Summary
والغرض من هذا البروتوكول هو للتدليل على تقنيات العزل وثقافة الخلايا الأولية الفئران الأوعية الدموية العضلات الملساء (VSMCs) من الدورة التاجية. مرة واحدة وقد تم عزل VSMCs، ويمكن استخدامها في العديد من تقنيات زراعة القياسية.
Abstract
في حين تم تأسيس العزلة والثقافة من خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSMCs) من السفن الكبيرة بشكل جيد، وسعينا إلى عزل والثقافة VSMCs من الدورة التاجية. أزيلت قلوب مع أقواس الأورطي سليمة وperfused عبر Langendorff الوراء مع حل الهضم تحتوي على 300 وحدة / مل من نوع كولاجيناز الثاني، 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين فول الصويا و 1 M CaCl 2. وقد تم جمع perfusates في 15 دقيقة فترات لمدة 90 دقيقة، مكعبات بواسطة الطرد المركزي، معلق في وسائل الإعلام والطلاء، ومطلي على أطباق زراعة الأنسجة. تميزت VSMCs التي كتبها جود SM22α، α-SMA، وفيمنتين. واحدة من أهم مزايا استخدام هذه التقنية هو القدرة على عزل VSMCs من الدورة التاجية للفئران. على الرغم من أن عدد قليل من الخلايا التي تم الحصول عليها يمكن أن تحد من بعض التطبيقات التي يمكن استخدامها الخلايا، VSMCs التاجي معزولة يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من تقنيات زراعة الخلايا راسخة وأسايس. يمكن لدراسات التحقيق VSMCs من الفئران المعدلة وراثيا توفر مزيد من المعلومات حول بنية وظيفة ويشير العمليات المرتبطة بأمراض الأوعية الدموية.
Introduction
والهدف من هذه الطريقة هو عزل خلايا الأوعية الدموية العضلات الملساء (VSMCs) من الدورة التاجية الفئران لاستخدامها في زراعة الخلايا وتجارب زراعة الخلية القياسية. قمنا بتطوير هذه التقنية لتقييم الآليات الجزيئية لإعادة الأوعية الدموية في مرض السكري. لقد ذكرت سابقا الداخل إعادة الضخامي في الشرايين التاجية الحاجز في نموذج الفأر ديسيبل / ديسيبل من مرض السكري 1. ويرجع ذلك إلى كمية محدودة من الأنسجة الموجودة في التاجية الحاجز الفئران، وتقنيات تجريبية قياسية التحقيق التغييرات البروتين (مثل لطخة غربية) في الفئران ديسيبل / ديسيبل والسيطرة صعبة في أحسن الأحوال. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا سابقا أن مانع مستقبلات أنجيوتنسين (ARB) اللوسارتان يقلل من إعادة عرض لوحظت في الفئران ديسيبل DB / 2. لذلك، عزل VSMCs الابتدائية من الدورة التاجية يسمح لنا لمواصلة التحقيق التغيرات في النمط الظاهري VSMC أو مسارات تنشيط يشير في الفئران من السكري، والتي قد تكون contribuتينغ إلى سلبي إعادة شرين التاجي.
وإجمال العديد من الدراسات مسارات الإشارات الكنسي باستخدام VSMCs معزولة من الشريان الأورطي القوارض، وليس في كل سرير الأوعية الدموية محددة. ومع ذلك، لقد أثبتنا الأوعية الدموية سريرا إعادة محددة في التاجي، الأبهر، والتداولات المساريقي من ديسيبل الفئران ديسيبل / 1، مما يشير إلى VSMCs في كل سرير الأوعية الدموية قد يكون مختلفا. وبالتالي، فمن الضروري عزل VSMCs من كل سرير الأوعية الدموية من أجل فهم أفضل للتغيرات المرضية التي تحدث في كل مجموعة من VSMCs. وهناك عدد كبير من الطرق المختلفة لعزل وزراعة VSMCs الأبهر. ومع ذلك، في الوقت الراهن، هناك دراسة واحدة فقط التي تم نشرها على عزل VSMCs من الماوس التاجي تداول 3. تنغ وآخرون. كان أول من أشار إلى وسيلة لعزل VSMCs من الماوس الدورة الدموية التاجية. ومع ذلك، قمنا بتعديل البروتوكول بشكل كبير لأنها أيضا معزولة سل البطانيةليرة سورية. وقد استخدمت مختبرات أخرى أيضا البروتوكول من تنغ وآخرون لعزل myocytes الشرايين التاجية والهوائية خلايا العضلات الملساء 4،5. فإن التعديلات أدخلنا تسفر عن مجموعة من الخلايا التخصيب لVSMCs من الدورة التاجية.
نضح الوراء من قلب الثدييات معزولة، أو تقنية Langendorff، وقد تم تأسيسها في عام 1897 6 أوسكار Langendorff، ولا يزال يستخدم على نطاق واسع اليوم لعزل خلايا القلب والأوعية الدموية. تقنية المعروضة هنا، إلى جانب النهوض التعديلات الجينية الفئران الحديثة، ويوفر أداة قيمة لتوثيق التحقيق في سلوك الجزيئي للVSMCs من الدورة التاجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: أجريت هذه الدراسة وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية، وتمت الموافقة من قبل مؤسسة رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في مستشفى الصعيد الوطني للطفولة.
1. إعداد / إعداد
ملاحظة: هذه التقنية العزلة يتطلب ملفين Langendorff التدفئة وضعه جنبا إلى جنب على موقف حلقة، ومتصلة بالتوازي مع حمام الماء المتداولة.
- بدوره على تعميم حمام مائي وضبط درجة الحرارة إلى تحقيق درجة الحرارة النهائية من 33-34 درجة مئوية في غيض من قنية Langendorff (حمام المياه المستخدمة في هذا انشاء تعيين إلى 40 درجة مئوية بسبب فقدان C 6-7 ° في درجة الحرارة عبر الأنابيب). تشغيل مضخات نضح وتحديد معدل نضح إلى 0.5 مل / دقيقة.
- تنظيف كل من لفائف التدفئة تغلف المياه، وأنابيب المرفقة وقياس 25 قنية عن طريق تنظيف كل مع 50 مل من الايثانول 70٪، تليها 100 مل من الماء عالى النقاء تعقيمها.
- مسح ملفات التسخينعن طريق دفع الهواء مع حقنة ويغسل مع 10 مل من هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) دون أحمر الفينول. ترك HBSS في ملفات التسخين والأنابيب.
- إرفاق العقيمة 10 مل LUER قفل حقنة مليئة درجة حرارة الغرفة HBSS دون الفينول الأحمر إلى الأنابيب. ضمان عدم وجود فقاعات الهواء محاصرون داخل الأنابيب والتدفئة لفائف عندما ربط حقنة مليئة HBSS-لأن ذلك قد يسبب الصمات الهواء أثناء عملية الهضم أن تؤثر سلبا على العزلة VSMC.
- إزالة قنية قياس 25 من لفائف التدفئة ومكان على العقيمة حقنة 10 مل أخرى مليئة الجليد الباردة HBSS دون الفينول الأحمر. الحفاظ على هذا على الجليد حتى جاهزة للاستخدام. أكرر للقنية أخرى.
- إعداد انزيم الهضم الحل.
- تزن نوع كولاجيناز 2 وفقا لعدد الكثير محدد ل75 مل من محلول الهضم لتحقيق تركيز النهائي من 300 وحدة / مل.
- حل كولاجيناز في 75 مل من HBSS مع الفينول الأحمر. المقبل، إضافة 1.5 مل من 00.1 ملغ / مل مثبط التربسين فول الصويا و 75 ميكرولتر من 1 M CaCl 2 إلى الخليط.
- في حالة استخدام الحل الهضم فورا، الحارة إلى 37 درجة مئوية. إن لم يكن، وضعه في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 ساعات. يجب أن يتم هذا الحل الطازجة يوميا.
- إعداد وسائل الإعلام توقف الحل / الطلاء.
- إضافة 100 مل الحرارة المعطل FBS و 5 مل من L-الجلوتامين، 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل من HEPES، و 1 مل من primocin إلى 500 مل من ارتفاع نسبة الجلوكوز (4.5 جم / لتر) DMEM. ويوصى تصفية التعقيم.
- قسامة 6 مل من محلول توقف في كل من اثني عشر أنابيب مخروطية 15 مل، مرقمة A1-A6 و B1-B6، ومكان في 4 درجات مئوية. قسامة 50 مل من توقف الحل في المخروطية 50 مل ومكان في الحاضنة 37 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أيضا أن هذه الخطوة تكون مستعدة في اليوم السابق للعزلة إذا لزم الأمر. وسوف تستخدم هذا الحل وقف مثل وسائل الإعلام الطلاء بعد عزل الخلية.
- إعداد اثنين 1 مل الحقن مجهزة 30 إبرة Gمع 100 ميكرولتر من الهيبارين (1000 وحدة / مل).
- قطع قطعة 5 سم من 5-0 الحرير الجراحي. ربط عقدة الذراع فضفاض في الحرير الجراحي مع نهاية واحدة مرتين ما دام الآخر. مكان على قنية عيار 25، ولكن لا تشديد. كرر لأخرى 25 G قنية.
- ملء أربعة 35 ملم أطباق بتري معقمة (# 1-4) مع 2 مل من عقيم، المثلج، HBSS دون الفينول الأحمر. الحفاظ على الجليد.
2. القتل الرحيم، عزل القلب وكيفية تركيب الكانيولا
- قبل عزلة القلب، وضمان أن الحل الهضم والمخروطية 50 مل من توقف حل الحارة. إزالة حقنة مليئة HBSS مع المرفقة 25 G قنية من الجليد ووضعه في السحاحة المشبك (أو المشبك حلقة الحامل) على موقف حلقة.
- تخدير الفئران باستخدام 3٪ آيزوفلوران. تأكيد هو تخدير الماوس عن طريق لمسة إصبع على كل أطرافه الخلفية. إذا كان تشنجات الساق، والماوس لا تخدير بعد ذلك انتظر 1 دقيقة، وتكرار لمسة إصبع.
- فضح حبل الوريد عن طريق إزالة الفراءالجلد الثاني على الجزء الأمامي من الرقبة مع مقص. المقبل، واستخدام الملقط لإزالة بعناية أي الدهون المحيطة حبل الوريد. بعد إزالة الدهون، حقن ببطء 100 ميكرولتر من الهيبارين (1000 وحدة / مل). وضع اسفنجة جراحية خلال الوريد لتجنب النزيف.
- بعد 1 دقيقة والصدر المفتوح لفضح القلب، ورفع القلب مع ملقط المنحنية والمكوس باستخدام مقص، والتأكد من الحفاظ الأبهر الصاعد سليمة من خلال فرع عضدي رأسي الأول. المكان على الفور القلب في طبق 35 ملم (رقم 1) مع الجليد الباردة HBSS دون الفينول الأحمر وشطف.
ملاحظة: إجراء 4 خطوات التالية باستخدام نطاق تشريح. - ضع G قنية 25 التي شنت على عصابة تقف في زاوية 45 درجة بحيث يقع على طرف فقط تحت سطح الجليد الباردة HBSS في صحن رقم 2 ويكون مرئيا من خلال المجهر تشريح بشكل واضح. نقل القلب إلى صحن رقم 2.
- باستخدام ملقط دومون، فضح الشريان الأورطي عن طريق إزالة بلطف الدهنية الزائدة عن طريق تشريح حادة إلى pتعطيب revent أو تمزق الشريان الأورطي. المقبل، واستخدام ملقط لحرك الشريان الأبهر فوق G قنية 25.
- توجيه قنية الهبوط من خلال الشريان الأورطي، وثيق، ولكن ليس أبعد من الصمام الأبهري، والتي سوف تؤثر سلبا على سلامة صمام وبالتالي، نضح الوراء. مرة واحدة قنية في مكان، حرك الحرير وتعادل قبل أكثر من الشريان الأورطي، وتشديد. ربط عقدة ثانية لتشكيل عقدة مربعة حول الشريان الأورطي لتأمين القلب.
- مرة واحدة يتم ربط الشريان الأورطي آمن، تدفق بلطف الدم المتبقية من الدورة الدموية التاجية مع HBSS الجليد الباردة في الحقنة التي تعلق على G قنية 25. الحرص على عدم دفع أكثر من اللازم لتجنب الضغط المفرط التاجي. فقط بحاجة لتدفق بطيء جدا ولطيف لاستكمال مطاردة. ويمكن أيضا إقناء؛ إدخال القنية الأبهر مجانا للتسرب ملاحظتها خلال هذا الاحمرار لطيف.
- بدوره على مضخة نضح لبدء تدفق HBSS. إزالة G قنية 25 (مع قلب المرفقة) من حقنة مليئة HBSS، مع الحرص علىالحفاظ على مركز قنية مليئة HBSS، وتوصيله إلى الحارة لفائف التدفئة شغل HBSS. يبدأ نضح القلب مع مضخة نضح بمعدل 0.5 مل / دقيقة لمدة 8 دقائق.
- بعد مقنى القلب الأول، ويجري perfused على النظام، كرر الخطوات من 2،1-2،8 للقلب الثاني. سيتم على مراحل هذه العزلة عن كل القلب ومن ثم يطلب من التخطيط الدقيق والتوقيت.
3. الهضم
- بعد التنظيف مع HBSS، تغيير 10 مل HBSS حقنة حاليا على مضخة واحدة مليئة 10 مل من محلول الهضم قبل تحسنت. يروي كل قلب مع حل الهضم لمدة 12 دقيقة بمعدل 0.5 مل / دقيقة. لا جمع الكسور الناجمة عن هذا الهضم الأول حيث سيؤدي ذلك إلى احتواء أي دم بقايا والخلايا البطانية.
- بعد 12 دقيقة، تغيير معدل نضح إلى 0.4 مل / دقيقة، ووضع مخروطي 15 مل (أنبوب A1 أو B1، الموافق قلب الأول أو الثاني لكل الهضم) مليئة البارد توقف solutأيون في دلو الجليد تحت القلب من أجل البدء في التخصيب VSMC جمع سائل الإرواء.
- بعد 15 دقيقة، تغيير المخروطية جمع لأنبوب A2 أو B2 والمخروطية تدور أنبوب A1 و B1 في 89 x ج لمدة 10 دقيقة على الفور بعد جمع كل من الكسور. عندما حقنة مليئة الحل الهضم على مضخة لديه أقل من 1 مل من محلول، مع استبدال شغلها طازجة حقنة 10 مل من محلول الهضم.
- بعد الطرد المركزي، ونضح طاف من كل أنبوب جمع، وترك ما يقرب من 0.5 مل. Resuspend بيليه من A1 مع 2 مل من محلول توقف الدافئة (أو طلاء وسائل الإعلام). إضافة إعادة تعليق من أنبوب A1 إلى أنبوب B1 ومكان أنبوب في الحاضنة 37 درجة مئوية مع غطاء فضفاض.
- كرر الخطوات من 3.3 و 3.4 حتى جميع الأنابيب (من خلال A6 و B6) تستخدم لفترة ما مجموعه 90 دقيقة جمع. في 80 دقيقة من عملية الهضم، وقطع فتح ذروة القلب لطرد أي الخلايا التي قد تكون محاصرين داخل البطين، وجمع هذه الخلايا في A6 أنبوب وB6، respectively.
ملاحظة: أحيانا قلب سوف تسقط قنية السابقة إلى نقطة زمنية 90 دقيقة. إذا حدث هذا، استرداد القلب والمكان الى العقيمة 35 ملم طبق بتري مليئة 2 مل من محلول الهضم. قطع ذروة القلب وشطف بلطف القلب مع حل الهضم. التالي، تصفية 2 مل من محلول الهضم من خلال العقيمة 100 ميكرومتر مصفاة الخلية في 50 مل المخروطية وإضافة إلى A6 أنبوب أو B6. - بعد كل دورة من أنابيب اللاحقة (A2 و B2)، إضافة VSMCs معلق في أنبوب جمع السابق (جنبا إلى جنب A1 و B1). أيضا، والحرص على عدم ترك حل الهضم في مضخة نفد وتبديل 10 مل الحقن اللازمة في جميع انحاء الهضم.
- بعد يتم الجمع بين جميع الأنابيب، أجهزة الطرد المركزي تعليق-VSMC الغنية في 89 x ج لمدة 10 دقيقة.
- نضح قدر طاف من أنابيب جمع ممكن. Resuspend وبيليه المتبقية في 2 مل من الطلاء وسائل الاعلام ولوحة على واحد صحن الثقافة 35 مم. مكان الطبق الثقافة طن 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 24 ساعة.
الثقافة 4. خلية
ملاحظة: أكمل الخطوات المتبقية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
- بعد 24 ساعة، ونضح بلطف وسائل الإعلام الطلاء. إن ثقافة وعادة ما يكون كمية كبيرة من الحطام. لغسل الخلايا، إضافة 2 مل من الحارة، برنامج تلفزيوني العقيمة والاستفادة بلطف الطبق ضد اثنين من أصابع في حين تناوب في حركة عقارب الساعة.
- بعد الدوران 360 درجة، نضح في برنامج تلفزيوني وأكرر مرة ثانية. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة آخر 2 مل من عقيم، PBS الدافئ. تحقق الطبق الثقافة تحت المجهر للتأكد من وجود قليل من دون الحطام على طبق من ذهب. ويمكن أيضا التقاء خلية يتحدد في هذا الوقت.
- إذا بقي الحطام في الطبق الثقافة، كرر الخطوة 4.2. إذا طبق ثقافة واضح من الحطام، ونضح برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من وسائل الاعلام الطلاء الدافئ.
- بعد 24 ساعة، وغسل الخلايا مرة أخرى مع دافئ، برنامج تلفزيوني العقيمة لإزالة أي حطام النهائي أو الخلايا الميتة من الثقافة. نضح في برنامج تلفزيوني وصالحذاء 2 مل أخرى من وسائل الاعلام الطلاء دافئة على الخلايا.
- تحقق من الخلايا كل يوم وتغذية كل 48 ساعة مع وسائل الإعلام تصفيح درجة حرارة جديدة. في هذه المرحلة، والخلايا يمكن استخدامها لتجارب زراعة الخلية القياسية. وينبغي أن يكون VSMCs ما يقرب من 80٪ متموجة 4-5 أيام بعد الطلاء، على الرغم من أن قد يستغرق ما يصل إلى 7 أيام حتى يتم الكمال الداخلي. إذا التقسيم إلى فقرات لاحقة، واستخدام الحد الأقصى من 1: 4 35 أطباق ملم (أو إلى منطقة مماثلة من الأطباق الثقافة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرجع ذلك إلى جانب رواية لدينا التاجية تقنية VSMC العزلة، سعينا إلى تحديد نقاء العزلة الخلية. وقد تم تحديد الماوس VSMCs التاجي على أساس من التشكل والمناعي تلطيخ حتى مرور 2. بناء على التشكل من الخلايا في الثقافة بعد غسل الأولى، وإجراء العزل يزيل بشكل فعال myocytes القلب والخلايا البطانية. وVSMCs الاحتفاظ التشكل حتى مرور 2 (الشكل 1). ومع ذلك، هناك احتمال للتلوث من الخلايا الليفية الغلالة البرانية ومتداخلة. استبعاد هذا نخلط المحتملين، نحن صبغ الخلايا المعزولة عن SM22α،-α العضلات الملساء الأكتين (α-SMA)، وكلاهما VSMC علامات 7،8، وفيمنتين، علامة الليفية 9، في الممرات 1-2 (الشكل 2). لاحظنا أي تغيير من هذه العلامات من خلال مرور 2. نحن أيضا إظهار أن لدينا العزلة الخلية خالية من CD31 / PECAM تلطيخ (كورون البشريخلايا آرى الاوعية الدموية الدقيقة البطانية تستخدم كعنصر تحكم إيجابية)، مما يدل على عدم وجود تلوث الخلية البطانية باستخدام هذا البروتوكول العزلة. بشكل جماعي، ونحن إجراء العزل خلية غلة السكان نقية تقريبا VSMCs من الدورة التاجية، ويمكن أن تستخدم الآن لمزيد من التجارب.
الشكل 1: الممثل VSMCs التاجي مثقف VSMCs مثقف التاجي (مرور 2) معزولة عن ديسيبل / الفئران ديسيبل متخالف تصويرها في 10X التكبير في ظل ظروف النقيض من المرحلة الميدانية مشرق. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Immunoflتلطيخ uorescence من VSMCs التاجي مثقف. مطلي VSMCs التاجي من متخالف (ديسيبل / ديسيبل) الفئران في الممرات 1-2 المسمى مع الأجسام المضادة للSM22α، α-SMA، فيمنتين، وCD31 / PECAM. الصور التي اتخذت في التكبير 10x. ولم يلاحظ أي تغيير كبير مع مرور. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وكان الغرض من هذه الدراسة هو التكيف مع بروتوكولات العزل الخلية الحالية لزيادة الغلة من التاجي والأوعية الدموية على نحو سلس من قلوب الفئران. تم تنفيذ أكثر من عمل رائد في الأوعية الدموية البيولوجيا العضلات الملساء مع مثقف الفئران الأبهر خلايا العضلات الملساء. قدمت هذه الدراسات المعرفة الأساسية من الآليات الجزيئية التي تتحكم في نمو VSMC والهجرة وتضخم 7. لكن، وكما تقدم الميدان، أصبح من الواضح أن VSMC النمط الظاهري وظيفة كان يسيطر عليها عدد من العوامل المحددة السرير الوعائي. على سبيل المثال، مقارنة مع السفن المحيطية والشرايين التاجية عرض الردود وظيفية مختلفة، يحمل أنماط متميزة من النمو في الردود على إصابة وعرض مجموعة فريدة من القنوات، ومستقبلات والجزيئات يشير 10،11. يتعرض السرير التاجي أيضا إلى القوات الدورة الدموية فريدة من نوعها، حيث يتم ضغط الأوعية أثناء انقباض عضلة القلب قبل التعاقد. وتشير عملنا مؤخرا أن كورونآرى إعادة الاوعية الدموية الدقيقة في النوع 2 السكري الفئران ديسيبل / ديسيبل اختلف من الأوعية المقاومة الأورطي والمساريقي 1،12. لفهم الآليات الجزيئية التي تمثل هذه الاختلافات، في دراسات المختبر باستخدام VSMCs مرور منخفضة ضرورية. على الرغم من أن هناك مجموعة متنوعة من أساليب مختلفة وراسخة لعزل وزراعة VSMCs الشريان الأبهر أو المساريقي الفئران، في الوقت الراهن، هناك دراسة واحدة فقط التي تم نشرها على عزل VSMCs من الماوس التاجي تداول 3.
في هذا البروتوكول، ونحن لشرح طريقة تحسين لعزل VSMCs الفئران الابتدائي من الدورة التاجية. ويستند لدينا بروتوكول مبني على واحدة نشرتها تنغ وآخرون. 3. التعديلات قدمنا طلبا لأسلوب الأصلي توفر السكان المخصب وعائدات أعلى من VSMCs. وتشمل الخطوات الحاسمة اللازمة لتحقيق هذه النتائج موضع الصحيح للقنية، مطاردة لطيفجي القلب لإزالة الدم الزائد، وقطع قمة القلب في نهاية الهضم. من الثلاثة، والتنسيب للقنية هو من أهمية قصوى. وperfused الدورة الدموية التاجية من فوهات التاجية فقط البعيدة للصمام الأبهري. وبالتالي تعطل سلامة صمام عن طريق إدخال قنية في غرفة البطين الأيسر سوف يؤدي إلى ضعف التروية التاجية وخفض كبير في عدد من VSMCs قابلة للحياة. وبيغ لطيف من الدوران التاجي إزالة ليس فقط الدم الزائد من بيليه النهائي المستخدمة للثقافة، ولكن ستحدد أيضا ما إذا كان تحقيق موضع الصحيح للقنية. وأخيرا، أثناء عملية الهضم، وبعض VSMCs قد تصبح المحاصرين داخل البطينات، وبالتالي قطع قمة في ختام الهضم سوف الافراج عن الخلايا وتسفر عن التقاء أكبر في الطلاء.
تعديلا هاما التي يمكن استخدامها هو استخدام 25 G إبرة أنبوب تغذية أو جهاز هارفارد الماوس الشريان الأورطي cannulوبدلا من قنية إبرة. ومع ذلك، عند استخدام إبرة أنبوب تغذية، لا بد من اتخاذ مزيد من الحذر لا لمنع الفتحات التاجية مع الكرة في نهاية الإبرة. وستكون الخطوة التنظيف لطيف يكشف عما اذا كان تعديل إبرة ضروري قبل التروية. وبالإضافة إلى ذلك، ونوع من كولاجيناز المستخدمة في حل الهضم مهم لعزل VSMC المثلى. النوع الثاني كولاجيناز ليست نقية - أنه يحتوي على الانزيمات الأخرى مثل التربسين، clostripain، وcaseinase. لذلك، المانع بإضافة كمية التربسين فول الصويا إلى حل الهضم قد تحتاج إلى تعديل استنادا إلى الكثير محدد من كولاجيناز المستخدمة في عملية الهضم.
واحد الحد من هذه التقنية هو أن VSMCs من الدورة التاجية كامل معزولة. لدينا دراسات سابقة ركزت على microvessels التاجية (80-120 ميكرون في القطر) 1،2، لكن الشرايين التاجية الرئيسية في الفئران هي أكبر (> 160 ميكرون) 13. وبالإضافة إلى ذلك، هذه التكنولوجياكما يعزل يت ضمن الخلايا من الدورة الدموية الوريدية التاجي، وليس فقط الدورة الدموية في الشرايين.
في حين تم استخدام تقنية Langendorff لأكثر من 100 سنة، والتقدم أكثر حداثة من التلاعب الماوس الجينوم (على سبيل المثال تدق في، خروج المغلوب، والطفرات) توفر فرصة فريدة للاستفادة من أسلوبنا تحديثها لمجموعة واسعة من التطبيقات. بعد العزلة والثقافة، والخلايا يمكن استخدامها لتجارب إضافية بما في ذلك العدوى الفيروسية والعلاج مع وكلاء الدوائية. فإن استخدام المشترك من الفئران المعدلة وراثيا والثقافة الخلية القياسية تسمح للتحقيق أعمق من VSMCs من الدورة التاجية الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01HL056046 بال وK99HL116769 لجمعية الصحفيين التونسيين)، ومعهد الأبحاث في مستشفى الصعيد الوطني للطفولة (لPAL وجمعية الصحفيين التونسيين).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
