Summary
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את טכניקות בידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם בעכברים עיקריים (VSMCs) מהמחזור כלילית. לאחר VSMCs בודד, הם יכולים לשמש עבור טכניקות תרבות סטנדרטיות רבות.
Abstract
בעוד הבידוד וההתרבות של תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מכלי גדול היא מבוססת היטב, חפשנו לבודד ותרבות VSMCs מהמחזור כלילית. לבבות עם קשתות אבי העורקים ללא פגע הוסרו perfused דרך Langendorff מדרדר עם פתרון העיכול המכיל 300 יחידות / מ"ל של סוג collagenase II, 0.1 מ"ג / מעכב טריפסין סויה מ"ל ו 1 M CaCl 2. Perfusates נאספו 15 מרווחי דקה במשך 90 דקות, pelleted ידי צנטריפוגה, resuspended בתקשורת ציפוי, מצופה על מנות בתרבית רקמה. VSMCs התאפיינו בנוכחות SM22α, α-SMA, ו vimentin. אחד היתרונות העיקריים של שימוש בטכניקה זו היא היכולת לבודד VSMCs מהמחזור כלילית של עכברים. למרות שמספר הקטנים של תאים המתקבלים יכול להגביל כמה בקשות אשר התאים יכולים להיות מנוצלים, VSMCs כלילית המבודדת ניתן להשתמש במגוון של טכניקות תרבית תא ומבוססות אסאys. מחקרים החוקרים VSMCs מעכברים מהונדסים גנטי יכולים לספק מידע נוסף אודות פונקציה-מבנה ותהליכי איתות הקשורים פתולוגיות וסקולרית.
Introduction
המטרה של שיטה זו היא לבודד תאי שריר חלק בכלי דם (VSMCs) מהמחזור כלילית murine לשימוש תרבית תאי מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. פתחנו בטכניקה זו כדי להעריך את המנגנונים המולקולריים של שיפוץ כלי דם בחולי סוכרת. דיווחנו בעבר פנימה שיפוץ היפרטרופית ב arterioles כלילית במחיצה במודל העכבר db / db של סוכרת 1. בשל הכמות של רקמה המוגבלת נמצאת התקפי הלב בעכברים במחיצה, ניסיוני בטכניקות תקן חוקר שינויי חלבון (כתם מערבי למשל) בעכברי db / db ובקרה קשות במקרה הטוב. בנוסף, אנו בעבר הראו כי וחסמי רצפטור לאנגיוטנסין (ARB) לוסרטן מפחית את שיפוץ נצפתה בעכברים db / db 2. לכן, בידוד של VSMCs העיקרי מהמחזור הכליליים מאפשר לנו לבדוק את העניין לעומק שינויים פנוטיפ VSMC או איתות מופעל מסלולים בעכברים סוכרתיים, אשר עשוי להיות contribuטינג שיפוץ עורקיק כלילי לוואי.
מחקרים רבים הובהרו מסלולי איתות הקנונית באמצעות VSMCs מבודד האאורטה מכרסם, ולא כל מיטת כלי דם ספציפית. עם זאת, יש לנו הפגינו וסקולרית-מיטה שיפוץ ספציפיים כלילית, אבי העורקים, ו תפוצה mesenteric של עכברים db / db 1, דבר המצביע על VSMCs בכל מיטה כלי הדם עשויה להיות שונה. לכן, יש צורך לבודד VSMCs מכל מיטת כלי דם כדי להיטיב להבין את השינויים הפתולוגיים המתרחשים בכל סט של VSMCs. יש שפע של שיטות שונות עבור בידוד culturing VSMCs אבי העורקים. עם זאת, כיום, יש רק מחקר אחד שפורסם על הבידוד של VSMCs מהעכבר כלילית במחזור 3. טנג et al. היה הראשון לדווח על שיטה לבידוד VSMCs ממחזור העכבר כלילית; עם זאת, יש לנו תוקנו בפרוטוקול באופן משמעותי כפי שהם גם מבודדים cel אנדותלls. מעבדות אחרות גם השתמשו בפרוטוקול מ טנג et al. לבודד מיוציטים עורקים כלילית ותאי שריר חלק בדרכי הנשימה 4,5. השינויים שאנו נשלב יניבו אוכלוסיית התאים מועשרים עבור VSMCs מהמחזור כלילית.
זלוף המדרדר של לב היונק המבודד, או טכניקת Langendorff, הוקם בשנת 1897 על ידי 6 אוסקר Langendorff ועדיין משמש היום נרחב עבור הבידוד של תאים וכלי דם. הטכניקה המוצגת כאן, יחד עם התקדמות שינויים גנטיים בעכברים מודרניים, מספקת כלי רב ערך לחקירה מדוקדקת יותר של ההתנהגות המולקולרית של VSMCs מהמחזור כלילית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
משפט ואתיקה: מחקר זה נערך בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות, והיא אושרה על ידי טיפול בבעלי חיים מוסד ועדת שימוש ב- Nationwide בית החולים לילדים.
1. הכנה / גדר
הערה: טכניקת בידוד זה דורש שני סלילי חימום Langendorff ממוצבת Side-by-side על דוכן טבעת, ומחוברת במקביל באמבט מים במחזור.
- הפעל במחזור אמבט מים ולהתאים טמפרטורה כדי להשיג טמפרטורה סופית של 33-34 מעלות צלזיוס ב קצה צינורית Langendorff (באמבט המים המשמש זה להגדיר מוגדר 40 ° C עקב אובדן C 6-7 ° ב הטמפרטורה על פני צינורות). הפעל המשאבות זלוף ולהגדיר שיעור זלוף 0.5 מ"ל / דקה.
- נקו שני סלילי חימום במקטורן מים, צינורות מחוברים ו -25 צינורית מד ידי שטיפה כל אחד עם 50 מ"ל של אתנול 70%, ואחריו 100 מ"ל מים ultrapure autoclaved.
- נקה את סלילי החימוםעל ידי דחיפת אוויר עם מזרק ולשטוף עם 10 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא פנול אדום. השאר HBSS ב סליל חימום הצינורות.
- צרף מזרק luer נעילת סטרילי 10 מ"ל מלא HBSS בטמפרטורת החדר ללא פנול אדום אל צינורות. ודא כי אין בועות אוויר לכודות בתוך סלילי צינורות וחימום בעת צירוף המזרק HBSS המלא שכן הדבר עלול לגרום תסחיפי אוויר במהלך העיכול להשפיע על בידוד VSMC שלילי.
- הסר את הצינורית 25 מד מן סלילי חימום ומניחים על עוד מזרק 10 מ"ל סטרילי מלא HBSS קר כקרח ללא פנול אדום. שמור את זה על הקרח עד מוכן לשימוש. חזור על פעולה עבור הצינורית האחרת.
- כן פתרון עיכול אנזימים.
- לשקול סוג collagenase 2 על פי מספר פריט ספציפי עבור 75 מ"ל של פתרון העיכול כדי להשיג ריכוז סופי של 300 יחידות / מ"ל.
- ממיסים collagenase ב 75 מ"ל של HBSS עם פנול אדום. לאחר מכן, להוסיף 1.5 מ"ל של 0.1 מ"ג / מעכב טריפסין סויה מ"ל ו -75 μl של 1 M CaCl 2 לתערובת.
- אם באמצעות פתרון העיכול מיד, לחמם אותו על 37 מעלות צלזיוס. אם לא, למקם אותו על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 6 שעות. פתרון זה חייב להיעשות טרי מדי יום.
- כן התקשורת להפסיק פתרון / ציפוי.
- הוספת 100 מ"ל חום מומת FBS, 5 מ"ל של L- גלוטמין, 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות, 5 מ"ל של HEPES, ו 1 מ"ל של primocin 500 מ"ל של גלוקוז גבוהה (4.5 גר '/ ל') DMEM. עיקור סנן מומלץ.
- Aliquot 6 מ"ל של פתרון להפסיק לתוך כל אחד עשר צינורות חרוטי 15 מ"ל, ממוספרים A1-A6 ו- B1-B6, ומקום ב 4 ° C.. Aliquot 50 מ"ל של תמיסת להפסיק לתוך חרוטי ומקום 50 מ"ל ב 37 ° C חממה.
הערה: שלב זה יכול גם להיות מוכן היום לפני הבידוד במידת הצורך. להפסיק פתרון זה ישמש תקשורת הציפוי הבאה בידוד תא.
- הכן שני 1 מ"ל מזרקים מצויד במחט 30 Gעם 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ"ל).
- חותכים חתיכה 5 ס"מ של 5-0 משי כירורגית. לקשור קשר בוהן רופף משי כירורגית עם קצה אחד פעמיים כל עוד אחרים. מניחים על צינורית 25-מד, אבל לא להדק. חזור על הפעולה עבור צינורית 25 G אחרים.
- מלאו ארבע 35 מ"מ צלחות פטרי סטרילי (# 1-4) עם 2 מ"ל של אדום סטרילי, קר כקרח, HBSS ללא פנול. שמור על הקרח.
2. המתת חסד, בידוד לב Cannulation
- לפני בידוד לב, להבטיח כי פתרון העיכול 50 מיליליטר החרוטים של להפסיק פתרון חמימים. הסר את המזרק HBSS מלא עם 25 מחוברים צינורית G מן הקרח ומניחים מהדק ביורטה (או מהדק טבעת מעמד) על דוכן טבעת.
- להרדים עכברים באמצעות 3% isofluorane. אשר את העכבר הוא מורדם על ידי מגע אצבע על כל גפיים אחוריים. אם עוויתות הרגל, העכבר עדיין לא הרדים אז תחכה 1 דקות וחזור על קשר הבוהן.
- לחשוף את וריד הצוואר על ידי הסרת הפרווהעור nd על הקדמי של הצוואר במספריים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להסיר כל שומן סביב וריד הצוואר בזהירות. לאחר הסרת שומן, להזריק לאט 100 μl של הפרין (1,000 יחידות / מ"ל). מניחים ספוג כירורגית על הווריד כדי למנוע דימום יתר.
- לאחר 1 דקות, חזה פתוח לחשוף לב, לב טרמפ עם מלקחיים מעוקלים להעיף אותו באמצעות מספריים, והקפד לשמור האאורטה עולה שלם באמצעות סניף brachiocephalic הראשון. מיד למקום הלב לתוך צלחת 35 מ"מ (# 1) עם HBSS קר כקרח ללא פנול אדום ולשטוף.
הערה: בצע את 4 השלבים הבאים באמצעות היקף ניתוחים. - מקם את צינורית 25 G כי הוא רכוב על הטבעת לעמוד בזווית של 45 מעלות, כך הקצה ממוקם רק מתחת לפני השטח של HBSS קר כקרח בצלחת # 2 והוא נראה בבירור מבעד למיקרוסקופ לנתח. מעבירים את הלב בצלחת # 2.
- בעזרת מלקחיים דומון, לחשוף את אבי העורקים על ידי הסרת שומן עודף בעדינות באמצעות לנתיחה בוטה pניקוב או קריעה יימנע של אב העורקים. לאחר מכן, להשתמש במלקחיים כדי להחליק את אבי העורקים מעל 25 צינורית G.
- להנחות את הצינורית כלפי מטה דרך אבי העורקים, קרוב, אבל לא מעבר שסתום אבי העורקים, אשר תפגענה שלמות שסתום ולכן, זלוף מדרדר. לאחר הקנייה היא במקום, חלק את המשי מראש קשור על אב העורקים, והדק. לקשור קשר שני כדי ליצור קשר מרובע סביב האאורטה כדי לאבטח את הלב.
- לאחר האאורטה קשורה באופן מאובטח, בעדינות ולשטוף את הדם שנותר מהמחזור כלילית עם HBSS קר כקרח בתוך המזרק המצורף 25 צינורית G. תשמור על עצמך כדי לא לדחוף יותר מדי כדי למנוע לחץ כלילית מוגזם. רק סומק איטי ועדין מאוד נדרש כדי להשלים את הרצף. דליפה ללא cannulation אבי העורקים יכול להיות גם ציין במהלך סומק עדין זה.
- הפעל את המשאבה זלוף כדי להתחיל בתהליך של HBSS. הסר את צינורית 25 G (עם הלב המצורף) מן המזרק HBSS המלא, מקפידלשמור על רכזת הצינורית מלאה HBSS, ולחבר אותו סלילי חימום HBSS המלאים החמים. בגין זלוף של הלב עם המשאבה זלוף בשיעור של 0.5 מ"ל / דקה במשך 8 דקות.
- אחרי הלב הראשון הוא cannulated והוא להיות perfused על המערכת, יש לחזור על שלבי 2.1-2.8 עבור הלב השני. בידודים אלה יהיו מפוצלים עבור כל לב ולכן תכנון ותזמון זהירים נדרשים.
עיכול 3.
- לאחר שטיפה עם HBSS, לשנות את מזרק 10 מ"ל HBSS כרגע על המשאבה לאחת מלא 10 מ"ל של פתרון העיכול מחומם מראש. Perfuse כל הלב עם פתרון העיכול במשך 12 דקות בקצב של 0.5 מ"ל / דקה. אל תאסוף שברים הנובעים העיכול הראשון כאשר זה יכיל שום דם שריד ותאי האנדותל.
- לאחר 12 דקות, לשנות את שיעור זלוף 0.4 מ"ל / דקה, להציב חרוטי 15 מ"ל (שפופרת A1 או B1, התואם את הלב הראשון או השני עבור כל מערכת העיכול) מלא solut להפסיק קריון לתוך דלי קרח מתחת ללב כדי להתחיל אוסף perfusate מועשר VSMC.
- לאחר 15 דקות, לשנות את חרוטי אוסף A2 צינור או B2 ו- A1 צינור ספין חרוטים ו- B1 89 XG במשך 10 דקות מייד לאחר האיסוף של שני השברים. כאשר המזרק מלא עם פתרון העיכול על המשאבה יש פחות מ 1 מיליליטר של תמיסה, להחליף עם מזרק טרי מלא 10 מיליליטר של פתרון עיכול.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב supernatant מהצינור כל אוסף, עוזב כ 0.5 מ"ל. Resuspend גלולה מן A1 עם 2 מ"ל של תמיסת להפסיק חם (או מדיה ציפוי). להוסיף resuspension מהצינור A1 צינור B1 ו- צינור מקום 37 ° C חממה עם כובע רופף.
- חזור על שלבי 3.3 ו 3.4 עד שכל הצינורות (דרך A6 ו- B6) משמש במשך זמן סך גבייה של 90 דק '. ב 80 דקות של עיכול, לחתוך את קודקוד הלב כדי לשטוף את כל תאים עלולים להילכד בתוך החדר ולאסוף תאים אלה בצינור A6 ו- B6, respectively.
הערה: לפעמים בלב ייפול הצינורית טרם מועד הזמן 90 הדק '. במקרה כזה, לאחזר את הלב והמקום לתוך צלחת סטרילי 35 מ"מ פטרי מלא 2 מיליליטר של פתרון עיכול. חותכים את הקודקוד של הלב בעדינות ולשטוף את הלב עם פתרון העיכול. לאחר מכן, לסנן את 2 מ"ל של פתרון העיכול דרך מסננת 100 מיקרומטר תא סטרילי לתוך חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף צינור A6 או B6. - לאחר כל סיבוב של צינורות עוקבים (A2 ו- B2), מוסיף את VSMCs מושעה אל צינור האיסוף הקודם (בשילוב A1 ו- B1). כמו כן, לדאוג לא לתת את פתרון העיכול במשאבה נגמר ולעבור 10 מ"ל המזרקים לפי הצורך ברחבי העיכול.
- אחרי כל הצינורות משולבים, בצנטריפוגה השעית VSMC העשירי ב 89 XG במשך 10 דקות.
- לשאוב כמה שיותר supernatant משפופרות אוספות ככל האפשר. Resuspend הגלולה שנותר 2 מיליליטר של ציפוי תקשורת צלחת על צלחת תרבות אחת 35 מ"מ. אני צלחת תרבות מקוםn 37 ° C בחממה במשך 24 שעות.
4. תרבית תאים
הערה: השלם את השלבים הנותרים בארון הבטיחות הביולוגי.
- לאחר 24 שעות, לשאוב את תקשורת הציפוי בעדינות. התרבות תהיה בדרך כלל יש כמות גדולה של פסולת. כדי לשטוף את התאים, להוסיף 2 מ"ל של חם, PBS סטרילי לטפוח בעדינות את המנה כנגד שתי אצבעות תוך כדי סיבוב בכיוון סיבוב השעון.
- אחרי סיבוב של 360 מעלות, לשאוב PBS ו חוזר בשנית. לשאוב PBS ולהוסיף 2 מ"ל אחר של PBS סטרילי, חם. בדוק את מנת התרבות תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שיש לא מעט על מנת פסולת על הצלחת. מפגש Cell ניתן לקבוע גם בשלב זה.
- אם פסולת נשארת בצלחת התרבות, חזור על שלב 4.2. אם מנת התרבות היא ברורה של פסולת, לשאוב PBS ולהוסיף 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה.
- לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים שוב עם חם, PBS סטרילי כדי להסיר כל פסולת סופית או תאים מתים מן התרבות. לשאוב PBS ו- pלשרוך עוד 2 מיליליטר של תקשורת ציפוי החמה על התאים.
- בדוק על התאים בכל יום ולהאכיל כל 48 שעות עם תקשורת ציפוי חממה טריה. בשלב זה, תאים יכולים לשמש מבחני תרבית תאים סטנדרטיים. VSMCs צריך להיות כ -80% ומחוברות 4-5 ימים לאחר הציפוי, למרות עשוי להימשך עד 7 ימים עד ההליך מושלם. אם פיצול לפסוקים הבאים, להשתמש לכל היותר 1: 4 35 מנות מ"מ (או לאזור מקביל תרבות מנות).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשל ההיבט החדשני טכניקת בידוד VSMC כלילית שלנו, אנחנו בקשנו לקבוע את הטוהר של בידוד התא. עכבר הכליליים VSMCs זוהו מבוסס על מכתים המורפולוגיה immunofluorescence שלהם עד חלוף 2. בהתבסס על המורפולוגיה של התאים בתרבית לאחר הכביסה הראשונה, הליך הבידוד מסיר מיוציטים מהלב ביעילות ותאי האנדותל. VSMCs לשמור המורפולוגיה שלהם עד מעבר 2 (איור 1). עם זאת, קיימת אפשרות של זיהום על ידי פיברובלסטים adventitial ואת ביניים. כדי לשלול לבלבל את הפוטנציאל הזה, אנו מוכתמים תאים מבודדים עבור SM22α, יקטין שריר α-חלקה (α-SMA), הן VSMC סמני 7,8, ו vimentin, סמן פיברובלסטים 9, ב קטעי 1-2 (איור 2). צפינו ללא שינוי של סמנים אלה דרך מעבר 2. כמו כן, אנו מראים כי בידוד התא שלנו נטול CD31 / מכתים PECAM (קורון אדםלתאי אנדותל כלי הדם האר"י משמש כביקורת חיובית), דבר המעיד על חוסר זיהום תא האנדותל באמצעות פרוטוקול הבידוד הזה. באופן קולקטיבי, הליך בידוד תא שלנו מניב אוכלוסייה טהורה כמעט של VSMCs מהמחזור כלילית כעת ניתן להשתמש עבור ניסויים נוספים.
איור 1:. VSMCs כלילית נציג התרבותית VSMCs כלילית מתורבתת (מעבר 2) מבודד מעכברי Db / db הטרוזיגוטיים צלמו ב 10X הגדלה בתנאים בניגוד שלב בשדה בהירים. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Immunoflמכתים uorescence של VSMCs כלילית תרבותי. מצופים VSMCs כלילית מ הטרוזיגוטיים (dB / db) עכברים בבית קטעים 1-2 שכותרתו עם נוגדנים SM22α, α-SMA, vimentin, ו CD31 / PECAM. תמונות שצולמו בהגדלה 10X. לא חל שינוי משמעותי עם המעבר. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מטרת המחקר הנוכחי הייתה להסתגל פרוטוקולי בידוד תא קיימים כדי להגדיל את התשואה של כלילית כלי דם החלקה מלבבות בעכברים. רוב העבודה החלוצית בביולוגיה השריר החלק בכלי הדם בוצע עם תאי שריר חלק אבי העורקים חולדה תרבותי. מחקרים אלה סיפקו את הידע הבסיסי של המנגנונים המולקולריים השולטים צמיחה VSMC, הגירה היפרטרופיה 7. עם זאת, כשדה התקדם, התברר כי VSMC הפנוטיפ והתפקוד נשלטו על ידי מספר גורמים ספציפיים מיטת כלי דם. לדוגמא, לעומת כולים היקפיים, עורקים הכליליים להציג תגובות פונקציונליות שונות, להראות דפוס מסוים של גידול תגובות פציעה ולהציג מגוון ייחודי של ערוצים, קולטנים מולקולות איתות 10,11. המיטה כלילית חשופה גם לכוחות המודינמי ייחודי, שכן כלי דחוסים במהלך התכווצות ידי שריר הלב מתכווץ. העבודה האחרונה שלנו מצביעה על כך קורוןשיפוץ כלי הדם האר"י מסוג 2 בעכברים סוכרתיים db / db נבדלו כלי התנגדות אבי העורקים mesenteric 1,12. כדי להבין מנגנונים מולקולריים להסביר את ההבדלים הללו, במבחנה באמצעות VSMCs מעבר נמוך נחוץ. אמנם יש מגוון של שיטות שונות ומבוססת עבור בידוד culturing VSMCs העורק אבי העורקים או mesenteric בעכברים, כיום, יש רק מחקר אחד שפורסם על בידוד של VSMCs מהעכבר כלילית במחזור 3.
בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה משופרת לבידוד תרמי של VSMCs murine העיקרי מהמחזור כלילית. הפרוטוקול שלנו מבוסס באופן רופף על אחד בהוצאת טנג et al. 3. השינויים יישמנו לטכניקה המקורית לספק אוכלוסייה מועשרת תשואה גבוהה יותר של VSMCs. השלבים הקריטיים הדרושים כדי להשיג את התוצאות הללו כוללים מיקום נכון של הצינורית, סומק עדיןing של הלב כדי להסיר דם עודף, וחיתוך הקודקוד של הלב בסוף העיכול. מבין השלוש, מיקום של הצינורית הוא בעל החשיבות העליונה. תפוצתו כלילית הוא perfused מן אוסטיה כלילית דיסטלי רק כדי שסתום אבי העורקים. לכן שיבוש שלמות שסתום באמצעות החדרת צינורית לתוך תא החדר השמאלי יוביל זלוף כלילי עניים לירידה דרמטית במספר VSMCs קיימא. שטיפה עדינה של מחזור הדם הכליליים לא רק להסיר דם עודף הגלולה הסופית המשמשת תרבות, אלא גם תקבע אם מיקום נכון של צינורית מושגת. לבסוף, במהלך עיכול, כמה VSMCs עשוי להיות לכוד בתוך חדרי הלב, ובכך חיתוך איפקס בסיומה של עיכול תשחרר את התאים להניב מפגש גדול על ציפוי.
שינוי חשוב שיכול להיות מנוצל הוא השימוש מחט gavage 25 G או cannul אבי העורקים עכבר הרווארד Apparatusבמקום צינורית המחט. עם זאת, כאשר באמצעות מחט gavage, אחד חייב לטפל נוסף לא לחסום את אוסטיה כלילית עם הכדור בסוף המחט. צעד השטיפה העדין יגלה אם התאמה של המחט היא הכרחית לפני זלוף. בנוסף, סוג של collagenase משמש פתרון העיכול חשוב לבידוד VSMC אופטימלי. collagenase Type II אינו טהור - הוא מכיל אנזימים אחרים כגון טריפסין, clostripain, ו caseinase. לפיכך, הסכום של טריפסין הסויה מעכב להוסיף את פתרון העיכול ייתכן שיהיה צורך מותאם על בסיס במגרש הספציפי של collagenase מנוצל לעיכול.
מגבלה אחת של הטכניקה היא כי VSMCs מהמחזור כלילית כולו מבודד. המחקרים הקודמים שלנו התמקד microvessels כלילית (80-120 מיקרומטר קוטר) 1,2, אולם העורקים הכליליים העיקריים עכברים גדולים (> 160 מיקרומטר) 13. בנוסף, טק זהnique גם מבודד תאים ממחזור ורידי עורקי הלב, לא רק את זרימת העורקים.
בעוד טכניקת Langendorff שימש במשך למעלה מ -100 שנה, הפיתוחים האחרונים יותר של מניפולציה גנום העכבר (למשל עקום, עקום החוצה, מוטציות) מספקים הזדמנות ייחודית לנצל טכניקה המעודכנת שלנו עבור מגוון רחב של יישומים. לאחר בידוד והתרבות, התאים יכולים לשמש בניסויים נוספים, כוללים זיהום ויראלי וטיפול עם סוכנים תרופתיים. השימוש המשותף של עכברים מהונדסים גנטיים והתרבות תאים סטנדרטית יאפשר חקירה מעמיקה יותר של VSMCs ממחזור הכליליים Murine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01HL056046 ל PAL ו K99HL116769 כדי AJT), ואת המכון לחקר ב- Nationwide בית החולים לילדים (ל PAL ו AJT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
- Katz, P. S., et al. Coronary arterioles in type 2 diabetic (db/db) mice undergo a distinct pattern of remodeling associated with decreased vessel stiffness. Basic Res Cardiol. 106 (6), 1123-1134 (2011).
- Husarek, K. E., et al. The angiotensin receptor blocker losartan reduces coronary arteriole remodeling in type 2 diabetic mice. Vascul Pharmacol. , (2015).
- Teng, B., Ansari, H. R., Oldenburg, P. J., Schnermann, J., Mustafa, S. J. Isolation and characterization of coronary endothelial and smooth muscle cells from A1 adenosine receptor-knockout mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (4), H1713-H1720 (2006).
- Oldenburg, P. J., Wyatt, T. A., Sisson, J. H. Ethanol attenuates contraction of primary cultured rat airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (5), 539-545 (2010).
- Xu, M., et al. Intracellular two-phase Ca2+ release and apoptosis controlled by TRP-ML1 channel activity in coronary arterial myocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (5), C458-C466 (2013).
- Skrzypiec-Spring, M., Grotthus, B., Szelag, A., Schulz, R. Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium. J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiol Rev. 84 (3), 767-801 (2004).
- Li, L., Miano, J. M., Cserjesi, P., Olson, E. N. SM22 alpha, a marker of adult smooth muscle, is expressed in multiple myogenic lineages during embryogenesis. Circ Res. 78 (2), 188-195 (1996).
- Santiago, J. J., et al. Cardiac fibroblast to myofibroblast differentiation in vivo and in vitro: expression of focal adhesion components in neonatal and adult rat ventricular myofibroblasts. Dev Dyn. 239 (6), 1573-1584 (2010).
- Fisher, S. A. Vascular smooth muscle phenotypic diversity and function. Physiol Genomics. 42A (3), 169-187 (2010).
- Archer, S. L. Diversity of phenotype and function of vascular smooth muscle cells. J Lab Clin Med. 127 (6), 524-529 (1996).
- Souza-Smith, F. M., et al. Mesenteric resistance arteries in type 2 diabetic db/db mice undergo outward remodeling. PLoS One. 6 (8), e23337 (2011).
- Thuroff, J. W., Hort, W., Lichti, H. Diameter of coronary arteries in 36 species of mammalian from mouse to giraffe. Basic Res Cardiol. 79 (2), 199-206 (1984).
