת מדידה פונדקאית ישירה יותר של פעילות GnT-V מכל glycan יחיד ללא פגע. המדידה סימולטני של N -, O -, ו ליפיד מקושרים "glyc צומת "ב biospecimens כולו כמתואר כאן (במקור במקום אחר 33) מייצג אמצעי רומן מושגית שבאמצעותו לזהות ולנטר מחלות glycan-רגשיות כגון סרטן. chromatograms יון חילוץ בפועל ממדגמים בפלזמת דם של 10 מיקרוליטר לראות. מספרים סמוכים שאריות monosaccharide במבני glycan לציין את המיקום שבו השאריות הגבוהות צמודות השאריות הנמוכות. אם לא תהיה עמדות הצמדה מצוינות ביאור הכרומתוגרמה השאריות הוא או במצב הסופנים או חינם בתמיסה (למשל, גלוקוז). כל השאריות . מלבד קישור חומצה sialic כלפי מטה דרך 1-עמדתם; קישורים חומצה sialic כלפי מטה באמצעות 2-עמדתה הפילוג הכרומתוגרמה מציין שינוי chromatograms יון חילוץ: m / z 117 129 שאריות hexose ו- m / z 116 + 158 עבור N - שאריות acetylhexosamine (HexNAc). מעובד מתוך בורחס et al. 33 באישורו.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. נציגי תוצאות. Chromatograms הנוכחי יון סה"כ (טיקים) לניתוח צומת glycan של המדגם הזהה פלזמת EDTA הדם האנושי שבה א) המדגם היה מעובד כראוי, ב) המשקע הלבן בפתרון permethylation כי היה סובב דרך NaOH טור בוצע לתוך התערובת עוקבת עבור חילוץ נוזלי / נוזל, ו- C) פתרון permethylation כי הייתה סובב דרך עמודת NaOH נוסף למאגר פוספט אבל לא מעורב באופן יסודי לפני תוספת של כלורופורם להפקת נוזלי / נוזל. מקרא מסופק באיור 2. אנא לחץ here כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. יציבות autosampler. יציבות autosampler מעל 48 שעות במשך 18 הצמתים glycan בשכיחותו מפלסמה אנושית. בגיל 22 שעות המדגם היה מיובש לגמרי מחדש בשנת 120 μl אצטון. כל מקבץ של נקודות נתונים מייצג ארבע זריקות רצופות של המדגם הזהה. קווים שחורים להקיף ± 15% משווי המנורמל הממוצע עבור כל צומת glycan. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1
טבלת 1. תוך שחזור interassay. ערכים מייצגים CV% של hexose המוחלט או HexN הכוללAc-מנורמל צומת glycan פרט. כל צומת glycan תורמים לפחות 1% של hexose המוחלט או אות HexNAc מפורטים. נתונים נרכשו על ידי 3 אנליסטים נפרדים ב -3 ימים נפרדים, באמצעות המניות הזהות של פלזמת EDTA. N = 6 דגימות לכל אצווה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה כמו גיליון אלקטרוני של Excel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ככלל, ההפקה המוצלחת של acetates alditol מפוגל חלקית (PMAAs) מ hexoses כרוך בקשיים פחות היא איתנה יותר מאשר ייצור מוצלח של -acetylhexosamine N (HexNAc) PMAAs. המנגנון המדויק מאחורי התופעה כפי שהיא משחקת בחוץ בכל שלב של הליך זה אינו ידוע, אך יש להתייחס הכימיה הייחודית של קבוצת N -acetyl (ולא קבוצת הידרוקסיל) כי היא ייחודית ביחס HexNAcs כדי hexoses. המנגנון מאחורי תופעה זו כפי שהיא מתייחסת הידרוליזה חומצית מוסבר במקום אחר. 43 בקיצור, הקיבולת עבור -methylacetamido N להיות בעלי מטען חשמלי חיובי במהלך הידרוליזה חומצית הופכת את הצמדת glycosidic העמידה בפני הידרוליזה חומצית. זה מסביר את התשואה הנמוכה יחסית HexNAc כדי hexose (11.3% ממסר HexNAc + hexose הכולל, ולא 50% בסך הכל) כמתואר לעיל לניתוח -acetyllactosamine N. יש לציין, זה יחסית lתשואת ower של HexNAcs לא הופכת אותם קשה לזהות biofluids מורכב רקמות, או למנוע זיהוי קליל של בלוטות glycan נגזרו גליקנים גדול ומורכב (למשל, 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -Man, ו 3,4-GlcNAc, איור 2). 33 בהתחשב באופן שבו XIC אזורי שיא של בלוטות glycan מנורמלים (שלב 6.3), כל עוד התשואה היחסית של כל HexNAc אדם נותר יחסית עקבי HexNAcs האחר ( אשר הוא עושה, ראה טבלה 1), מידע שימושי על הכמויות היחסיות של HexNAcs השונה בין מדגמים שונים ניתן להשיג. זה נכון גם לגבי hexoses גם כן. יתר על כן, אנו בעבר הראינו כי היחסים של hexoses כדי HexNAcs להציג התנהגות כמותית עקבית כמו גם 33 - תופעה מנוטרת כל זמן באמצעות שילוב של מדגם QC (ים) בכל אצווה.

האופן שבו permethylation מתבצע יש את ההשפעה הגדולה ביותר עלהתשואה שחזור הכוללת של HexNAc PMAAs. בפרט, בזהירות רבה יש לנקוט כדי להימנע מחשיפה לחלוטין של גליקנים permethylated אלקליין תנאים מימיים. שני שלבים עיקריים בהקשר זה הם 1) מה שמשאיר את כל המשקע הלבן הפתרונים-דרך הספין מאחורי (שלבי 1.3.13 ו 1.3.14), ו -2) מייד ערבוב פתרונות הספין לעבור ברגע מתווספים למאגר פוספט ( שלבי 1.3.13 ו 1.3.14). חיץ ולא תמיסת מלח פשוטה כלול בשלב זה ועל צעדי חילוץ הבאים נוזלי / נוזל למניעת alkalinization מכוונת של בתמיסה המימית. אנו חושדים כי בתנאי אלקליין קבוצת אצטיל של קבוצת 2-אמינו המפוגלת acetylated של HexNAcs עשויה לעבור הידרוליזה, וכתוצאה מכך אמינה משני קוטביות יותר מקטין את יעילות החילוץ הכוללת של glycan הקשורים לתוך כלורופורם.

התכונה הבולטת ביותר בקלות HexNAcs permethylated הצלחה היאעוצמת GlcNAc הצמודה 4 (4-GlcNAc) ביחס לשיא chromatographic לאלה של 6-גל, 3,6-Man, ואת עוצמת הבסיס של ברקע במהלך ואופים-אאוט עמודה האחרון (איור 3). כאשר השפע המוחלט של PMAA 4-GlcNAc הוא נמוך, יחסית השפע המנורמל שלה לכל HexNAcs האחר נוטה גם להיות נמוך, עם גדלה מקבילה (רוב ניכרת) של 3,4-GlcNAc.

כמה שינויים שנועדו לייעל חוסן התשואה assay הכוללת נעשו מאז הפרסום הראשוני שלנו בתיאור גישה האנליטית זה 33 אחד השינויים הללו היא הדרך שבה chromatograms יון החילוץ המשולב (XICs) מנורמל:. למען הפשטות, אנחנו עכשיו לחלק את שטח כל XIC hexose היחיד על ידי הסכום של כל האזורים XIC hexose; כמו כן, באזור של כל פרט HexNAc XIC מחולק בסכום של כל תחומי HexNAc XIC. כפי שניתן לראות בטבלה 1, הכוללת interassay / בין-אנליסט reproducibility עבור כל צומת glycan שתורמים> 1% של ממוצעי אות hexose או HexNAc שלהם 13% CV.

למיטב ידיעתנו, זהו הגלגול רק של glycomics מלמטה למעלה אמיתית שבו גליקנים המחולקות ראשונות למטה ואז ומרכיביהן נתחו לבנות דיוקן מדגם רחב כמותית של רכב glycan. כאן, במקום לשחרר האנזימטית מסורתית, תהליך permethylation הלא reductively מבטל (משחרר) O גליקנים -linked מהחלבונים שלהם, 40 בעוד N -linked גליקנים שפורסמו במהלך הידרוליזה חומצית. 33 כגישת משלים glycomics מלמעלה למטה המסורתי גישה, זה הוא מסוגל הבריכה כולל glycan ייחודי של עניין כגון "fucosylation הליבה", "6-sialylation", "שחצתה GlcNAc", ו "בטא 1-6 הסתעפות" לאותות אנליטית אחת (ראו, 4,6-GlcNAc , 6-גל, 3,4,6-Man ו-Man 2,6 צמתים 2 איור, respectively). בגישות מלמעלה למטה מסורתיות, תכונות כגון אלה כי בסופו של דבר התלוי על הפעילויות הייחודיות של glycosyltransferases מפתח אחד או שניים 33 מופצים בדרך כלל על פני עשרות גליקנים שלמים ולפעמים יכולות להיות קשה או בלתי אפשרי לפתור (למשל, 3-sialylation לעומת 6-sialylation) בשל הניוון של כמה המוני glycan ללא פגע. יתר על כן, הגישה מלמטה למעלה המוצג כאן הוכיחה הבטחה ראשונית הלא פולשני לאיתור סרטן הריאות. 33 מחקרים נוספים נערכים כדי לאמת את הממצאים הראשוניים הללו, כמו גם נוספות, עדיין תוצאות לא פורסמו הנוגעים לגילוי של צורות אחרות של הסרטן.

המגבלה הגדולה ביותר של הגישה המתוארת כאן היא שזה מוגבל מבחינת גבולותיה של זיהוי, אם היו לחול על גליקופרוטאינים טרום מבודדים. בהתבסס על ניתוחים פורסמו תקני glycan פרט ללא חלבון מוביל, גבולות כימות FOr פרט גליקנים להופיע לשקר בטווח מיקרוגרם הנמוך. אלה הם בהחלט לא LOQs נמוך במונחים אבסולוטיים, אך עובדה זו אינה משנה לעניין היקף שנועד במקור של assay-אשר לא תוכנן עבור ואין לו צורך להשיג LOQs נמוך (לפחות למטרות המתוארות כאן בפרסום הקודם שלנו 33). למעשה, מפלסמה אנושית / הסרום מכיל גליקופרוטאינים ב 10s של מגוון בעלי כוונות טובות ריכוז מ"ג / מ"ל כי לניתוח הפלזמה בדם / סרום אנחנו רק להזריק ~ 1/100 ה של נפח דגימה הסופי ולפצל 40 מתוך 41 חלקים כמות קטנה כי לבזבז בנמל מזרק GC. ללא תרגול זה, כמה מן הצמתים glycan יכול להרוות את גלאי. כמויות Picomole של גליקופרוטאינים שיכולים לייצר אותות glycan שלמים נאותים על ידי גישות מלמעלה למטה הקונבנציונלי MALDI-MS או LC-MS מבוססים לא ניתן לאתר באמצעות גישה זו. עידון נוסף על המתודולוגיה מתנהל לתקן מגבלה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide beads  367176 Sigma-Aldrich  20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 ml Spin column 69705 Pierce division of ThermoFisher Scientific  Includes  plugs and polyethylene frits 
GC-MS autosampler vial (silanized)* C4000-9 ThermoFisher Scientific Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 ml polypropylene test tubes 05-402-25 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
2 ml polypropylene test tubes 05-408-138 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D8418 Sigma-Aldrich  BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane  I8507 Sigma-Aldrich  Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile A955-4 ThermoFisher Scientific  Optima LC/MS
Microcentrifuge 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge ThermoFisher Scientific  24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)* 53283-800 VWR 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes 14-930-15D ThermoFisher Scientific  Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride  S7653 Sigma-Aldrich  >99.5% pure
Chloroform 4440-08 Macron Fine Chemicals 
Trifluoroacetic acid  299537 Sigma-Aldrich  99% purified by redistillation for protein sequencing 
Sodium borohydride 71321 Fluka Analytical  99%
Ammonium hydroxide solution  320145 Sigma-Aldrich  NH3 content: 28.0-30.0%
Methanol AH230-4 Honeywell Burdick & Jackson HPLC grade
Acetic acid  320099 Sigma-Aldrich  99.70%
Plastic vacuum desiccator  Any model of adequate size FoodSaver
Acetic anhydride  539996 Sigma-Aldrich  99.50%
Dichloromethane  D143SK-4 ThermoFisher Scientific  Stabilized HPLC grade
Acetone  9006-03 J.T.Baker Baker Analyzed 
Heated evaporation manifold (main unit) pi18823 ThermoFisher Scientific  Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) pi18826 ThermoFisher Scientific  ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold pi18816 ThermoFisher Scientific  Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep)
Gas chromatograph Model A7890 Agilent  Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer  GCT Premier (Time-of-Flight) Waters 
Split-mode liner (deactivated / silanized) 5183-4647 Agilent Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column 122-5532 Agilent 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane 95541 Sigma-Aldrich 
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) EW-06536-30 Cole-Parmer 12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
  2. Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans (2009).
  3. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  4. Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
  5. Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
  6. Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
  7. An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
  8. Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
  9. Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
  10. Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
  11. Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
  12. Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
  13. Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
  14. Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
  15. Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
  16. Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
  17. Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
  18. Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
  19. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
  20. Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
  21. Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
  22. Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
  23. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  24. Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
  25. Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
  26. Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
  27. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
  28. Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
  29. Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
  30. Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
  31. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  32. Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
  33. Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
  34. Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
  35. Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
  36. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
  37. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  38. Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
  39. Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
  40. Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
  41. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
  42. Seed, B. Silanizing glassware. Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).
  43. Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).

Tags

כימיה 111 גליון glycobiology גליקנים glycosyltransferase סרטן permethylation ספקטרומטריית מסה (MS) גז כרומטוגרפיה (GC) גליקופרוטאינים,
ניתוח צומת glycan: גישה מלמטה למעלה כדי glycomics
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y.,… More

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y., Ferdosi, S., Borges, C. R. Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics. J. Vis. Exp. (111), e53961, doi:10.3791/53961 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter