Introduction
Los glicolípidos, glicoproteínas, proteoglicanos, y glicosaminoglicanos constituyen las cuatro clases principales de carbohidratos complejos y heterogéneos conocidos colectivamente como glicanos. Como componentes ubicuas e integrales de la membrana plasmática, glycocalyx, y la matriz extracelular y los líquidos, los glicanos participan en diversos procesos tales bioquímicos como la endocitosis, el tráfico intracelular, la motilidad celular, la transducción de señales, reconocimiento molecular, la activación del receptor, la adhesión celular, la interacción huésped-patógeno , comunicación, inmunovigilancia, y la iniciación respuesta inmune intercelular. 1 presente en casi todos los ámbitos de la vida, las enzimas conocidas como glicosiltransferasas que se acumulan polímeros de glicano actuar en conjunto con glucósido hidrolasas (también conocidos como glicosidasas, que se descomponen glicanos) para construir, remodelar, y finalmente producir polímeros finalizado glicanos 2. Aunque cada glicosiltransferasa puede operar en diferentes glicoconjugados, una glicosiltransferasageneralmente forja una de ligamiento y de anómero específico de enlace glicosídico mediante la transferencia de la fracción de monosacáridos de un determinado nucleótido activado azúcar donante (por ejemplo, GDP-fucosa) a una determinada categoría de aceptores nucleófilos (por ejemplo, un lípido, polipéptido, ácido nucleico, o en crecimiento oligosacárido). Se ha estimado que más del 50% de proteínas (especialmente proteínas de membrana y de secreción) son después de la traducción modificado por glicosilación 3 cálculos combinatorios rudimentarios proporcionar una apreciación de la variabilidad considerable, versatilidad y especificidad concedido a glicoproteínas de glicosilación.; por ejemplo, si un sustrato polipéptido tiene sólo 10 sitios de glicosilación y cada sitio se puede formar un enlace glicosídico con 1 de extremos reductores solamente 3 de monosacáridos diferentes, entonces, teóricamente, la glicoproteína final puede asumir 3 10 = 59.049 identidades distintas. En glicoproteínas, enlaces glicosídicos forman comúnmente con la cadena lateral de nitrógeno oresiduos f asparagina en la secuencia Asn-X-Ser / Thr (X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina) para producir N -glycans 2 y de la cadena lateral hidroxilos de residuos de serina y treonina para dar O -glycans 4. La composición de glicoma de una célula (es decir, su complemento de los productos de glicosilación) es único y limitado, ya que, con pocas excepciones, las glicosiltransferasas exhiben estricta donante, aceptor, y la especificidad de ligamiento. 5 glicoproteínas plasma sanguíneo importantes y abundantes sufren glicosilación aberrante como consecuencia de aguas abajo de expresión de glicosiltransferasa anormal y la actividad debido a muchas condiciones patológicas, especialmente cáncer y enfermedades inflamatorias. 6-24
Principalmente debido a factores epigenéticos, la glicoma es significativamente más diverso, dinámico y complejo que el proteoma y transcriptome 25,26. Mientras que aproximadamente 1% del genoma de mamíferos codifica la formación, modificación, ymontaje de glicanos, 27 procede de glicosilación de una manera-un marcado contraste impulsado la no-plantilla para la biosíntesis del polipéptido y ácido nucleico. La interacción entre la cantidad relativa y la actividad de las enzimas de glicosilación y los factores ambientales tales como la disponibilidad de nutrientes y precursor en última instancia, determina la naturaleza, la velocidad y grado de glicosilación. 5,28 embriogénesis (por ejemplo, la determinación y diferenciación), la activación celular y la progresión a través la expresión del gen influencia del ciclo celular (es decir, transcripción y traducción) y alterar la identidad y cantidad de glicosiltransferasas disponibles, cuya actividad es el determinante aguas arriba inmediata de perfil de glicano de la célula. Debido a que (algunos de) la proliferativa, adhesivo, y las propiedades invasivas de las células cancerosas se parecen a los de las células embriogénicas ordinarias, cambios específicos en las rutas biosintéticas de glicano (por ejemplo, la acumulación de precursor, la expresión desregulada, aberranmodificación t, truncamiento estructural, o una novela formación) sirven biomarcadores de cáncer como universales que indican diversas etapas de la formación del tumor, progresión, migración y la invasión 29 Aunque la glicosilación es muy compleja, evidentemente, sólo unas pocas alteraciones en la glicosilación pueden permitir la carcinogénesis y la metástasis.; Al parecer, algunos productos de glicosilación "aberrantes" de hecho se benefician células cancerosas por lo que les permite evitar el reconocimiento inmune y sobrevivir a las exigencias de la migración en ambientes inhóspitos intravasculares y metastásicos. 28,30,31 Como era de esperar, los experimentos han revelado que la interrupción o la prevención de los patrones de alteración la expresión del gen y la formación de glicano aberrante puede detener la tumorigénesis. 29 no obstante, los glicanos aberrantes detectados en una muestra de biofluido (por ejemplo, orina, saliva, y el plasma sanguíneo o suero) pueden no ser indicadores directos de cáncer (u otra enfermedad), pero en lugar de aguas abajo resultados de sutil pero significativacambios en el sistema inmune o ramificaciones cuantificables de una condición perniciosa en un órgano impredecible. 32
A pesar de que proporcionan información acerca de la glicoma universales, muchas técnicas basadas en glicómica de interacción molecular (por ejemplo, lectina arrays de anticuerpos y / metabólica / marcaje covalente) dependerá de la detección de estructuras de glicano enteros y no proporcionan información estructural detallada sobre glicanos individuales. En marcado contraste, la espectrometría de masas (MS) puede ayudar a identificar y cuantificar las estructuras de glicano individuales y revelar información estructural como los sitios de unión a núcleos de polipéptidos. expresión o actividad de sólo una glicosiltransferasa Desregulado pueden iniciar una cascada de eventos moleculares perjudiciales en múltiples vías de glicosilación. Debido a que cada glicosiltransferasa puede operar en más de un sustrato glicoconjugado ya través de diferentes polímeros de glicanos en crecimiento, cascadas biosintéticas desreguladas dió desproporcionalmente mayores cantidades de un solo producto de glicano, sino varias clases heterogéneas de glicanos aberrantes en los fluidos intra o extracelulares. 33 Sin embargo, tales glicanos aberrantes únicos a veces se consideran poco práctico como biomarcadores para el cáncer u otras patologías de glicano-afectivo, ya que, en comparación con la gran piscina de glicanos bien regulada, estos glicanos aberrantes representan una fracción muy pequeña que a menudo pueden permanecer indetectable incluso por tales técnicas altamente sensibles como la espectrometría de masas. Por ejemplo, en los fluidos corporales intra y extracelulares, el amplio espectro de proteínas de concentración (que abarca ocho órdenes de magnitud) puede impedir la detección de glicoproteínas escasos que están enmascarados por las especies más abundantes. 32 Por otra parte, determinar la actividad de glicosiltransferasa sigue habiendo una considerable práctica y el desafío teórico porque muchas glicosiltransferasas están ausentes en fluidos biológicos o clínicos vuelven inactivas ex vivo. A pesar de la dificultad del consistently detección y cuantificación de cantidades diminutas de ultra-glicanos enteros únicos, los profesionales de la espectrometría de masas han dado grandes pasos hacia el empleo de glucanos intactos como marcadores clínicos. Hemos desarrollado recientemente un enfoque complementario para el análisis de glucanos intactos que, empleando GC-MS, facilita la detección de todos los constituyente punto de ramificación y monosacáridos-vinculación específica ( "nodos de glicano") que juntos confieren singularidad a cada glicano y en muchos casos sirven directamente como sustitutos moleculares que cuantifican la actividad relativa de la glicosiltransferasa (s) culpable.
Desde su primera informó de aplicación directa en el análisis de glicanos en 1958, cromatografía de gases (GC) ha demostrado ser una técnica poderosa para analizar mono- y disacáridos per-metilado, 34 determinar su anomericity y configuración absoluta, y separarlos para el análisis de espectrometría de masas posterior. 35 entre 1984 y 2007, y sus colegas Ciucanuintrodujo y refinó una técnica permetilación glicanos en fase sólida que emplea hidróxido de sodio y yodometano, seguido de extracción líquido / líquido de glicanos permetilados con agua y. cloroformo 35,36 Entre 2005 y 2008, Kang y compañeros de trabajo integrados un giro de ahorro de tiempo -column enfoque en el paso permetilación 37,38. En 2008, el grupo de investigación Goetz ideó una fase sólida cuantitativa permetilación método de glicano de perfiles utilizando láser de desorción-ionización asistida por matriz (MALDI) espectrometría de masas para comparar y diferenciar potencialmente invasivas y no las células de cáncer de mama no invasiva; 39 entonces, en 2009, el equipo de técnicas de liberación químicos Goetz enzimática y combinado para escindir O -glycans de glicoproteínas intactas en un esquema permetilación en fase sólida altamente alcalina 40 Aunque el procedimiento Goetz facilitó permetilación simultánea y las emisiones químicas. de -glycans O, se aplica sólo a pre-aislado glicoproteínas. Hemos modificado esta técnica en 2013 y lo adaptó para fluidos biológicos no fraccionadas enteros y muestras de tejido homogeneizadas mediante la incorporación de ácido trifluoroacético (TFA) hidrólisis, reducción y acetilación pasos. 33 Estos pasos adicionales también la liberación de los glicanos de glicolípidos y N -vinculada glicanos de glicoproteínas y convertir ellos en acetatos parcialmente metilados de alditol (PMAAs, Figura 1), cuyos patrones de metilación y acetilación distintivo facilitar el análisis por GC-MS y únicamente caracterizar los nodos de glicano constituyentes en el original polímero glicano intactas 41 (Figura 2). 33 en última instancia, este procedimiento produce un retrato compuesto de todos los glicanos en un biofluido complejo basado en la cuantificación directa, en relación de características únicas, tales como glicanos "fucosilación núcleo", "6-sialilación", "bisectriz GlcNAc", y "beta 1-6 de ramificación" - cada una derivada de una sola chromatograp GC-MSpico de HIC. Este artículo presenta una mayor optimización de la permetilación, acetilación, el aislamiento, y las etapas de limpieza, junto con mejoras en el modo de cuantificación relativa.
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Protocol
Precaución: Evitar el contacto / ojo piel con cualquiera de los reactivos utilizados en este experimento. Tras la exposición, lave bien el área afectada con agua y acudir al médico inmediatamente.
1. permetilación y glicanos Extracción
- Preparación de la columna
- Obtener el máximo de unidades de columna de microcentrífuga giro como las muestras a analizar. Romper y separar las tapas de los tubos de depósito de plástico. Colocar un filtro de microcentrífuga de mini en cada tubo de depósito. Colocar las columnas de centrifugación de microcentrífuga ensamblados (que contienen los mini filtros) en un bastidor de tubo de microcentrífuga.
- Obtener un stock de hidróxido de sodio (NaOH) perlas (malla 20-40). Transferir parte de NaOH a un pequeño recipiente de pesar o, si la humedad está causando aglutinación, un mortero de porcelana caliente como el material de trabajo de NaOH. Evitar el uso de macizos de perlas de NaOH NaOH o triturado / polvo.
Precaución: NaOH es una potente toxina y la base corrosivo. Enjuagar expuestas de la piel / ojos con agua durante 15 minutos. ThorougHly limpiar la mesa de trabajo después de completar el experimento. - Usando una cuchara pequeña o una espátula, transferir perlas de NaOH de la solución de trabajo para llenar los mini filtros de microcentrífuga con NaOH hasta el primer bisel exterior (~ 5 mm por debajo del borde). Toque en los filtros de microcentrífuga cubrir en el banco de trabajo para empacar / condensar los granos de NaOH.
Nota: En este experimento, para minimizar la adsorción de agua excesiva por perlas de NaOH higroscópicos, mantener el nivel de cualquier líquido añadido (por ejemplo, acetonitrilo, sulfóxido de dimetilo, la solución de analito) por encima de la superficie del relleno de la columna de NaOH y limitar el contacto directo con el aire. - Obtener un stock de acetonitrilo (ACN). Transferencia ~ 350 l de ACN para cada mini filtro de microcentrífuga repleto de NaOH. Mantenga el NaOH sumergido bajo ACN y eliminar grandes burbujas de aire mediante agitación con una punta de pipeta de punta de carga de gel rizadas.
Precaución: El acetonitrilo es un irritante inflamable. - La centrifugación en columna
- Organizar las columnas de microcentrífuga simétricamente dentro de una centrífuga; utilizar un tubo de equilibrio si es necesario. No permita que caiga gránulos de NaOH dentro de la centrifugadora. Cierre la tapa de la centrífuga.
- Centrifugar las columnas (que contiene NaOH y ACN) durante ~ 15 segundos a 2.400 x g.
- Al término de la centrifugación, eliminar columnas de microcentrífuga de la centrífuga, y desechar la ACN en un contenedor de desechos peligrosos. Mantener la columna de NaOH embalaje intacto.
- Añadir ~ 350 l de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada mini filtro de microcentrífuga repleto de NaOH. Mantenga el NaOH sumergido bajo DMSO y eliminar las burbujas de aire de gran tamaño con una punta de pipeta. Como se ha descrito anteriormente, las columnas de centrifugación durante ~ 15 segundos a 2400 × g, y desechar el DMSO mientras se mantiene el NaOH embalaje intacto.
Precaución: El DMSO es un mutágeno e irritante y es fácilmente absorbido por la piel. - Enchufe todos los mini filtros de microcentrífuga con los tapones incluidos en el filtro giratorioequipo. Transferir ~ 350 l de DMSO a cada mini filtro de microcentrífuga repleto de NaOH y el uso de una punta de pipeta de 200 l para eliminar las burbujas de aire en el embalaje de NaOH por lo que el DMSO llega a todas las regiones dentro de embalaje a continuación NaOH. Evitar el aplastamiento o excesivamente raspado de las perlas de NaOH; NaOH en polvo no es deseable. Finalizar este paso lo más rápidamente posible.
- Preparación de Control de Calidad de plasma (QC) muestra (s)
Nota: Para asegurar resultados consistentes a través de los lotes experimentales, considerar el uso de al menos una alícuota de una muestra tomada de una colección mayor grande, homogénea del material biológico de interés para ser analizadas en cada lote. Por ejemplo, si el análisis de plasma de la sangre, utilice alícuota (s) de una colección mayor de plasma sanguíneo como la muestra de control de calidad (s) en cada lote. muestras de procesos de control de calidad en la misma manera que las muestras desconocidas.- Centrífuga una muestra social de plasma de control de calidad durante 4 minutos a ~ 10.000 x g. Durante la centrifugación, algo de precipitado de alta densidad puede conformarse a the inferior y algo de precipitado de baja densidad pueden flotar a la parte superior del plasma. Evitar tanto cuando la eliminación de alícuota (s) de plasma.
- Vaya a "1.3) Preparación de la muestra" más adelante. A continuación, vuelva a este paso después de la centrifugación de plasma se ha completado.
- Retirar 9 l de plasma de control de calidad se centrifugó y la transfiere a un tubo de ensayo 1,5 ml de polipropileno marcada apropiadamente equipado con una tapa a presión de cierre (de aquí en adelante como "tubo de ensayo de plástico de 1,5 ml"). Añadir 1 l de agua desionizada a cada alícuota; si se desea, utilizar esto como un soporte para el estándar (s) interna.
- Añadir DMSO 270 l a este control de plasma. Vortex para asegurar la disolución completa.
- Preparación de la muestra
- Obtener el máximo de tubos de ensayo de plástico de 1,5 ml como el número de muestras biológicas (analito).
- Transferencia de 9 l de cada muestra biológica (analito) a su correspondiente tubo de ensayo de plástico de 1,5 ml. Transferir 1 l de agua desionizada y 270 l DMSO a cada tubo de muestra.
- Mezclar vigorosamente (por ejemplo, mezclar y / o repetidamente la pipeta hacia arriba y abajo) las muestras para asegurar la completa disolución en DMSO.
Precaución: Realice los siguientes pasos dentro de una campana de humos. Utilizan en los pasos siguientes, yodometano (CH3 I), diclorometano (CH 2 Cl 2, también conocido como cloruro de metileno) y cloroformo (CHCl 3, triclorometano), son líquidos volátiles capaces de disolver ciertos tipos de plástico (por ejemplo, guantes de nitrilo) . Asegúrese de utilizar guantes resistentes a los disolventes. Debido a su baja viscosidad y alta presión de vapor, estos reactivos pueden gotear desde una punta de pipeta durante la transferencia. Minimizar la pérdida de reactivos y la exposición potencial a través de la celebración de la solución de reserva adyacente al recipiente de recepción. - Añadir un volumen total suficiente de yodometano a un tubo pequeño y limpio. Cada muestra de analito requerirá 105 yodometano l. Transferencia ~ 500 l diclorometano en another tubo limpio. Para evitar la obstrucción de la jeringa, enjuagar la jeringa con diclorometano inmediatamente después de la transferencia de yodometano.
Precaución: yodometano es fotosensible, volátil, y potente toxina capaz de dañar el sistema nervioso central o causar la muerte si se inhala o se ingiere. El diclorometano es un carcinógeno potencial, mutágeno reproductiva y potente irritante capaz de dañar varios órganos o causar la muerte. - Utilice una jeringa analítica para añadir yodometano 105 l de cada muestra de analito. tubos de analitos tapa inmediatamente para minimizar la evaporación yodometano. A fondo vórtice y, si es necesario, centrifugar brevemente todas las muestras para asegurar que el líquido no permanece en la tapa. Cualquier cambio de color (por ejemplo, de color marrón, morado o amarillo) indica la degradación yodometano, lo que puede poner en peligro la siguiente reacción permetilación.
- Enjuague la jeringa analítico utilizado para transferir yodometano con diclorometano al menos 3 veces. Esto evitará que from obstrucción. Desechar este enjuague, junto con yodometano extra y diclorometano en un recipiente de residuos orgánicos peligrosos. Coloque los tubos de ensayo utilizados en un contenedor de desechos peligrosos.
- Obtener un nuevo conjunto de tubos de depósito de plástico de 2 ml. Quitar complemento tapas si se desea.
- Desenchufe los filtros de microcentrífuga de mini. Centrifugar las columnas desenchufado de 15 segundos a 2400 × g, y luego desechar los tubos de depósito junto con el efluente de DMSO.
- Vuelva a conectar las columnas de centrifugación se centrifuga, y colocarlos dentro de los nuevos tubos de depósito. Número cada columna de centrifugación y de su tubo de depósito correspondiente con el mismo número de la muestra. Asegúrese de que los mini tacos de filtro están apretados; la posibilidad de fugas puede afectar el siguiente paso. Reducir al mínimo el tiempo entre la eliminación de DMSO de las columnas de centrifugación y la transferencia de las muestras de analito en las columnas de centrifugación.
- permetilación
- Transferir cuantitativamente cada solución de muestra a su correspondiente co microfuga giro lleno de NaOH-granolumna. Utilice una punta de pipeta de 1.000 l para este paso. Después de la transferencia, engarce ~ 2 mm del extremo de una punta de 200 l y dejarlo en el contenido de las columnas para utilizar como un agitador. Repita este procedimiento para todas las muestras.
Nota: La baja viscosidad de yodometano puede causar la pérdida de muestra porque la solución analito puede gotear de la punta de la pipeta durante la transferencia. Mantenga el tubo de muestra y la columna de centrifugación adyacentes entre sí con una mano, y transferir rápidamente la solución de muestra con la otra mano. - Permitir que la reacción permetilación proceder durante 11 minutos. Agitar cada muestra por lo menos 4-5 veces durante este período. Para facilitar permetilación eficiente, que se produce en la superficie de perlas de NaOH, utilizar puntas de carga de gel con punta de pipeta rizadas como agitadores para mezclar suavemente el contenido de las columnas. mezclado agresivo puede perforar el filtro giratorio, pulverizar y suspender granos de NaOH (que puede reducir la eficacia de la posterior extracción líquido / líquido), y / o causar la pérdida de la muestra (como la sample empapada de gránulos de NaOH pueden desbordarse de la columna).
- En la preparación para la etapa de extracción líquido / líquido posterior, preparar una cantidad suficiente de solución 0,5 M de cloruro de sodio (NaCl) en un tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7,0), que se almacena a temperatura ambiente. Cada muestra requerirá un total de ~ 12 ml de solución de NaCl para los tres ciclos de extracción líquido / líquido.
- Al finalizar el período de permetilación 11-min, inmediatamente aún desenchufe cuidadosamente las columnas y centrifugar durante 15 segundos a 2.400 x g. Desechar los tapones.
- Transferir cuantitativamente cada solución de muestra a su correspondiente co microfuga giro lleno de NaOH-granolumna. Utilice una punta de pipeta de 1.000 l para este paso. Después de la transferencia, engarce ~ 2 mm del extremo de una punta de 200 l y dejarlo en el contenido de las columnas para utilizar como un agitador. Repita este procedimiento para todas las muestras.
- Retire inmediatamente columnas de giro de la centrífuga y colocarlos en un nuevo conjunto de tubos de depósito giro vacías, dejando la solución de flujo continuo que contiene glicanos recién permetilados atrás. No deseche nada.
- Tan pronto como sea posible, añadir 300 l de acetonitrilo (ACN) para los filtros de espín, llenas de NaOH seco. Centrifugar los filtros de giro durante 30 segundos a 9.600 x g.
- immediately a partir de entonces, transferir la solución principal permetilación (es decir, la solución que se incubó con las perlas de NaOH durante 11 min y después se hizo girar a través del filtro de centrifugado en un tubo de centrífuga antes de la adición de 300 l de ACN en el paso anterior) para silanizada 13 x tubos de ensayo de vidrio de 100 mm que contiene 42 3,5 ml de tampón 0,2 M de fosfato de sodio que contiene 0,5 M NaCl, pH 7,0 y mezclar (vórtice) inmediatamente. Evitar la transferencia de cualquier residuo blanco sólido durante este paso. Hacer esto para cada muestra antes de proceder al siguiente paso.
- Sin demora, la transferencia (combinar) la escisión a través de ACN en cada tubo de depósito a (con) el resto de la muestra de líquido en su respectivo tubo de vidrio silanizado y mezclar (vórtice) inmediatamente. Una vez más, evitar la transferencia de cualquier residuo sólido de color blanco durante este paso. Gorra, batido, y agitar el tubo de vidrio. Repita este procedimiento para cada muestra. Desechar las columnas de NaOH y pipetas Pasteur de contenedores de residuos adecuados.
- Líquido / líquido extracción y glicanos Purificación
- Dentro de la campana de extracción, añadir 1,2 ml de cloroformo a cada muestra. Inmediatamente después, la tapa los tubos de vidrio silanizados y mezclar vigorosamente el contenido.
- De precalentamiento bloques de metal a aproximadamente 75 ° C en un colector de evaporación. Utilice bloques de calentamiento con pozos que pueden acomodar los tubos de 13 mm × 100 mm de vidrio.
- Obtener un nuevo conjunto de pipetas Pasteur silanized, pipetas Pasteur no silanized, y tubos de ensayo de vidrio con tapas silanized.
Precaución: cloroformo (CHCl3) es un irritante, mutágeno y carcinógeno potencial capaz de permear a través de algunos tipos de guantes. - centrifugar brevemente (~ 3.000 × g) tubos de vidrio que contiene la muestra para separar las capas acuosa y orgánica.
- Utilizar una pipeta Pasteur no silanizada para extraer suficiente de la capa acuosa superior de tal manera que ~ 3 mm de la capa acuosa se mantiene por encima de la capa orgánica inferior.
- Añadir 3,5 ml de la M Na 0,5solución de Cl en un tampón fosfato de sodio 0,2 M (pH 7) a cada tubo de vidrio, mezclar vigorosamente, y se centrifuga brevemente (~ 3.000 × g). Como en el paso anterior (1.4.3), utilizar una pipeta Pasteur no silanizada para extraer la capa acuosa.
- Repetir la etapa anterior (1.4.4), pero deje ~ 1 ml de la capa acuosa.
- Utilizar una pipeta Pasteur silanizada limpia para transferir la capa orgánica a un tubo de ensayo de vidrio silanizada mm limpio y debidamente etiquetados 13 × 100. Evitar la contaminación acuosa mediante la extracción de la siguiente forma:
- Mantenga ambos los tubos de ensayo de vidrio silanizado actuales y nuevos adyacentes entre sí en una mano. Con la otra mano, oprima el bulbo de pipeta para crear burbujas mientras que la inserción de la pipeta a través de la capa acuosa.
- Una vez dentro de la capa orgánica, dejar de crear burbujas, y mantenga el bulbo de la pipeta constante para permitir que las capas orgánica y acuosa para estabilizar y se vuelven a separar. A continuación, suelte lentamente el bulbo de retirar la mayor cantidad de organicapa c como sea posible sin ninguna contaminación acuosa.
- elevar rápidamente la punta de la pipeta a través de la capa acuosa, y resistir el reflejo natural de liberar ligeramente la bombilla (que resulta en la retirada de algo de contaminación acuoso) mientras que aumenta la pipeta fuera del tubo.
- Rápida transferencia de la capa orgánica de baja viscosidad al nuevo tubo adyacente. Cualquier contaminación acuosa será visible como pequeñas gotas de líquido en la parte superior de la capa orgánica extraída de los nuevos tubos de vidrio. Si la contaminación acuosa / NaCl es visible, eliminarlo con una pipeta; centrifugar si es necesario para poner en común las gotitas acuosas en una sola gota.
- Deseche adecuadamente los tubos viejos de vidrio, pipetas y acuosa y soluciones de residuos orgánicos. Lavar y reciclar los tapones de los tubos de vidrio.
- Seque todas las muestras bajo una corriente suave y constante de nitrógeno en un colector de evaporación precalentado a 75 ° C durante ~ 5 minutos dentro de una campana de humos. Para garantizar la refrigeración por evaporación durante todo ste secamientops, un flujo suave y constante de nitrógeno debe perturbar la superficie del líquido sin salpicaduras o salpicaduras del líquido. Extraer muestras del colector de evaporación tras el secado completo de la muestra final. motas blancas en la parte inferior de los tubos de vidrio secos indican contaminación de tampón / NaCl.
- Pausa el procedimiento aquí si no hay suficiente tiempo restante en el día para completar la etapa de hidrólisis TFA. Temporalmente (es decir, durante la noche) almacenar muestras secas a -20 ° C. Para continuar con el procedimiento de después del almacenamiento, retire las muestras del congelador a -20ºC y permitir que se calienten por completo antes de destapar.
- Mientras que las muestras cálido, en preparación para la hidrólisis de ácido trifluoroacético (TFA) (próxima etapa), establecen el manto de calentamiento de tal manera que la temperatura del contenido del tubo de ensayo de líquido llegará a 121 ° C. Preparar la solución de TFA TFA de acciones (véase el paso 2.1 más adelante).
2. Ácido trifluoroacético (TFA) Hidrólisis
3. Reducción 4. La acetilación (Realizado en una campana extractora) 5. Cromatografía de Gases - Espectrometría de Masas (GC-MS) Análisis 6. Datos
Precaución: borohidruro de sodio (NaBH4) es una toxina higroscópico reacciona con el agua y potente irritante que libera-upon contacto con vapores inflamables altamente con el agua que causan graves quemaduras al entrar en contacto por inhalación, ingestión o en ojos / piel.
Precaución: hidróxido de amonio (NH4OH) es un irritante corrosivo y la toxina capaz de causar quemaduras severas y daño orgánico irreversible al entrar en contacto por inhalación, ingestión o en ojos / piel. Lavar las partes afectadas con agua durante 30 minutos, y que la víctima no frotarse o rascarse las zonas afectadas.
Nota: Para distinguir burbujas de aire de gotas de líquido, incline el tubo de ensayo. Sólo las gotas de líquido se mueven después de inclinar, pero lo contrario no siempre es cierto: si una burbuja no se mueve, todavía puede ser una (muy pequeña) de gotitas de líquido.
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Representative Results
Un cromatograma de la corriente de iones total (TIC) que muestra permetilación éxito, hidrólisis, reducción, y la acetilación de las muestras de plasma sanguíneo humano con respecto a los casos en los que se ejecutan incorrectamente dos pasos críticos permetilación se muestra en la Figura 3.
Absoluta Rendimiento de HexNAcs relativa a hexosas:
N -acetylhexosamine (HexNAc) acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs) tienden a tener menor rendimiento de hexosas. 43 Para estimar el rendimiento absoluto de HexNAcs en relación con hexosas, seis muestras de 10 g de N -acetyllactosamine (un disacárido Gal1-4GlcNAc) en se analizaron 10 l de agua. se integraron las áreas de pico de TIC de galactosa terminal (t-Gal) y 4-GlcNAc. El porcentaje de 4-GlcNAc en relación con la cantidad total de t-Gal-GlcNAc y 4 fue del 11,3 ± 0,7%(SEM). Aunque los rendimientos HexNAc son reproducibles (véase más adelante), el hecho de que este valor es mucho menor que el valor teórico de 0,5 indica que el rendimiento de HexNAcs es fundamentalmente menor que la de hexosas. (El rendimiento teórico es de 0,5 HexNAc porque N es un -acetyllactosamine 1:. Hexosa-HexNAc disacárido 1)
La reproducibilidad intraensayo e:
Intra e inter-ensayo de reproducibilidad para todos los nodos de glicanos que contribuyen al menos el 1% del total de hexosa o una señal HexNAc se proporcionan en la Tabla 1. Estos datos fueron adquiridos por analistas independientes 3 en 3 días separados, usando el mismo stock de plasma con EDTA. Los datos de estabilidad del inyector automático en virtud de este protocolo optimizado para los 18 nodos de glicano más abundantes en el plasma humano (es decir, los que tienen> 1% de la hexosa, total o señal HexNAc) están previstos en la Figura 4.
Otras observaciones notables:
Mientras que la optimización de la metodología permetilación, hemos encontrado que no es necesario para evitar la adsorción de agua por las perlas de NaOH antes de la primera lavado con acetonitrilo. También se encontró que la presencia de una pequeña cantidad de agua durante la etapa de acetilación final en combinación con un breve período de calentamiento con anhídrido acético sin TFA ayuda a facilitar la reacción completa. Finalmente, el alto poder de resolución de tiempo de vuelo (TOF) espectrometría de masas no es necesario para el éxito del análisis nodo glicano: Los resultados iniciales basados en la inyección en paralelo del mismo conjunto de muestras en un GC-TOF-MS y un cuadrupolo transmisión tradicional basado en GC-MS operado en el modo de seguimiento de iones seleccionados (SIM) muestran resultados similares en términos de la hexosa normalizado definitiva y HexNAc abundancias relativas.
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. Figura 1. Visión general Molecular del procedimiento de análisis de metilación global de glicano Una O -vinculada glicano se ilustra; que aparezcan durante el proceso permetilación, que ha sido adaptado de Goetz. 40 Siguiendo permetilación e hidrólisis, se reducen los monosacáridos y los grupos hidroxilo nacientes "marcados" por acetilación. El patrón único de metilación y acetilación de los acetatos de alditol metilados parcialmente finales (PMAAs) corresponde a la única "nodo glicano" en el polímero original intacto y proporciona la base molecular para la separación y cuantificación por GC-MS. N = Conectado y glicanos glicolípidos se lanzan como monosacáridos ligamiento marcada durante la hidrólisis ácida. Adaptado de Borges et al. 33 con permiso.> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Descripción general conceptual del concepto analítico. Una glicosiltransferasa upregulated (por ejemplo, GnT-V) provoca un aumento en la cantidad de un residuo específico, vinculado de forma única glicano monosacárido (a manosa "nodo" 2,6 ligada en este ejemplo) -que, a través de la acción posterior de otras glicosiltransferasas, puede conducir a la formación de una mezcla de estructuras de todo el glicano heterogéneos en bajo número de copias de cada, todo lo cual puede ser difícil de detectar y cuantificar en forma rutinaria. Analíticamente poner en común los "nodos de glicanos" de entre todas las estructuras de glicano aberrantes proporciona una medida sustituta más directa de la actividad de GnT-V que cualquier glicano intactas individuales. Medición simultánea de N -, S -, y el lípido ligado "glyc una nodos "en bioespecímenes enteros tal como se describe aquí (y originalmente en otro lugar 33) representa un conceptualmente nuevos medios por los cuales para detectar y controlar las enfermedades glicano-afectivos tales como el cáncer. reales cromatogramas de iones extraídos de muestras de plasma sanguíneo de 10 microlitros se muestra. números adyacentes a las residuos de monosacáridos en las estructuras de glicano indican la posición en la que el residuo más alto se vincula con el residuo más bajo. Si no hay posiciones de enlace se indican en la anotación cromatograma el residuo es o bien en la posición terminal o libre en solución (por ejemplo, glucosa). Todos los residuos . excepto enlace de ácido siálico a la baja a través de su posición 1; enlaces de ácido siálico a la baja a través de su posición 2 Dividir en cromatograma indica cambios en los cromatogramas de iones extraídos: m / z 117 129 para los residuos de hexosa y m / z 116 + 158 de la N - acetilhexosamina (HexNAc) los residuos. Adaptado de Borges et al. 33 con permiso.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los resultados representativos. Cromatogramas corriente de iones total (TIC) para el análisis nodo glicano de la misma muestra de plasma EDTA de sangre humana en la que A) la muestra se procesa correctamente, B) el residuo blanco en la solución permetilación que se hiló a través del NaOH la columna se llevó a la mezcla posterior para la extracción líquido / líquido, y C) la solución permetilación que se hiló a través de la columna de NaOH se añadió a la solución tampón de fosfato, pero no se mezcla a fondo antes de la adición de cloroformo para la extracción líquido / líquido. La leyenda proporcionada en la figura 2. Por favor, haga clic hERE para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. estabilidad Autosampler Estabilidad. Autosampler más de 48 horas para los 18 nodos de glicano más abundantes en el plasma humano. A las 22 horas, la muestra se seca completamente y se reconstituyó en 120 l de acetona. Cada grupo de puntos de datos representa cuatro inyecciones consecutivas de la misma muestra. Las líneas negras abarcan ± 15% del valor medio normalizado para cada nodo de glicanos. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. intra- e inter-ensayo de reproducibilidad. Los valores representan CV% de hexosa, total o total de HexNAc-glicanos normalizados nodos individuales. Se listan todos los nodos de glicanos que contribuyen al menos el 1% del total de hexosa o una señal HexNAc. Los datos fueron adquiridos por analistas independientes 3 en 3 días separados, usando el mismo stock de plasma con EDTA. N = 6 muestras por lote. Por favor, haga clic aquí para descargar la tabla como una hoja de cálculo de Excel.
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Discussion
En general, la producción exitosa de acetatos de alditol parcialmente metilados (PMAAs) a partir de hexosas está cargada de menos dificultades y es más robusto que el éxito de la producción de N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs. El mecanismo exacto detrás de este fenómeno, ya que desempeña en cada paso de este procedimiento es desconocido, pero debe estar relacionada con la química única del grupo acetil N (en lugar de grupo hidroxilo) que es único para HexNAcs en relación con hexosas. El mecanismo detrás de este fenómeno, ya que se refiere a la hidrólisis ácida se explica en otro lugar. 43 En resumen, la capacidad para la -methylacetamido N para ser cargado positivamente durante la hidrólisis ácida hace resistente a la hidrólisis ácida del enlace glicosídico. Esto explica el bajo rendimiento de HexNAc en relación con hexosa (11,3% del total de la señal HexNAc + hexosa, en lugar de 50% del total) como se describe anteriormente para el análisis de N -acetyllactosamine. En particular, este relativamente lower rendimiento de HexNAcs no los hace difíciles de detectar en fluidos biológicos y tejidos complejos, o impedir fácil detección de nodos de glucanos derivados de glicanos grandes y complejas (por ejemplo, 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 -Hombre, y 3,4-GlcNAc, la Figura 2). 33 Teniendo en cuenta la manera en que áreas de los picos XIC de nodos de glicano se normalizan (Paso 6.3), siempre que el rendimiento relativo de cada HexNAc individuo permanece constante en relación con otros HexNAcs ( que lo hace, véase la Tabla 1), la información útil sobre las cantidades relativas de los diferentes HexNAcs entre diferentes muestras se pueden obtener. Esto es válido para las hexosas también. Por otra parte, hemos demostrado previamente que las proporciones de las hexosas a HexNAcs muestran un comportamiento cuantitativo consistente así 33 - un fenómeno que se monitoriza continuamente a través de la incorporación de la muestra de control de calidad (s) en cada lote.
La manera en que se lleva a cabo permetilación tiene el mayor impacto enel rendimiento global y la reproducibilidad de HexNAc PMAAs. En particular, el gran cuidado se debe tomar para evitar completamente la exposición de los glicanos permetilados a alcalino condiciones acuosas. Dos pasos clave en este sentido son: 1) dejando todo precipitado blanco en las soluciones a través de spin-detrás (Pasos 1.3.13 y 1.3.14), y 2) la mezcla de inmediato las soluciones de spin-a través, una vez que se añaden a la solución tampón de fosfato ( Los pasos 1.3.13 y 1.3.14). Un tampón en lugar de solución de sal simple está incluido en esta etapa y para posteriores etapas de extracción líquido / líquido para prevenir la alcalinización inadvertida de la solución acuosa. Nosotros sospechamos que en condiciones alcalinas el grupo acetilo del grupo 2-amino metilado y acetilado de HexNAcs puede sufrir hidrólisis, resultando en una amina secundaria más polar que disminuye la eficacia de la extracción total de la glicano asociado en cloroformo.
La característica más fácilmente reconocible de HexNAcs sin éxito permetilados esla intensidad de la GlcNAc 4 ligada (4-GlcNAc) cromatográfica pico en relación con los de 6-Gal, 3,6-Man, y la intensidad de línea de base del fondo durante la última columna bake-fuera (Figura 3). Cuando la abundancia absoluta de la 4-GlcNAc PMAA es baja, su abundancia relativa normalizada para todos los demás HexNAcs también tiende a ser baja, con un aumento concomitante (más notablemente) de 3,4-GlcNAc.
Unos pocos cambios diseñados para optimizar la robustez general de rendimiento y de ensayo se han hecho desde nuestra publicación inicial que describe este método analítico 33 Uno de estos cambios es la manera en la que los cromatogramas de iones extraídos integrados (XICS) están normalizados:. En aras de la simplicidad, ahora dividimos el área de cada XIC hexosa individuo por la suma de todas las áreas de hexosa XIC; Del mismo modo, el área de cada HexNAc XIC individuo se divide por la suma de todas las áreas HexNAc XIC. Como se ve en la Tabla 1, interensayo general / inter-analista reproducibildad para todos los nodos de glicano que contribuyen a> 1% de sus respectivos hexosa o HexNAc promedios de señal 13% CV.
A nuestro entender, esta es la única encarnación de glycomics verdaderamente de abajo hacia arriba en la que los glicanos se rompen primero hacia abajo y luego sus componentes analizados para construir un retrato de toda la muestra cuantitativa de la composición de glicanos. Aquí, en lugar de la liberación enzimática tradicional, el proceso permetilación no elimina de forma reductora (versiones) O = Conectado glicanos de sus respectivas proteínas, mientras que 40 N -vinculada glicanos son liberados durante la hidrólisis ácida. 33 Como un enfoque complementario a glycomics tradicionales de arriba hacia abajo , este enfoque es capaz de poner en común las características únicas de glicano de interés tales como "fucosilación núcleo", "6-sialilación", "que divide en dos GlcNAc" y "beta 1-6 ramificación" en señales analíticas individuales (véase, 4,6-GlcNAc , 6-Gal, 3,4,6-Man y 2,6-Man nodos en la Figura 2, respectively). En los enfoques tradicionales de arriba hacia abajo, las características de este tipo que en última instancia dependen de las actividades únicas de una o dos glicosiltransferasas clave 33 se distribuyen normalmente a través de glucanos intactos decenas y en ocasiones puede ser difícil o imposible de resolver (por ejemplo, 3-sialilación vs. 6-sialilación) debido a la degeneración de algunas masas de glicano intactas. Además, el enfoque de abajo arriba que aquí se presenta ha demostrado promesa inicial en la detección no invasiva del cáncer de pulmón. 33 Otros estudios están en marcha para validar estos hallazgos iniciales, así como los resultados no publicados adicionales, sin embargo, que pertenecen a la detección de otras formas de cáncer.
La mayor limitación del método descrito aquí es que está limitado en cuanto a sus límites de detección, si se aplicara glicoproteínas para pre-aisladas. Sobre la base de los análisis publicados de las normas de glicanos individuales sin proteína transportadora, límites de cuantificación FOr glicanos individuales parecen estar en el intervalo de microgramos baja. Estos son de ninguna manera LOQ bajos en términos absolutos, pero este hecho no importa lo que respecta al ámbito de aplicación previsto originalmente del ensayo, lo cual no fue diseñado para y no tiene necesidad de lograr LOQ bajas (al menos para los fines descritos aquí y en nuestra publicación anterior 33). De hecho, el plasma humano / suero contiene glicoproteínas en los años 10 de concentración mg / ml gama-lo que significa que para el análisis de plasma de sangre / suero que sólo inyectamos ~ 1/100 del volumen de muestra final y dividimos 40 de 41 partes de esa pequeña cantidad de residuos en el puerto de GC inyector. Sin esta práctica, algunos de los nodos de glicano puede saturar el detector. cantidades picomoles de glicoproteínas que pueden producir señales de glicano intactas adecuados por arriba hacia abajo MALDI-MS convencional o LC-MS enfoques basados no pueden ser detectados con este enfoque. El refinamiento adicional de la metodología está en marcha para remediar esta limitación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium hydroxide beads | 367176 | Sigma-Aldrich | 20-40 mesh, reagent grade 97% |
| 0.9 ml Spin column | 69705 | Pierce division of ThermoFisher Scientific | Includes plugs and polyethylene frits |
| GC-MS autosampler vial (silanized)* | C4000-9 | ThermoFisher Scientific | Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps |
| 1.5 ml polypropylene test tubes | 05-402-25 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| 2 ml polypropylene test tubes | 05-408-138 | ThermoFisher Scientific | Snap-cap lid |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D8418 | Sigma-Aldrich | BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0% |
| Iodomethane | I8507 | Sigma-Aldrich | Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99% |
| Acetonitrile | A955-4 | ThermoFisher Scientific | Optima LC/MS |
| Microcentrifuge | 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424 |
| 13 x 100 glass test tube (silanized)* | 53283-800 | VWR | 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish |
| Caps for glass test tubes | 14-930-15D | ThermoFisher Scientific | Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner. |
| Sodium chloride | S7653 | Sigma-Aldrich | >99.5% pure |
| Chloroform | 4440-08 | Macron Fine Chemicals | |
| Trifluoroacetic acid | 299537 | Sigma-Aldrich | 99% purified by redistillation for protein sequencing |
| Sodium borohydride | 71321 | Fluka Analytical | 99% |
| Ammonium hydroxide solution | 320145 | Sigma-Aldrich | NH3 content: 28.0-30.0% |
| Methanol | AH230-4 | Honeywell Burdick & Jackson | HPLC grade |
| Acetic acid | 320099 | Sigma-Aldrich | 99.70% |
| Plastic vacuum desiccator | Any model of adequate size | FoodSaver | |
| Acetic anhydride | 539996 | Sigma-Aldrich | 99.50% |
| Dichloromethane | D143SK-4 | ThermoFisher Scientific | Stabilized HPLC grade |
| Acetone | 9006-03 | J.T.Baker | Baker Analyzed |
| Heated evaporation manifold (main unit) | pi18823 | ThermoFisher Scientific | Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function |
| Heated evaporation manifold (overhead evaporator) | pi18826 | ThermoFisher Scientific | ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module |
| Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold | pi18816 | ThermoFisher Scientific | Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep) |
| Gas chromatograph | Model A7890 | Agilent | Equipped with CTC PAL autosampler |
| Mass spectrometer | GCT Premier (Time-of-Flight) | Waters | |
| Split-mode liner (deactivated / silanized) | 5183-4647 | Agilent | Containing a small plug of silanized glass wool |
| DB-5ms GC column | 122-5532 | Agilent | 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness |
| Chlorotrimethylsilane | 95541 | Sigma-Aldrich | |
| Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) | EW-06536-30 | Cole-Parmer | 12" wide; 230 mm plate size |
| *Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator. | |||
References
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