Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım

Published: May 22, 2016 doi: 10.3791/53961
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry & Biochemistry, The Biodesign Institute – Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Introduction

Glikolipidler, glikoproteinler, proteoglikanlar ve glikozaminoglikanlar topluca glukanlardır olarak bilinen karmaşık, heterojen karbonhidrat dört ana sınıfları oluşturmaktadır. Olarak plazma membranı, glikokaliksin ve hücre dışı matriks ve sıvıların her yerde ve integral parçaları, glukanlardır endositoz, hücre içi kaçakçılığı, hücre motilitesi, sinyal iletimi, moleküler tanıma, reseptör aktivasyonu, hücre yapışması, konak-patojen etkileşimi gibi çeşitli biyokimyasal süreçlerde katılmak hayatın neredeyse her alanında arası iletişim, immünosürveylansında ve immün yanıt inisiyasyon. 1 Present, glikan polimerler inşa glıkosıltransferazlarla olarak bilinen enzimler glikozit oluşturmak için (glıkanları yıkmak da glikozidazlar olarak da bilinir), hidrolaz, şeklini ile birlikte hareket, ve sonuçta glikan polimerler 2 kesinleşmiş üretirler. Her glıkosıltransferaz farklı glycoconjugates üzerinde çalışabilir olsa da, bir glıkosıltransferazgenel nükleofilik alıcılarının belirli bir kategori (örneğin, bir lipid, polipeptit, bir nükleik asit ya da giderek artan belirli bir aktif nukleotıt şeker donörü (örneğin, GDP-fukoz) bir monosakarit kısmını aktarmak bir nokta askı sistemine bağlanan ve anomeri özgü glikosidik bağı yanma oligosakkarit). Protein (özellikle membran ve salgı proteinleri) arasında% 50'den fazla translasyon sonrası glikosilasyon ile modifiye olduğu tahmin edilmiştir 3 Rudimentary kombinasyon hesaplamalar glikosilasyon ile glikoproteinlerin tanınan ölçüde değişkenlik, çok yönlülük ve özgüllük için takdir sağlar.; bir polipeptit alt-tabaka, sadece 10 glikosilasyon sitesi vardır ve her bir sitenin yalnızca 3 farklı azalan monosakkarit'in uçlarının 1 ile glikosidik bağ oluşturabilen, örneğin, daha sonra, teorik olarak, son glikoprotein 3 10 = 59.049 farklı kimliklerinin varsayabiliriz. glikoproteinler olarak, glikozidik bağları genellikle yan zincir nitrojen ile o formuAsn-X-Ser f asparagin artıkları / Thr K O 4 -glycans vermek üzere serin ve treonin kökleri 2 ve yan zincir hidroksilleri -glycans vermek üzere (X, prolin dışında herhangi bir amino asit olabilir). Birkaç istisna dışında, glıkosıltransferaz sıkı donör, alıcı, ve bağlantı özelliği göstermeyen, çünkü bir hücrenin glycome kompozisyonu (yani, glikosilasyon ürünlerinin tamamlayıcısı) eşsiz ve sınırlıdır. 5 Önemli ve bol kan plazma glikoproteinler bir alt sonucu olarak anormal glikosilasyonu acı anormal glikosiltransferaz ve faaliyetinin nedeniyle birçok patolojik koşullarda, özellikle de, kanser ve inflamatuar hastalıklar. 6-24

Temelde epigenetik faktörler nedeniyle, glycome memeli genomunun yaklaşık% 1'i oluşumu, modifikasyon kodlar iken. Anlamlı 25,26 proteomu ve transcriptome daha, çeşitli dinamik ve karmaşık veGlikanların takımı olmayan bir şablon odaklı şekilde-belirgin bir kontrast 27 glikosilasyon ilerler polipeptidi ve nükleik asit biyosentezi için. Glikozilasyon enzimler ve besin ve öncü durumuna gibi çevresel faktörlerin göreceli miktarı ve etkinliği arasındaki etkileşim nihayetinde glikosilasyon doğasını, hızını ve kapsamını belirler. 5,28 Embriyo (örneğin, kararlılık ve farklılaşma), hücresel aktivasyonu ve ilerlemesi yoluyla hücre döngüsü etkisi gen ifadesi (yani, transkripsiyon ve çeviri) ve kimin aktivite hücrenin glikan profilinin hemen yukarı belirleyicisi olan mevcut glikoziltransferazların kimliğini ve miktarını değiştirebilir. (Bazıları) proliferatif olduğundan, yapıştırıcı ve kanserli hücrelerin bir invaziv sıradan embriyojenik hücreler, glıkan biyosentetik yollar (örneğin, ön-madde birikimi, deregüle sentezleme, aberran belirli değişikliklerin benzemektedir. t modifikasyonu, yapısal kesme veya yeni oluşumu) glikozilasyon açıkça glikozilasyon sadece birkaç değişiklikler karsinogenezini ve metastaz etkinleştirebilirsiniz, oldukça karmaşık olmasına rağmen tümör oluşumu, ilerlemesi, göç ve işgali 29 çeşitli aşamalarında gösterdiği gibi evrensel kanser biyobelirteçlerini hizmet; görünüşe göre, bazı "anormal" glikozilasyon ürünleri gerçekten bağışıklık tanıma kaçmasına ve daralan damar içi ve metastatik ortamlarda göç taleplerini hayatta kalmalarını sağlayarak kanserli hücreleri yarar. 28,30,31 şaşırtıcı değil, deneyler değişmiş kalıplarını bozan veya engelleyen ortaya koymuştur gen ekspresyonu ve anormal glikan oluşumu tümörogenez durdurabilir. 29 Bununla birlikte, bir biyo-sıvı numune (örneğin, idrar, tükürük, kan plazma veya serum) 'de tespit edilen anormal glıkanlar doğrudan kanser göstergeleri (veya başka bir hastalık), daha çok alt olmayabilir ince ama önemli sonuçlarıBağışıklık sistemi veya öngörülemeyen bir organında bir zararlı durumun ölçülebilir yansımaları değişiklikler. 32

Onlar glycome hakkında evrensel bilgi, pek çok moleküler etkileşim tabanlı Glikomik teknikleri (örneğin, lektin / antikor dizileri ve metabolik / kovalent etiketleme) sağlasa da tüm glıkan yapıların tespiti bağlıdır ve bireysel glukanlardır hakkında detaylı yapısal bilgi vermemektedir. belirgin aksine, kütle spektrometresi (MS) tanımlanmasına yardımcı ve bireysel glikan yapıları ölçmek ve polipeptit çekirdeklerine eki siteleri gibi yapısal bilgileri açığa çıkartabilir. Deregüle ifade veya sadece bir glıkosıltransferaz aktivitesi çok glikosilasyon yolakları zararlı moleküler olaylar kaskadını başlatabilir. Her glıkosıltransferaz birden fazla glycoconjugate alt tabaka üzerinde ve farklı büyüyen glikan polimerler arasında çalışabilir, çünkü deregüle biyosentetik kaskadlar dispropor verimarası olarak tek glikan ürünün miktarda ancak hücre içi veya dışı sıvılarda anormal glukanlardır birkaç heterojen sınıflar arttı. 33 Ancak, bu tür eşsiz anormal glukanlardır bazen kanser nedeniyle veya diğer glıkan-duygusal patolojiler için biyomarkerların olarak pratik olarak kabul edilir, büyük havuz ile karşılaştırıldığında ve glikanlar iyi düzenlenmiş, bu anormal glukanlardır olabilir sık ​​sık hatta kütle spektrometresi gibi son derece hassas tekniklerle saptanamaz kalır çok küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Örneğin, hücre içi ve hücre dışı vücut sıvılarında (büyüklük sekiz emir açıklıklı) geniş protein konsantrasyonu spektrum daha bol türler tarafından maskelenir kıt glikoproteinler tespiti önleyebilirsiniz. 32 Dahası, glıkosıltransferaz aktivitesinin belirlenmesinde pratik bir hayli kalır ve birçok glıkosıltransferaz klinik Biosıvılar içinde bulunmayan ya da ex vivo inaktif hale çünkü teorik meydan. consisten zorluğuna rağmently tespit ve eşsiz bütün glukanlardır ultra dakika miktarlarda ölçülmesi, kütle spektrometresi uygulayıcıları klinik belirteç olarak bozulmamış glikanları istihdam yönünde büyük atılımlar yaptık. Biz son zamanlarda GC-MS kullanılarak, birlikte her glıkan ve birçok teklik vermek tüm kurucu şube noktası ve bağlantı özgü monosakkaritler ( "glikan düğümler") tespitini kolaylaştırır, bozulmamış glukanlardır analizi için tamamlayıcı bir yaklaşım geliştirdik olgular doğrudan kusurlu glıkosıltransferaz (lar) göreli etkinliğini ölçmek moleküler temsilciler hizmet vermektedir.

İlk 1958 glıkan analizi doğrudan uygulama rapor için, gaz kromatografisi (GC), 34 başına metillenmiş mono- ve disakaritler analiz bunların anomericity ve mutlak konfigürasyonunu belirleyebilir ve daha sonra kütle spektrometrik analizi için ayırmak için güçlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. 35 1984 ve 2007, Ciucanu ve meslektaşları arasındatanıtılan ve 2005 ve 2008 yılları arasında su ve kloroform. 35,36 kullanılarak permetilatlı glukanlardır sıvı / sıvı ekstraksiyon ardından sodyum hidroksit ve iyodometan kullanılan bir katı-faz glikan permethylation tekniği, rafine, Kang ve arkadaşları, bir zaman tasarrufu falso entegre permethylation adımına -Kolon yaklaşım. 2008 37,38, Goetz araştırma grubu karşılaştırarak ihtimali olan ve olmayan ayırt matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) kütle spektrometrisi kullanılarak glıkan-profil yöntemi permethylation kantitatif bir katı-faz icat -invasive meme kanseri hücreleri 39 daha sonra, 2009 yılında, Goetz ekibi kombine enzimatik ve kimyasal salınım teknikleri yüksek alkali katı faz permethylation şemasında o -glycans bozulmamış glikoproteinler gelen ayırmak için 40 Goetz prosedürü eşzamanlı permethylation ve kimyasal salınımını kolaylaştırdı rağmen. o -glycans arasında, sadece önceden izole glikoproteinin uygulandıproteinler. Biz, 2013 yılında bu tekniği değiştirilmiş ve trifloroasetik asit eklenerek bütün bölünmemiş Biofluids ve homojenize doku örnekleri için uyarlanmış (TFA), hidroliz, indirgeme ve asetilleme adımlarını. Ayrıca, glikolipidler ve N'den glikanlar serbest 33 Bu ilave adım glikoproteinlerden glıkanları -bağlı dönüştürmek ayırt edici metilasyon-ve-asetilasyon desenler benzersiz GC-MS tarafından analiz kolaylaştırmak orijinal bozulmamış glikan polimer 41 (Şekil 2) kurucu glıkan düğümleri karakterize kısmen metillenmiş alditol asetatlar (PMAAs, Şekil 1), içine onları. 33 Sonuçta, bu prosedür, "göbek fukosilasyonu", "6-sialilasyon", "GIcNAc'nin" ve "p 1-6 dal" benzersiz glıkan özelliklerin doğrudan görece nicelenmesine dayanan kompleks biyo-sıvı tüm glıkanların bileşik portre üretir - her biri tek bir GC-MS kromatografisi yolu türetilenhic zirve. Bu makalede başka permethylation optimizasyonu, asetilasyonunu, izolasyon ve nispi ölçümü modunda gelişmeler ile birlikte temizlik aşamaları sunar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dikkat: Bu deneyde kullanılan maddelerinden biriyle cilt / göz temasından kaçının. maruziyet üzerine, su ile iyice etkilenmiş bölgeyi yıkayın ve derhal doktora başvurun.

1. Permethylation ve Glycan Ekstraksiyon

  1. Sütun Hazırlama
    1. Alınan numuneler tahlil için gibi birçok mikrofuge'ye spin kolon birimleri edinin. Kırmak ve plastik rezervuar tüp kapaklarını çıkarın. Her rezervuar tüp içinde bir mikrofuge'de küçük filtresi yerleştirin. Bir mikrofuge'de tüp rafa (mini filtreler içeren) bir araya mikrofuge'ye dönüş sütunları yerleştirin.
    2. bir sodyum hidroksit stoku (NaOH) boncukları (20-40 gözenekli) elde edilir. nem topaklanma, NaOH çalışan hisse senedi olarak sıcak porselen harcı neden olup olmadığını, bir küçük tartı tekne bazı NaOH aktarın veya. toz / NaOH veya ezilmiş NaOH boncuk öbekler kullanmaktan kaçının.
      Dikkat: NaOH güçlü bir toksin ve korozif temelidir. 15 dakika su ile yıkayın maruz deri / gözler. Thoroughly deneyi tamamladıktan sonra tezgah temizleyin.
    3. Küçük bir kaşık ya da spatula kullanılarak, (~ ağzına altında 5 mm) ilk dış eğim kadar NaOH ile mikrofuge'ye Mini filtreleri doldurmak için çalışan stoktan NaOH boncuk aktarın. / Pack NaOH boncuk yoğunlaşmasına tezgah üstünde dolu mikrofuge'de filtreleri dokunun.
      Not: Bu deney boyunca, higroskopik NaOH boncuklar fazla su adsorpsiyonu en aza indirmek NaOH kolonu ambalaj yüzeyi üzerinde herhangi bir ek sıvı seviyesi (örneğin, asetonitril, dimetil sülfoksit, analit çözelti) korumak ve hava ile doğrudan temas sınırlamak için.
    4. asetonitril (ACN) bir stok alın. Transferi ~ 350 ul her NaOH dolu mikrofuge'ye Mini filtre ACN. ACN altında kalmış NaOH tutun ve bir ipucu kıvrımsız jel yükleme pipet ile karıştırarak büyük hava kabarcıklarını çıkarmak.
      Dikkat: Asetonitri yanıcı tahriş edicidir.
    5. sütun Santrifüj
      1. simetrik bir santrifüj içinde mikrofuge'de sütunları düzenlemek; Gerekirse bir denge tüp kullanın. santrifüj içinde herhangi bir NaOH granülleri dökmekten kaçının. santrifüj kapağını kapatın.
      2. Santrifüj sütunlar ~ 15 sn 2,400 × g için (NaOH ve ACN içeren).
      3. santrifüj tamamlanmasının ardından, santrifüj mikrofuge'de sütunları kaldırmak ve bir tehlikeli atık kabına ACN atın. sağlam ambalaj NaOH sütunu tutun.
    6. Her bir NaOH dolu mikrofüj Mini filtreye ~ 350 ul dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin. DMSO altında kalmış NaOH tutun ve bir pipet ile herhangi bir büyük hava kabarcıkları. Daha önce 2400 x g'de ~ 15 sn, santrifüj sütunlar açıklandığı gibi, bozulmamış ambalaj NaOH tutarken, ve DMSO atın.
      Dikkat: DMSO bir mutajen ve irritan ve kolayca deri yoluyla absorbe edilir.
    7. Spin filtresi dahil fişleri ile tüm mikrofüj Mini filtreleri takınkiti. Her NaOH dolu mikrofuge'ye Mini filtreye ul DMSO ~ 350 aktarın ve DMSO sonra NaOH ambalaj içindeki tüm bölgeleri ulaşır, böylece NaOH ambalaj hava kabarcıklarını çıkarmak için 200 ul pipet kullanın. ezme veya aşırı NaOH boncuk kazıma kaçının; NaOH tozu istenmemektedir. mümkün olduğunca çabuk bu adımı tamamlayın.
  2. Plazma Kalite Kontrol hazırlanması (QC) Örnek (ler)
    Not:     deneysel gruplar arasında tutarlı sonuçlar sağlar her parti analiz edilecek ilgi biyolojik maddenin büyük bir homojen kütle koleksiyonundan alınan bir numunenin en az bir kısım kullanmayı düşünün için. Kan plazma analiz, örneğin, her bir parti QC örnek (ler) olarak, kan plazması bir kütle toplama kısım (lar) kullanın. bilinmeyen numune ile aynı şekilde işlem QC örnekleri.
    1. Santrifüj ~ 10,000 x g'de 4 dakika için kalite kontrol plazma stok örneği. santrifüj sırasında, bazı yüksek yoğunluklu çökelti inci razı olabilire dip ve bazı düşük yoğunluklu çökelti plazma üst şamandıra olabilir. plazma çıkarma kısım (lar) hem de kaçının.
    2. Aşağıdaki "1.3) Numune Hazırlama" geçin. Plazma santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, bu adıma dönün.
    3. santrifüj QC plazma 9 ul çekin ve ek kapatma kapağı ile donatılmış bir şekilde etiketlenmiş 1.5 ml'lik polipropilen bir test tüpüne transfer (bundan sonra "1.5 ml plastik test tüpü" olarak anılacaktır). Her eş payın iyondan arındırılmış su, 1 ul ekle; arzu edildiği takdirde, iç standart (ler) için bir taşıyıcı madde olarak kullanmak.
    4. Bu plazma kontrol 270 ul DMSO ilave. Girdap komple bir erimenin oluşması sağlanmıştır.
  3. Örnek hazırlama
    1. Biyolojik (analit) numune sayısı kadar 1.5 ml plastik test tüpleri elde edilir.
    2. karşılık gelen 1.5 ml plastik test tüpüne her bir biyolojik (analit) örnek devri 9 ul. iyonu giderilmiş su ve 27 transferi 1 ulHer bir numune, bir tüpe 0 ul DMSO ilave edin.
    3. Şiddetle numuneler DMSO içinde tam olarak çözünmesini sağlamak için (aşağı örneğin, girdap ve / veya arka arkaya pipet ve benzeri) karıştırılır.
      Dikkat: Davlumbaz içinde aşağıdaki adımları uygulayın. Plastik belirli türleri çözebilen uçucu sıvı, aşağıdaki adımları, iyodometan (CH3 I) 'e, diklorometan (2 CI2 CH metilen klorür olarak da bilinir), ve kloroform (CHCI3, triklorometan) olan ikinci (örneğin, nitril eldiven) . solvent dirençli eldiven kullandığınızdan emin olun. Nedeniyle düşük viskoziteli ve yüksek buhar basıncına, bu reaktifler transferi sırasında bir pipet damlayabilir yapabilirsiniz. Alıcı kabına bitişik stok solüsyonu tutarak reaktif kaybı ve potansiyel maruziyeti en aza indirmek.
    4. Bir küçük, temiz tüpe iyodometan yeterli toplam hacmi aktarın. Her analit numunesi 105 ul iyodometan gerektirecektir. anoth içine Transferi ~ 500 ul diklorometantemiz tüp er. şırınga tıkanmasını önlemek için, hemen iodometan transferinden sonra diklorometan ile şırınga durulayın.
      Dikkat: İyodometan, ışığa uçucu ve merkezi sinir sistemine zarar veya solunması ya da yutulması halinde ölüme neden güçlü toksin yetenekli. Diklorometan potansiyel kanserojen, üreme mutajen ve birkaç organların zarar veya ölüme neden güçlü tahriş edici yeteneğine sahiptir.
    5. her analit numunesi 105 ul iyodometan eklemek için analitik bir şırınga kullanın. Cap analit tüpleri hemen iyodometan buharlaşmasını en aza indirmek için. Gerektiğinde, kısaca santrifüj tüm örneklerin hiçbir sıvı kapağı kalmasını sağlamak için ise iyice vorteks ve. (Kahverengi, mor veya sarı örneğin,) herhangi bir renk değişimi aşağıdaki permethylation reaksiyonu tehlikeye atabilir iyodometan bozulmasını, sinyalleri.
    6. diklorometan ile en az 3 kez iyodometan aktarmak için kullanılan analitik şırınga durulayın. Bu sağa sola bunu önlemek olacaktırm tıkanma. organik tehlikeli atık kabına ilave iyodometan ve diklorometan ile birlikte, bu durulama bertaraf edin. tehlikeli atık kabına kullanılan test tüpleri yerleştirin.
    7. 2-ml plastik rezervuar tüpler yeni bir dizi elde etmek. istenirse ek kapaklarını çıkartın.
    8. mikrofuge'ye Mini filtreleri çekin. Santrifüj sonra 15 2,400 x g'de saniye ve için takılı sütunlar DMSO atık ile birlikte rezervuar tüpleri atın.
    9. santrifüj sıkma sütunları yeniden takın ve yeni rezervuar tüpler içinde koyun. Sayı her spin kolon ve aynı örnek numarası ile karşılık gelen rezervuar tüpü. Mini filtre fişler sıkı olduğundan emin olun; Potansiyel sızıntı sonraki adımı etkileyebilir. Spin sütunlarından DMSO kaldırma ve döndürme sütunları üzerine analit örnekleri aktarılması arasındaki süreyi en aza indirir.
    10. Permethylation
      1. Kantitatif karşılık gelen NaOH-boncuk dolu mikrofuge'ye sıkma co her örnek çözümü transferilumn. Bu adım için 1.000 ul pipet kullanın. taşınmasının ardından, 200 ul ucu sonu ~ 2 mm kıvrım ve bir karıştırıcı olarak kullanmak için sütun içeriğini bırakın. Tüm numuneler için tekrarlayın.
        Not: analit çözüm transferi sırasında pipet gelen damla çünkü iyodometan düşük viskoziteli örnek kaybına neden olabilir. örnek tüp ve bir elle birbirine bitişik spin kolon tutun ve hızlı bir şekilde, diğer taraftan numune çözeltisi aktarın.
      2. permethylation Reaksiyon 11 dakika devam etmesine izin verir. Bu dönemde her bir numune en az 4-5 kez karıştırın. karıştırıcılar hafifçe sütun içeriğini karıştırmak için NaOH boncuk yüzeyinde meydana verimli permethylation kolaylaştırmak için, uç kıvrılmış jel yükleme pipet uçları kullanın. Agresif karıştırma, spin filtre delinme pulverize ve (daha sonraki sıvı / sıvı ekstraksiyon etkinliğini azaltabilir) NaOH boncuk askıya ve / veya sa olarak (örnek kaybına neden olabilirNaOH granül) sütundan taşabilir mple batırılmış.
      3. daha sonra, sıvı / sıvı ekstraksiyon adımı için hazırlık olarak, 0.2 M sodyum fosfat tampon maddesi (pH 7.0) içinde 0.5 M sodyum klorür (NaCI) çözeltisi yeterli miktarda hazırlanması Oda sıcaklığında saklanır. Her bir numune, sıvı / sıvı ekstraksiyon üç döngü için 12 ml NaCl çözeltisi aralığında bir toplam gerektirecektir.
      4. 11 dakikalık permethylation süresinin tamamlanmasından sonra, hemen henüz dikkatle sütunları çıkarın ve 2.400 x g'de 15 saniye boyunca onları santrifüj. tapaları atın.
    11. Hemen santrifüj sıkma sütunları kaldırmak ve arkasında taze permetilatlı glikanları ihtiva akış çözümü bırakarak, boş sıkma haznesi tüplerin yeni bir dizi içine koyun. bir şey atmayın.
    12. En kısa sürede, kuru, NaOH dolu sıkma filtrelere 300 ul asetonitril (ACN) ekleyin. 9600 x g'de 30 saniye boyunca sıkma filtreleri santrifüj.
    13. immediatelY daha sonra, (örneğin, daha sonra önceden önceki adımda ACN 300 ul ilave bir santrifüj tüpüne eğirme filtresi içinden ip 11 dakika boyunca NaOH boncuklarla inkübe edildi çözelti) 13 x silanize ana permethylation çözeltisini 100 mm cam test tüpleri 42 3.5 mi hemen 0.2 M sodyum fosfat, 0.5 M NaCl, pH 7.0 içeren bir tampon madde ve karıştırın (vorteks) arasında ihtiva etmektedir. Bu adımı sırasında herhangi bir katı, beyaz kalıntı transfer kaçının. Bir sonraki adıma geçmeden önce her bir numune için bunu yapın.
    14. gecikmeksizin, transferi (kombine) (ile), ilgili Silanlanmış cam tüp içinde sıvı numune dinlenme ve hemen (vorteks) karıştırmak için her rezervuar tüp içinde ACN Spin-through. Yine bu aşama sırasında bir beyaz katı bir tortu geçişini engelleyecek. Cap, sallamak, ve vorteks cam tüp. her numune için tekrarlayın. Uygun çöp konteynerleri NaOH sütunları ve Pasteur pipetler atın.
  4. Sıvı / sıvı Ekstraction ve Glycan Arıtma
    1. Davlumbaz içinde, her bir örnek için 1.2 ml kloroform ekleyin. Bundan hemen sonra, silanize cam tüpler kapağı ve kuvvetli bir şekilde karıştırın.
    2. bir buharlaştırma manifoldu yaklaşık 75 ° C'ye kadar ön ısıtma metal bloklar. 100 mm cam tüpler × 13 mm ağırlayacak kuyuları ile ısıtma blokları kullanın.
    3. Silanlanmış Pasteur pipetleri, olmayan Silanlanmış Pasteur pipetleri ve kapakları Silanlanmış cam test tüpleri yeni bir dizi elde etmek.
      Dikkat: Kloroform (CHCl3) eldiven bazı türleri ile nüfuz edebilen bir tahriş edici, mutajen ve potansiyel kanserojendir.
    4. Kısaca santrifüjü (~ 3.000 x g) bir numunesi içeren cam tüpler, sulu ve organik tabakaların ayrılması için.
    5. Sulu tabakanın ~ 3 mm alt organik tabaka üzerinde kalacak şekilde En Sulu tabakanın kadar çıkarmak için olmayan bir silanize Pasteur pipet kullanın.
    6. 0.5 M Na 3.5 ml ilave edilirher bir cam tüpe 0.2 M sodyum fosfat tamponu içinde Cı çözeltisi (pH 7), kuvvetli bir şekilde karıştırın ve kısa bir süre için santrifüj (~ 3.000 x g). Önceki adımda (1.4.3) 'de olduğu gibi, sulu katmanın özü olmayan bir silanize Pasteur pipet kullanın.
    7. önceki adımı (1.4.4) tekrarlayın, ancak ~ sulu tabakanın 1 ml bırakın.
    8. Temiz ve uygun biçimde etiketlenmiş Silanlanmış 13 × 100 mm cam test tüpüne Organik tabakayı aktarmak için temiz bir Silanlanmış Pasteur pipet kullanın. şu şekilde ayıklayarak sulu kirlenmesini önlemek:
      1. Bir yandan birbirine bitişik mevcut ve yeni silanize cam test tüpleri hem tutun. Diğer elinizle, sulu tabakanın aşağı pipet takarken kabarcıkları oluşturmak için pipet ampul basın.
      2. Bir kez organik tabaka içinde, hava kabarcıkları oluşturarak durdurmak ve organik ve sulu tabakalar stabilize ve tekrar ayrılması için izin sabit pipet ampul tutun. Sonra, yavaş yavaş Kurumu'nun yayınladığı kadar çekilme ampulü bırakınherhangi bir sulu kontaminasyon olmadan mümkün olduğunca c tabakası.
      3. Hızla sulu katmanı üzerinden pipet ucu yükseltmek ve tüpün dışına pipet yükselterek biraz (bazı sulu kontaminasyonu çekilmesi ile sonuçlanan) Ampulü bırakmadan doğal refleksi karşı.
      4. Hızla bitişik yeni bir tüpe, düşük viskoziteli organik tabaka aktarın. Herhangi bir sulu kirlilik yeni bir cam tüplerde ekstre Organik tabakanın en küçük sıvı damlacıkları olarak görünür olacaktır. Sulu / NaCI kirlenme görünüyorsa, bir pipet ile çıkarın; Tek bir damlacık içine sulu damlacıkları havuz için gerekirse santrifüj.
    9. Düzgün eski cam tüpler, pipetler ve sulu ve organik atık çözümleri atmayın. Yıkayın ve cam tüp kapaklarını geri dönüşüm.
    10. Bir çeker ocak içinde ~ 5 dakika boyunca 75 ° C'de önceden ısıtılmış bir buharlaştırma manifoldunda hafif bir azot ve sürekli akışı altında tüm örnekler kurutun. tüm kuru aşağı ste sırasında evaporatif soğutma sağlamak içinPS, hafif bir azot ve sabit akış sıçramasına veya sıvı sıçrayan olmadan sıvı yüzeyini rahatsız gerekir. Nihai numunenin tam kuruduktan sonra buharlaşma manifoldu örnekler çıkarın. bir kuru cam tüplerin alt kısmında beyaz lekeler tampon / NaCI kontaminasyonu göstermektedir.
    11. TFA hidroliz adımı tamamlamak için gün içinde kalan yeterli zaman yoksa burada prosedürü Pause. Geçici bir süre için (örneğin, gece boyunca), -20 ° C'de, kuru numune depolamak. , Depolamadan sonra prosedüre devam -20 ° C derin dondurucuda örnekleri kaldırmak ve onları Kapaklar açılmadan önce tamamen ısınmasını bekleyin.
    12. Numuneler, sıcak, trifluoroasetik asit (TFA) hidroliz (bir sonraki aşama) için hazırlık, ısıtma mantosu set ederken, sıvı tüp içeriğinin sıcaklığı 121 ° C'ye ulaşması. TFA stoktan TFA çözeltisi hazırlayın (aşağıda Adım 2.1 bakınız).

2. trifluoroasetik asit (TFA) hidrolizi

  1. iyonu giderilmiş su içinde 2.0 M TFA çözeltisi yeterli miktarda hazırlanır. Her analit numune 2.0 M TFA çözeltisi 325 ul gerektirir. Konsantre TFA 13.0 M olduğu
  2. her analit numune 2.0 M TFA 325 ul ekle. takip eden bir kurutma işlemi (aşağıda 2.3) içinde TFA buharlaştırma ve örnek kaybını önlemek için, sıkı bir şekilde TFA ilave edildikten sonra hemen her bir örnek tüp kap. Tüm cam tüplerde çözüm seviyesini işaretleyiniz. Bir sonraki adımda evvel her örnek Vortex.
  3. Uygun önceden ısıtılmış bir ısıtma bloğu içinde 2 saat sıkıca kapatılmış bir numune tüpleri inkübe ya da içerisinde 121 ° C'lik bir sıcaklığa ulaşması şekilde fırın. bir ısıtma bloğu yerine bir fırın kullanılması durumunda, alüminyum folyo ile kapak Örnek tüpleri tüpün alt tüp ve örnek kalıntı kısmi kurutma üstünde TFA yoğunlaşmayı önlemek için. 20-30 dakika sonra örnek çözüm seviyelerini kontrol edin.Minimal TFA buharlaşmasını sağlamak. Gerekirse, daha fazla kapaklarını sıkın ya da bir sıkı oturması için kapaklar değiştirin.
  4. 2 saatlik bekleme sırasında, bir sonraki adıma (aşağıya bakınız 2.4) 75 ° C'ye kadar başka bir buharlaştırma manifoldu ayarlayın.
  5. 2 saatlik ısıtma süresi 15 dakika ~ azot gazı hafif bir akımı altında 75 ° C'de, tam kuru örnekleri ise. fazla 15 dakika gözetimsiz örnekleri bırakmayın. Sık kez tüm numuneler kuru örnekleri kontrol ve ısıtma ve kurutma durdurma.
  6. indirgeme adımı tamamlamak için gün içinde kalan yeterli zaman yoksa burada prosedürü Pause. -80 ° C geçici olarak (yani, bir gecede) mağaza örnekleri. , Depolamadan sonra prosedüre devam -80 ° C derin dondurucuda örnekler kaldırmak ve onları Kapaklar açılmadan önce tamamen ısınmasını bekleyin.

3. Azaltma

  1. Bir çeker ocak içinde 1 M ammoni bir 10 g / L sodyum borohidrid yeterli miktarda (NaBH4) çözeltisi hazırlayınum hidroksit (NH4OH). Her numune Bu çözümün 475 ul gerektirir. Numunelerin her parti için yeni bir çözüm olun. Konsantre amonyum hidroksit yaklaşık M. 14.5 olan (NH3 ağ / ağ 27-30%)
    Dikkat: Sodyum borohidrid (NaBH4) higroskopik, su-reaktif toksin ve güçlü tahriş olduğunu bültenleri-upon soluma, yutma veya göz / cilt teması üzerine ciddi yanıklara neden su son derece yanıcı buharları ile temas.
    Dikkat: Amonyum hidroksit (NH 4 OH) ciddi yanıklara ve soluma, yutma veya göz / cilt teması üzerine geri dönüşsüz organ hasarına yol açabilecek bir aşındırıcı tahriş edici ve toksin olduğunu. 30 dakika boyunca su ile etkilenen bölgeyi yıkayın ve sürtme ya da etkilenen alanlar çizilmeye kurbanı engeller.
  2. Her numune için, 1 M NH4OH 10 g / L NaBH4 475 ul ekle. Mix numunelerin iyice herhangi bir kalıntı eritmek için. Cap test tüpleri veindirgeme reaksiyonu 1 saat süreyle devam etmesine izin.
  3. 1 saatlik bekleme sırasında 75 ° C'ye kadar ısıtıldı buharlaştırma manifoldu ayarlayın. cam tüpler için uygun kuyulara (aşağıda 3.4 bakınız) bir ısıtma bloğu kullanın.
  4. 1 saatlik reaksiyon süresinin tamamlandığında, her bir örnek için 63 ul metanol (MeOH) ekleyin. 68 ° C'de kaynar, nispeten uçucu sıvı - Bu adım ve şu adımı trimetil borat gibi artık bor çıkarın.
  5. 15 dakika ~ azot gazı hafif bir akımı altında 75 ° C'de (önceden ısıtılmış manifoldunda) Kuru örnekleri. Sıkça örnekleri kontrol ve sahipsiz onları bırakmayın. cam tüpler altındaki küçük sıvı damlacıkları örnek henüz kuru olmadığını gösterir.
    Not: sıvı damlacıkların hava kabarcıklarını ayırmak deney tüpünü yatırın. Sadece sıvı damlacıkları devirme sonra hareket edecek, ancak bunun tersi her zaman doğru değildir: bir baloncuk hareket etmezse, yine de bir (çok küçük) sıvı damlacığı olabilir.
  6. sampl kezmetanol (MeOH) ve asetik asit (AcOH) içinde 1 (hac / hac) çözeltisi: ES 9 hazırlama tamamen kurudur. Her bir örnek için AcOH çözeltisi: Bu, MeOH 125 ul ekle.
  7. bir azot gazı akımı altında yumuşak bir 75 ° C 'de (önceden ısıtılmış bir manifoldunda) Kuru örnekleri.
  8. örnekler tamamen kuru olan, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca numune vakumlu kuru (örneğin FoodSaver tarafından satılanlar gibi), bir plastik vakum küvet içine Örnekleri vakum kapağını kapatın "vakum" bağlanmak için elektrik kadranını vakum vakum hortumu ve dönüş. Vakum sökmek için aşağıdaki adımları ters. tamamen vakum kapağını açmak için denemeden önce basıncı azaltmak için sistemin bekleyin.
  9. indirgeme adımı tamamlamak için gün içinde kalan yeterli zaman yoksa burada prosedürü Pause. -80 ° C geçici olarak (yani, bir gecede) mağaza örnekleri. -80 ° C derin dondurucuda örnekler kaldırmak, depolamadan sonra prosedür devam ediyor ve onları uncappin önce tamamen ısınmasını sağlamak içinörn.
  10. örnekler vakum kuru için (ya da sıcak, depolama sonrası) beklerken, bir sonraki aşama için reaktifler hazırlar. Elde ve her numune için numarası (kapaklı) bir Silanlanmış konik tabanlı otomatik örnekleyici (AS) 'flakon. Ayrıca, ön ısıtma sığ sıra-vial ısıtma bloğu ve derin oyuklu cam boru bloğu her iki cam tüp içerikleri, 50 ° C'lik bir sıcaklığa erişir şekilde.

4. Asetilasyon (a Çeker Hood Yapılan)

  1. Her bir örnek için deiyonize su 18 ul ekle. Cap ve iyice tamamen herhangi çökeltilerin çözünmesi tüm vorteks tüpleri.
  2. her bir cam tüpe 250 ul asetik anhidrit ekleyin. 2 dakika için bir su banyosu içinde kap, iyice vorteks ve sonikasyon, kalıntı ve çökeltileri tamamen çözülmesini sağlamak için.
  3. Alüminyum folyo ile cam tüpler Kapak ve 10 dakika boyunca 50 ° C'lik bir iç sıcaklıkta inkübe edilir.
  4. Her bir örnek için 230 ul konsantre edildi, trifloroasetik asit (TFA) ekleyin. Hemen kap birnumune karışımı d. Daha sonra, kuluçkaya örnekler kaplı alüminyum folyo 50 ° C'lik bir iç sıcaklıkta 10 dakika.
  5. İnkübasyondan sonra, her bir örnek için, 1.8 ml diklorometan (CH2C! 2) ekleyin. Cap ve iyice karıştırın.
  6. Her bir örnek için deiyonize su 2.0 ml ilave edilir. Cap ve iyi karışım örnekleri. 0 3.000 × g santrifüj katmanları ayırmak için. Su kirlenmenin önlenmesi Aşama 1.4.6 belirtildiği gibi, sıvı / sıvı ekstraksiyon yapmak için olmayan bir silanize Pasteur pipet kullanın.
  7. İki ekstraksiyon toplam bir kez daha ekstraksiyon, tekrarlayın. (AS raf güvenli tutulur) şişeleri OLARAK Silanlanmış etiketli içine Organik tabakayı aktarmak için Silanlanmış Pasteur pipetler kullanın. hemen altında ağzına AS şişeleri doldurun.
  8. azot gazı altında 40 ° C'de 15 dakika boyunca (AS şişelerde) kuru numuneler için bir ön-ısıtılmış, sığ çukurlu ısıtma bloğu kullanın. aşırı kuru etmeyin. Nihai ürünler, kısmen metillenmiş alditol asetatlar (PMAAs) olarak bilinir.

5. Gaz Kromatografisi - Kütle Spektrometrisi (GC-MS)

  1. aseton 100 ul her bir örnek sulandırın ve iyice karıştırın. GC bölme modu (280 ° C 'de muhafaza edilmekte ve silanize bir cam yünü küçük fiş ihtiva eden) bir astar olarak bölünmüş modda her bir örnek için 1 ul enjekte etmek için bir otomatik numune alıcı kullanın. 0.25 mm ID 0.25 mikron film kalınlığında 30 m DB 5 ms GC kolonu boyunca 0.8 ml / dakika sabit akış modunda taşıyıcı gaz olarak 40. Kullanım helyum lik bir ayırma oranı kullanın.
  2. 0.5 dakika boyunca 165 ° C 'de, ilk GC fırın sıcaklığı tutun. (10 dk) 10 ° C / dk bir oranda 265 ° C'ye kadar, 165 ° C, her bir çalışma için, sıcaklık eğrisi, program fırın başlangıç ​​süresi izlenerek ve hemen ardından sıcaklığı 265 ° C Rampa (2 dakika sürer) 30 ° C / dk bir oranda 325 ° C ve 3 dakika için 325 ° C'da sıcaklığı muhafaza. numune başına toplam çalışma süresi 15.5 dk.
  3. yanlısı kullanınPerly ayarlanmış ve (El, 250 ° C'de 70 eV) iyonizasyon elektron KR sütunundan elüsyon örnek bileşenleri tabi kütle spektrometresi kalibre edilmiştir. Bir TOF kütle analizörü, bir 0.1-sn darbe toplamı oranı ile, m / z 800 m / z 40 parçaları analiz. 2.5 dak EI-filament çözücü gecikme süresini ayarlayın.

6. Veri Analizi

  1. Bir TOF kütle analizörü kullanarak ise, çıkarılan iyon kromatogramı elde etmek için 0.15 Da kitlesel bir pencere uygulayarak her PMAA için fragman iyonları en bol ve / veya teşhis toplamı. Her PMAA Hedef iyonları yerde yayınlandı, 33 ancak aşağıdaki değişiklikler yapılmıştır: t-GLC iyonları şimdi 145.1 + 205.1 vardır; 2-Man iyonları 161.1 + 189.1 vardır; 3-Gal iyonları 6-Gal iyonları 161,1 + 189,1 + 233,1 olan + 233.1 161.1 vardır; 2,6-Man iyon 189.1 olduğu; 3,6-Man iyonları + 233.1 189.1 vardır.
  2. otomatik olarak iyon kromatogram çıkarılan toplamlı her pik alanları entegre QuanLynx veya başka bir yazılım kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Göre iki kritik permethylation adım yanlış infaz edildiği durumlarda başarılı permethylation, hidroliz, azaltma, ve insan kan plazma örneklerinin asetilasyonunu gösteren bir toplam iyon akımı kromatogram (TIC) Şekil 3 'de gösterilmiştir.

Heksozların için HexNAcs Görece mutlak Verim:

N -acetylhexosamine (HexNAc) kısmen olarak metillenmiş alditol asetatlar (PMAAs) heksozlar daha düşük verim sahip olma eğilimindedir. 43 heksozlar için HexNAcs nisbetle mutlak verim tahmin, N -acetyllactosamine (a Gal1-4GlcNAc disakarid) içinde altı 10 ug örnekleri su 10 ul analiz edilmiştir. Terminal galaktoz (t-gal) ve 4-GlcNAc TIC pik alanları entegre edilmiştir. t-Gal ve 4-GlcNAc toplam miktarına göre 4-GlcNAc yüzdesi 11.3 ±% 0.7(SEM). HexNAc verimleri (aşağıya bakınız) tekrarlanabilir olsa da, bu değer 0.5 teorik değerden daha az olması HexNAcs verimi heksozların daha temelde düşük olduğunu gösterir. (N -acetyllactosamine 1 olduğu HexNAc Teorik verim 0.5:. 1 heksoz-HexNAc disakarid)

Ameliyat sırasında ve interassay Tekrarlanabilirlik:

Hücre içinde ve toplam heksoz ya HexNAc sinyalinin en az% 1 katkı tüm glıkan düğümler için analizler arası tekrarlanabilirlik Tablo 1 'de verilmiştir. Bu veriler, EDTA plazması aynı stoku kullanarak, 3 ayrı günde 3 ayrı analistlerin elde edilmiştir. (Yani, toplam heksoz ya HexNAc sinyali>% 1 olan), Şekil 4'te verilmiştir insan plazmasında 18 en bol glıkan düğüm için optimize edilmiş bir protokol altında otomatik numune stabilite verileri.

Diğer Önemli Gözlemler: fo kız = "jove_content":

permethylation yöntemi optimize ederken, asetonitril ile yıkama ilk kullanımdan önce NaOH boncuklar su adsorbe önlemek için gerekli olmadığını tespit. Ayrıca TFA olmadan, asetik anhidrid ile ısıtılarak kısa bir süre ile bir arada son asetilasyon aşaması esnasında suyun küçük bir miktarının varlığı, reaksiyonun tamamlanmasını sağlamak için yardımcı olduğu bulunmuştur. Son olarak, zaman-of-flight (TOF) kütle spektrometresi yüksek çözme gücü başarılı glıkan düğüm analizi için gerekli değildir: GC-TOF-MS ve geleneksel iletim quadropole numunelerin aynı setin paralel enjeksiyonu dayalı ilk sonuçlar tabanlı GC-MS, seçilen iyon izleme işletilen (SİM) modu son normalize heksoz açısından ve HexNAc göreli bollukları benzer sonuçlar göstermektedir.

er.within-page = "1"> Şekil 1
. Küresel glıkan metilasyon analizi prosedürü Şekil 1. Moleküler genel bakış Bir O glikanın -bağlı gösterilmektedir; Bu permethylation ve hidroliz ardından Goetz. 40 adapte edilmiştir permethylation işlemi sırasında yayımlanan, monosakkaritler azalır ve doğmakta olan hidroksil grupları asetilasyon ile "işaretli". (PMAAs) nihai kısmen metile alditol asetatlar metilasyon ve asetilasyon eşsiz desen orijinal dokunulmamış polimer benzersiz "glıkan düğüme" karşılık ve moleküler GC-MS. N ayrılması ve ölçümü için temel -bağlı ve glikolipid glikan sağlar asit hidroliz sırasında bağlantı işaretli monosakkaritlerden olarak serbest bırakılır. Borges ve ark uyarlanmıştır. Izni ile 33.> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Analitik kavramının Şekil 2. Kavramsal bir bakış. Bir upregüle glikosiltransferaz (örneğin, GnT-V), belirli bir benzersiz bağlantılı glıkan monosakkarid tortu miktarındaki bir artış (bu örnekte bir 2,6-bağlı mannoz "düğüm") neden olan -ki diğer glikosiltransferazların müteakip etkimesi yoluyla tespit ve rutin bir şekilde ölçmek için zor olabilir, her-hepsi düşük kopya sayısı heterojen tam glıkan yapılarının bir karışımının oluşmasına yol açar. Analitik herhangi bir tek sağlam glikan daha GnT-V aktivitesinin daha doğrudan bir vekil ölçüm hep birlikte anormal glıkan yapıları arasında "glıkan düğümleri" dan sağlar havuzu. , - O - Eşzamanlı N ölçüm bağlantılı ve lipid "glisin Burada anlatılan (ve aslında başka bir yerde 33) hangi algılayabilir ve kanser gibi glikan-duygusal hastalıkları izlemek için kavramsal yeni araçlar temsil eder bütün biospecimens bir düğüm ". gösterilmiştir 10 mikrolitre kan plazma örneklerinden Gerçek çıkarılan iyon kromatogramları. bitişik Sayılar glıkan yapılarda monosakkarit artıkları yüksek kalıntı düşük kalıntı bağlantılı hangi konumunu gösterir. hiçbir bağlantı pozisyonları kromatogram açıklama belirtilmiştir varsa kalıntı ya terminal pozisyonunda ya da solüsyon (örneğin, glukoz) serbest. Tüm kalıntıları olduğunu .; aşağı, 1-pozisyonu ile sialik asit bunun dışında, sialik asit bağlantıları aşağı olarak 2-konumu aracılığıyla kromatogramda bölme ekstre iyon kromatogramları değişikliği gösterir: heksoz artıkları ve m / z N 116 + 158 için m / z 117 129 - acetylhexosamine (HexNAc) kalıntıları. den Borges ve ark. izni ile 33 uyarlanmıştır.61 / 53961fig2highres.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. Örnek Sonuçlar. Örnek doğru işlenmiştir: a) Aynı insan kanı EDTA plazma örneğinin glıkan düğümü analizi için toplam iyon akımı kromatogramlar (TIC), B) NaOH ile eğrilmiştir permethylation çözelti içinde beyaz bir tortu, sütun sıvı / sıvı çıkarımı için daha sonra karışıma gerçekleştirildiği, ve C) NaOH kolonu boyunca döndürülmüştür permethylation çözeltisi fosfat tamponu ilave edildi, ancak sıvı / sıvı çıkarımı için kloroform ilave edilmeden önce iyice karıştırılır değildir. Şekil 2'de verilen efsane. H tıklayınızere bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 4,
İnsan plazmasında 18 en bol glıkan düğümler için 48 saat boyunca 4. Otomatik örnekleyici İstikrar. Otomatik örnekleyici istikrarı Şekil. 22 saat örnek tamamen kurutulmuş ve 120 ul aseton içinde yeniden. veri noktalarının her küme aynı örnek arka arkaya dört enjeksiyonları temsil eder. Siyah çizgiler her glıkan düğüm için ortalama normalize değeri ±% 15 kapsar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

tablo 1
Tablo 1. Hücre içinde ve interassay tekrarlanabilirlik. Değerler toplam heksoz veya toplam HexN ve% CV temsilAc-normalize bireysel glıkan düğümleri. Toplam heksoz veya HexNAc sinyalin en az% 1 katkı tüm glıkan düğümler listelenir. Veri EDTA plazması aynı stok kullanarak, 3 ayrı günlerde 3 ayrı analistler tarafından satın alındı. Parti başına N = 6 örnekleri. Bir Excel elektronik tablosu olarak bu tabloyu indirmek için tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Genel olarak, heksozlarla kısmen metillenmiş alditol asetatlar başarılı üretim (PMAAs) Daha az zorluklarla doludur ve N -acetylhexosamine (HexNAc) PMAAs başarılı üretiminden daha sağlamdır. Bu prosedürün her aşamasında dışarı oynar gibi bu fenomenin arkasında tam mekanizması bilinmemekle beraber heksozlarla için HexNAcs göreceli özgü (yerine hidroksil grubuna göre) N-asetil grubunun eşsiz kimyaya ilgili olmalıdır. Asit hidrolizi ile ilgili olarak bunun altında yatan mekanizmanın Kısaca başka. 43 açıklanmıştır, N -methylacetamido pozitif asit hidrolizi sırasında şarj olma kapasitesi asit hidrolizine karşı dayanıklı glikosidik bağlantı yapar. Bunun sonucunda N -acetyllactosamine analizi için yukarıda tarif edildiği gibi heksoz için HexNAc göreceli düşük bir verim (toplam HexNAc + heksoz sinyalinin 11.3%, toplam yerine% 50) açıklar. Özellikle, bu nispeten lHexNAcs ve ower verimi karmaşık Biosıvılar ve dokularda tespit veya büyük, karmaşık glukanlardır (örneğin, 2,4-Man, 2,6-Man, 3,4,6 türetilen glikan düğümlerin kolay algılanmasını engelleyecek onları zor yapmaz -Man ve 3,4-GIcNAc, Şekil 2). 33 glıkan düğüm XIC pik alanları normalleştirilir biçimi göz önüne alındığında, (adım 6.3), sürece, her bir HexNAc nispi verimi diğer HexNAcs tutarlı göreli (kalır öyle ki, elde edilebilir, farklı numuneler arasında farklı HexNAcs nispi miktarları Tablo 1), yararlı bilgiler bkz. Bu durum, heksozların için de geçerlidir. Sürekli her parti QC örnek (ler) in dahil ile izlenen bir fenomen - Ayrıca, daha önce HexNAcs için heksozların oranları uyumlu sayısal davranışı, 33 Ekran göstermiştir.

permethylation gerçekleştirilir şekli üzerinde en büyük etkiye sahipHexNAc PMAAs genel verimi ve tekrarlanabilirlik. Özellikle, büyük bir özenle tamamen sulu koşullar alkali için permetilatlı glukanlardır maruz kalmasını önlemek için önlem alınmalıdır. Bu konuda iki önemli adımlar 1 olan) ((Adımlar 1.3.13 ve 1.3.14) arkasında spin-yoluyla çözümler tüm beyaz çökelti bırakarak ve fosfat tampon eklenir kez 2) hemen spin-yoluyla çözümler karıştırma ) 1.3.13 ve 1.3.14 Adımları. Bir tampon yerine basit tuz çözeltisi, bu aşamada, sulu çözelti istenmeyen alkalizasyonunu önlemek için daha sonra sıvı / sıvı ekstraksiyon adımları için dahil edilir. Bu alkalin koşullar altında HexNAcs arasında metil ve asetillenmiş 2-amino grubunun asetil grubu kloroform ilişkili glıkanın genel ekstraksiyon etkinliğini azaltan bir daha polar sekonder amin ile sonuçlanan hidrolize olabilir şüpheli.

başarısız permetilatlı HexNAcs en kolay tanınabilir özelliği4-bağlı GlcNAc (4-GlcNAc) 6-Gal, 3,6-Man kişilerce kromatografik tepesinin yoğunluğu ve son sütun bir pişirme (Şekil 3) sırasında arka taban çizgisi şiddeti. 4-GlcNAc PMAA mutlak zenginliği düşük olduğundan, diğer HexNAcs olan normalize bolluğu göre, aynı zamanda (en belirgin) 3,4-GlcNAc eşlik eden bir artış ile, düşük olma eğilimindedir.

Genel verim ve tahlil sağlamlığını optimize etmek için tasarlanmış bir kaç değişiklik bizim ilk yayın bu analitik bir yaklaşım açıklayan beri yapılan bu değişikliklerin 33 biri entegre çıkarılan iyon kromatogramları (XICs) normalize olduğu yoludur. Basitlik için, Şimdi tüm heksoz XIC alanlarının toplamına her heksoz XIC alanı bölmek; Benzer şekilde, her bir HexNAc XIC alan tüm HexNAc XIC alanlarının toplamı bölünür. Tablo 1, genel olarak analizler arası / içi analisti reproducibil görüldüğü gibikendi heksoz veya HexNAc sinyali ortalamalara% 13 CV 1> için% katkıda bulunan tüm glıkan düğümler için Sığ.

Bildiğimiz kadarıyla, bu glukanlardır ilk bozuldu ve daha sonra onların takımları glıkan kompozisyon kantitatif numune çapında portresini oluşturmak için analiz hangi gerçekten aşağıdan yukarıya Glikomik tek enkarnasyonu. Burada, bunun yerine geleneksel enzimatik sürümü, permethylation süreci olmayan indirgenerek ortadan kaldırır (sürümler) O kendi proteinler, N -bağlı ise 40 glukanlardır asit hidroliz sırasında serbest bırakılır. 33 geleneksel yukarıdan aşağıya Glikomik tamamlayıcı bir yaklaşım olarak gelen -bağlantıh glukanlardır Bu yaklaşım, tek bir analitik sinyalleri (bakınız 4,6-GIcNAc "içine dallanma p 1-6" "göbek fukosilasyonu", "6-sialilasyon", "GIcNAc'nin", ve benzeri gibi ilgi duyulan tek glıkan özelliklerini havuz edebilmektedir Şekil 2'de 6-Gal, 3,4,6-Erkek ve 2,6-Man düğümler, respectively). Geleneksel yukarıdan aşağıya yaklaşımlarda, sonuçta bir veya iki anahtar glikoziltransferazların 33 benzersiz faaliyetleri bağlıdır Bu gibi özellikler, tipik bozulmamış glukanlardır onlarca dağılmış ve bazen (örneğin, 3-Sıyalılasyon vs çözmek zor veya imkansız olabilir bazı bozulmamış glıkan kitlelerin yozlaşmaya bağlı olarak 6-Sıyalılasyon). Ayrıca, burada sunulan aşağıdan yukarıya yaklaşım, non-invaziv akciğer kanserini saptamada ilk söz göstermiştir. 33 ileri çalışmalar diğer kanser türleri tespit ilişkin bu ilk bulguları yanı sıra henüz ek yayınlanmamış sonuçlar doğrulamak için çalışmalar devam etmektedir.

Burada anlatılan yaklaşımın en büyük sınırlamasının bu önceden izole glikoproteinleri uygulanacak olsaydı, algılama sınırlarının bakımından kısıtlı olmasıdır. taşıyıcı protein olmadan bireysel glıkan standartların yayınlanmamış analizleri, miktarının sınırları fo dayalır bireysel glukanlardır düşük mikrogram aralığında yalan görünür. Bunlar mutlak anlamda düşük LOQs yoluyla, ama bu gerçeği deneyi-için tasarlanmış ve amaçları burada açıklanan en az için (düşük LOQs elde etmek için ihtiyacı yoktur değildi ve başlangıçta amaçlanan kapsamı bakımından önemli değil Daha önceki yayında 33) 'de. Aslında, insan plazma / serum 10s glikoproteinleri içeren mg / ml konsantrasyon aralığı niyetli kan plazması / serum analizi için biz sadece son örnek hacmi ~ 1/100 th enjekte ve 41 parça arasından 40 bölmek olduğunu bu küçük bir miktar GC enjektör limanda atık. Bu uygulama olmadan, glikan düğümler bazı dedektör doyurabilecek. geleneksel yukarıdan aşağıya MALDI-MS veya LC-MS temelli yaklaşımlar yoluyla yeterli bozulmamış glıkan sinyaller üretebilir glikoproteinlerin pikomol miktarları bu yaklaşımla tespit edilemez. metodolojinin daha rafine bu sınırlama düzeltmek için çalışmalar sürdürülmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide beads  367176 Sigma-Aldrich  20-40 mesh, reagent grade 97%
0.9 ml Spin column 69705 Pierce division of ThermoFisher Scientific  Includes  plugs and polyethylene frits 
GC-MS autosampler vial (silanized)* C4000-9 ThermoFisher Scientific Target DP High Recovery Vial, 1.5 ml, 12 mm x 32 mm, includes Teflon-lined pierceable caps
1.5 ml polypropylene test tubes 05-402-25 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
2 ml polypropylene test tubes 05-408-138 ThermoFisher Scientific  Snap-cap lid
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) D8418 Sigma-Aldrich  BioReagent for molecular biology, reagent grade >99.0%
Iodomethane  I8507 Sigma-Aldrich  Contains copper as stabilizer, ReagentPlus 99%
Acetonitrile A955-4 ThermoFisher Scientific  Optima LC/MS
Microcentrifuge 75002436: Sorvall Legend Micro 17 Centrifuge ThermoFisher Scientific  24 x 1.5/2.0 rotor with ClickSeal biocontainment lid. Rotor catalog number: 75003424
13 x 100 glass test tube (silanized)* 53283-800 VWR 13 mm x 100 mm borosilicate glass test tubes with screw-cap finish
Caps for glass test tubes 14-930-15D ThermoFisher Scientific  Kimble™ Black Phenolic Screw Caps; 13 mm-415 GPI thread; PTFE-faced rubber liner.
Sodium chloride  S7653 Sigma-Aldrich  >99.5% pure
Chloroform 4440-08 Macron Fine Chemicals 
Trifluoroacetic acid  299537 Sigma-Aldrich  99% purified by redistillation for protein sequencing 
Sodium borohydride 71321 Fluka Analytical  99%
Ammonium hydroxide solution  320145 Sigma-Aldrich  NH3 content: 28.0-30.0%
Methanol AH230-4 Honeywell Burdick & Jackson HPLC grade
Acetic acid  320099 Sigma-Aldrich  99.70%
Plastic vacuum desiccator  Any model of adequate size FoodSaver
Acetic anhydride  539996 Sigma-Aldrich  99.50%
Dichloromethane  D143SK-4 ThermoFisher Scientific  Stabilized HPLC grade
Acetone  9006-03 J.T.Baker Baker Analyzed 
Heated evaporation manifold (main unit) pi18823 ThermoFisher Scientific  Thermo Scientific* Reacti-Therm* Heating and Stirring Module; Triple-block Model with Heating and Stirring Function
Heated evaporation manifold (overhead evaporator) pi18826 ThermoFisher Scientific  ThermoScientific* Reacti-Vap Evaporator, 27-port; For use with triple-block Reacti-Therm heating module
Aluminum sample-holder blocks for evaporation manifold pi18816 ThermoFisher Scientific  Block, Aluminum, Reacti-Block S-1, Holds 13 mm dia test tubes, 13 holes (14 mm dia. x 45 mm deep)
Gas chromatograph Model A7890 Agilent  Equipped with CTC PAL autosampler
Mass spectrometer  GCT Premier (Time-of-Flight) Waters 
Split-mode liner (deactivated / silanized) 5183-4647 Agilent Containing a small plug of silanized glass wool
DB-5ms GC column 122-5532 Agilent 30 m x 0.25 mm ID x 0.25 micron film thickness
Chlorotrimethylsilane 95541 Sigma-Aldrich 
Glass vacuum desiccator (for glassware silanization) EW-06536-30 Cole-Parmer 12" wide; 230 mm plate size
*Glassware silanization is carried out in-house, overnight using chlorotrimethylsilane vapor in a large glass vacuum desiccator.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, M., Song, L., Qin, X. Glycan changes: cancer metastasis and anti-cancer vaccines. J Biosciences. 35 (4), 665-673 (2010).
  2. Stanley, P., Schachter, H., Taniguchi, N. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 8: N-Glycans (2009).
  3. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochim Biophys Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  4. Brockhausen, I., Schachter, H., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 9: O-GalNAc Glycans (2009).
  5. Rini, J., Esko, J., Varki, A. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 5: Glycosyltransferases and Glycan-processing Enzymes (2009).
  6. Gercel-Taylor, C., Bazzett, L. B., Taylor, D. D. Presence of aberrant tumor-reactive immunoglobulins in the circulation of patients with ovarian cancer. Gynecol Oncol. 81 (1), 71-76 (2001).
  7. An, H. J., et al. Profiling of glycans in serum for the discovery of potential biomarkers for ovarian cancer. J Proteome Res. 5 (7), 1626-1635 (2006).
  8. Kanoh, Y., et al. Changes in serum IgG oligosaccharide chains with prostate cancer progression. Anticancer Res. 24 (5B), 3135-3139 (2004).
  9. Kyselova, Z., et al. Alterations in the serum glycome due to metastatic prostate cancer. J Proteome Res. 6 (5), 1822-1832 (2007).
  10. Okuyama, N., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel marker for pancreatic cancer: a detailed analysis of the oligosaccharide structure and a possible mechanism for fucosylation. Int J Cancer. 118 (11), 2803-2808 (2006).
  11. Zhao, J., et al. Glycoprotein microarrays with multi-lectin detection: unique lectin binding patterns as a tool for classifying normal, chronic pancreatitis and pancreatic cancer sera. J Proteome Res. 6 (5), 1864-1874 (2007).
  12. Comunale, M. A., et al. Proteomic analysis of serum associated fucosylated glycoproteins in the development of primary hepatocellular carcinoma. J Proteome Res. 5 (2), 308-315 (2006).
  13. Goldman, R., et al. Detection of Hepatocellular Carcinoma Using Glycomic Analysis. Clin Cancer Res. 15 (5), 1808-1813 (2009).
  14. Aurer, I., et al. Aberrant glycosylation of Igg heavy chain in multiple myeloma. Coll Antropol. 31 (1), 247-251 (2007).
  15. Abd Hamid, U. M., et al. A strategy to reveal potential glycan markers from serum glycoproteins associated with breast cancer progression. Glycobiology. 18 (12), 1105-1118 (2008).
  16. Kyselova, Z., et al. Breast cancer diagnosis and prognosis through quantitative measurements of serum glycan profiles. Clin Chem. 54 (7), 1166-1175 (2008).
  17. Hongsachart, P., et al. Glycoproteomic analysis of WGA-bound glycoprotein biomarkers in sera from patients with lung adenocarcinoma. Electrophoresis. 30 (7), 1206-1220 (2009).
  18. Arnold, J. N., et al. Novel glycan biomarkers for the detection of lung cancer. J Proteome Res. 10 (4), 1755-1764 (2011).
  19. Bones, J., Mittermayr, S., O'Donoghue, N., Guttman, A., Rudd, P. M. Ultra performance liquid chromatographic profiling of serum N-glycans for fast and efficient identification of cancer associated alterations in glycosylation. Anal Chem. 82 (24), 10208-10215 (2010).
  20. Kodar, K., Stadlmann, J., Klaamas, K., Sergeyev, B., Kurtenkov, O. Immunoglobulin G Fc N-glycan profiling in patients with gastric cancer by LC-ESI-MS: relation to tumor progression and survival. Glycoconj J. 29 (1), 57-66 (2012).
  21. Chen, G., et al. Human IgG Fc-glycosylation profiling reveals associations with age, sex, female sex hormones and thyroid cancer. J Proteomics. 75 (10), 2824-2834 (2012).
  22. Takeda, Y., et al. Fucosylated haptoglobin is a novel type of cancer biomarker linked to the prognosis after an operation in colorectal cancer. Cancer. 118 (12), 3036-3043 (2012).
  23. Parekh, R. B., et al. Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG. Nature. 316 (6027), 452-457 (1985).
  24. Mehta, A. S., et al. Increased levels of galactose-deficient anti-Gal immunoglobulin G in the sera of hepatitis C virus-infected individuals with fibrosis and cirrhosis. J Virol. 82 (3), 1259-1270 (2008).
  25. Horvat, T., Zoldoš, V., Lauc, G. Evolutional and clinical implications of the epigenetic regulation of protein glycosylation. Clinical Epigenetics. 2 (2), 425-432 (2011).
  26. Zoldoš, V., Novokmet, M., Bečeheli, I., Lauc, G. Genomics and epigenomics of the human glycome. Glycoconj J. 30 (1), 41-50 (2013).
  27. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu Rev Biochem. 72, 643-691 (2003).
  28. Tuccillo, F. M., et al. Aberrant Glycosylation as Biomarker for Cancer: Focus on CD43. Biomed Res Int. , (2014).
  29. Varki, A., Kannagi, R., Toole, B. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch. 44: Glycosylation Changes in Cancer (2009).
  30. Brockhausen, I. Mucin-type O-glycans in human colon and breast cancer: glycodynamics and functions. EMBO reports. 7 (6), 599-604 (2006).
  31. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  32. Bertozzi, C. R., Sasisekharan, R. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. Ch 48 Glycomics (2009).
  33. Borges, C. R., Rehder, D. S., Boffetta, P. Multiplexed surrogate analysis of glycotransferase activity in whole biospecimens. Anal Chem. 85 (5), 2927-2936 (2013).
  34. Mcinnes, A. G., Ball, D. H., Cooper, F. P., Bishop, C. T. Separation of Carbohydrate Derivatives by Gas-Liquid Partition Chromatography. J Chromatogr. 1 (6), 556-557 (1958).
  35. Ciucanu, I., Caprita, R. Per-O-methylation of neutral carbohydrates directly from aqueous samples for gas chromatography and mass spectrometry analysis. Anal Chim Acta. 585 (1), 81-85 (2007).
  36. Ciucanu, I., Kerek, F. A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates. Carbohydr Res. 131, 209-217 (1984).
  37. Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Solid-phase permethylation of glycans for mass spectrometric analysis. Rapid Commun Mass Sp. 19 (23), 3421-3428 (2005).
  38. Kang, P., Mechref, Y., Novotny, M. V. High-throughput solid-phase permethylation of glycans prior to mass spectrometry. Rapid Commun Mass Sp. 22 (5), 721-734 (2008).
  39. Goetz, J. A., Mechref, Y., Kang, P., Jeng, M. H., Novotny, M. V. Glycomic profiling of invasive and non-invasive breast cancer cells. Glycoconj J. 26 (2), 117-131 (2009).
  40. Goetz, J. A., Novotny, M. V., Mechref, Y. Enzymatic/chemical release of O-glycans allowing MS analysis at high sensitivity. Anal Chem. 81 (23), 9546-9552 (2009).
  41. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York. Ch. 47: Structural Analysis of Glycans (2009).
  42. Seed, B. Silanizing glassware. Curr Protoc Immunol. 21, A.3K.1-A.3K.2 (1997).
  43. Stellner, K., Saito, H., Hakomori, S. I. Determination of aminosugar linkages in glycolipids by methylation. Aminosugar linkages of ceramide pentasaccharides of rabbit erythrocytes and of Forssman antigen. Arch Biochem Biophys. 155 (2), 464-472 (1973).

Tags

Kimya Sayı 111 Glycobıology glikanlar glikosiltransferaz kanser permethylation kütle spektrometrisi (MS) gaz kromatografisi (GC) glikoproteinler,
Glycan Düğüm Analizi: Glikomik A Aşağıdan yukarı Yaklaşım
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y.,… More

Zaare, S., Aguilar, J. S., Hu, Y., Ferdosi, S., Borges, C. R. Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics. J. Vis. Exp. (111), e53961, doi:10.3791/53961 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter