Summary
このプロトコルの目的は、冠循環からマウスの一次血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養技術を実証することです。たVSMCが単離されたら、それらは、多くの標準的な培養技術のために使用することができます。
Abstract
大血管からの血管平滑筋細胞（VSMC）の単離および培養物が十分に確立されているが、我々は、冠循環からのVSMCを単離し、培養しようとしました。無傷の大動脈弓と心臓をコラゲナーゼタイプIIの300単位/ ml、0.1mg / mlの大豆トリプシン阻害剤および1MのCaCl 2を含有する消化溶液で逆行ランゲンドルフによって除去し、潅流しました。灌流液は、90分間、15分間隔で採取し、遠心分離によってペレット化し、培地をめっき中に再懸濁し、そして組織培養皿上にプレーティングしました。 VSMCをはSM22α、α-SMA、およびビメンチンの存在によって特徴付けられました。この技術を使用することの主な利点の一つは、マウスの冠循環からのVSMCを隔離する能力です。得られた細胞の数が少ないセルを利用することができるため、アプリケーションの一部を制限することができるが、単離された冠状動脈のVSMCは、十分に確立された細胞培養技術とASSA種々のに使用することができますYS。遺伝的に改変されたマウスからのVSMCを調査研究は、構造機能および血管の病理に関連したシグナル伝達過程に関するさらなる情報を提供することができます。
Introduction
この方法の目的は、細胞培養と、標準的な細胞培養アッセイで使用するために、マウス冠循環の血管平滑筋細胞（VSMC）を単離することです。我々は、糖尿病における血管リモデリングの分子機構を評価するためにこの技術を開発しました。我々は以前、糖尿病1のdb / dbマウスモデルにおける中隔の冠状動脈に肥大改造内側に報告しています。マウス中隔冠状動脈に見られる組織の限られた量を、デシベル/ dbのマウスおよび対照マウスにおけるタンパク質の変化（ 例えばウェスタンブロット）を調査し、標準的な実験技術は、最高の状態では困難です。加えて、我々は以前に、アンジオテンシン受容体遮断薬は、（ARB）が、ロサルタンでのdb / dbマウス2で観察されたリモデリングを減少することが示されています。したがって、冠循環からの一次VSMCをの単離は、私たちがさらにcontribuかもしれ糖尿病マウスにおけるVSMC表現型または活性化のシグナル伝達経路の変化を調査することができます有害冠状動脈リモデリングにティン。
多くの研究はむしろ、各特定の血管床に比べ、齧歯類大動脈から単離したVSMCを使用して、標準的なシグナル伝達経路を解明しました。しかし、私たちは、それぞれの血管床でのVSMCは異なる可能性があり示唆し、血管床冠動脈、大動脈内の特定のリモデリング、およびデシベル/ dbマウス1の腸間膜循環を実証しました。したがって、より良いたVSMCの各セットに生じる病理学的変化を理解するために、各血管床からのVSMCを単離することが必要です。大動脈のVSMCを単離し、培養するための異なる方法の茄多があります。しかし、現在、マウス冠循環3からのVSMCを単離する上で公開されている唯一の研究があります。テンら 。マウス冠循環からのVSMCを単離するための方法を報告した最初の。しかし、我々は、彼らはまた、単離された内皮セル画のように大幅にプロトコルを修正していますlsの。他のラボはまた、テンらからプロトコルを使用している。冠状動脈筋細胞及び気道平滑筋細胞4,5を分離します。私たちが組み込まれているの変化は非常に冠循環からのVSMCのために濃縮された細胞の集団が得られます。
単離された哺乳動物の心臓、またはランゲンドルフ技術の逆行性灌流は、オスカーランゲンドルフによって1897年6に設立され、現在でも広く心血管細胞の単離のために今日使用されています。現代のマウス遺伝子改変の進歩と相まってここで紹介する技術は、冠循環からのVSMCの分子挙動の近い調査のための貴重なツールを提供します。
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Protocol
倫理に関する声明：この研究は健康ガイドラインの国立研究所に従って実施したところ、全国の小児病院での法人動物実験委員会によって承認されました。
1.準備/設定します
注：この分離技術は、リングスタンド上に並べて配置された2つのランゲンドルフ加熱コイルを必要とし、循環水浴に並列に接続されています。
- 水浴を循環をオンにして、ランゲンドルフカニューレの先端に33-34℃の最終温度を達成するために温度を調整します（この中で使用される水浴が原因で6-7°Cの損失を40℃に設定されている設定しましたチューブの両端の温度で）。灌流ポンプの電源をオンにし、0.5ml /分に灌流速度を設定します。
- オートクレーブ滅菌超純水100ミリリットルに続いて、70％のエタノール50mlでそれぞれをフラッシュすることにより、水ジャケット加熱コイル、添付のチューブと25ゲージのカニューレの両方をきれいにしてください。
- 加熱コイルをクリアシリンジで空気を押して、フェノールレッドを含まないハンクス平衡塩溶液（HBSS）10mlで洗浄します。加熱コイルとチューブにHBSSを残します。
- チューブへのフェノールレッドを含まない室温HBSSで満たした滅菌10ミリリットルルアーロックシリンジを取り付けます。これは負のVSMCの分離に影響を与えると消化中に空気塞栓を引き起こす可能性としてHBSS充填された注射器を取り付けるときに気泡がチューブと加熱コイルの中に閉じ込められていないことを確認します。
- フェノールレッドなしの氷冷HBSSで満たされた別の滅菌10ミリリットル注射器の加熱コイルと場所から25ゲージのカニューレを外します。使用する準備ができるまで氷上にこれを保管してください。他のカニューレのために繰り返します。
- 酵素消化ソリューションを準備します。
- 消化溶液75mlを300単位/ mlの最終濃度を達成するための特定のロット番号に応じてコラゲナーゼタイプ2を量ります。
- フェノールレッドとHBSSの75ミリリットルにコラゲナーゼを溶解させます。次に、0の1.5ミリリットルを追加します。0.1 mg / mlで大豆トリプシン阻害剤との混合物に1 MのCaCl 275μlの。
- すぐに消化溶液を使用する場合、37゜Cに温め。ない場合は、最大6時間、4℃でそれを置きます。このソリューションは、毎日新鮮な作られなければなりません。
- 停止液/メッキメディアを準備します。
- 高グルコース500mlの100 mlの熱不活性化FBS、L-グルタミン5mlの非必須アミノ酸を5ml、HEPES 5mlの、及びprimocin 1 mlを加え（4.5グラム/ L）DMEM。フィルター滅菌は推奨されます。
- 4℃で12 15ミリリットルの各円錐管、番号のA1-A6とB1〜B6、および所定の位置に停止溶液のアリコート6ミリリットル。アリコートを37℃のインキュベーター中で、50mLの円錐形と所定の位置に停止溶液50ml。
注：必要な場合は、このステップはまた、単離の前に一日に調製することができます。この停止液は、細胞単離後めっき媒体として使用されます。
- 30 G針を装備した2 1ミリリットル注射器を準備しますヘパリン100μlのと（千単位/ ml）。
- 5-0手術用絹の5cmの部分をカットします。他のように2倍の長一端との外科シルクに緩いオーバーハンド結び目を作ります。 25ゲージのカニューレ上に置きますが、締めないでください。他の25のGカニューレに対して繰り返します。
- フェノールレッドを含まない滅菌、氷冷の2ミリリットル、HBSSで4 35ミリメートル滅菌ペトリ皿（＃1-4）を入力します。氷の上に保管してください。
2.安楽死、心臓の単離およびカニューレ挿入
- 心分離する前に、消化液と停止液の50ミリリットルの円錐形が暖かいであることを確認してください。リングスタンドにビュレットクランプ（またはリングスタンドクランプ）で氷と場所から添付さ25 GカニューレでHBSSフィルドシリンジを取り外します。
- 3％のイソフルランを用いてマウスを麻酔。マウスは、各後肢につま先タッチで麻酔をかけていることを確認します。足のけいれん場合は、マウスはまだそれほど1分待ってからつま先タッチを繰り返して麻酔されていません。
- 毛皮aを除去することにより、頸静脈を公開はさみで首の前方の皮膚をND。次に、慎重に頸静脈の周囲の任意の脂肪を除去するために鉗子を使用しています。脂肪を除去した後、ゆっくりとヘパリン100μlの（千単位/ ml）を注入します。過度の出血を避けるために、静脈の上に手術用スポンジを置きます。
- 1分後、開胸は、最初の腕頭枝を介してそのまま上行大動脈を維持することを確認すること、曲がったピンセットで心臓、リフト心臓を露出し、はさみを使用して、それを切除します。すぐにフェノールレッドを含まない氷冷HBSSで35mmディッシュ（＃1）に心を置き、すすぎます。
注：解剖スコープを使用して、次の4つのステップを実行します。 - 先端がちょうど皿＃2の氷冷HBSSの表面の下に位置し、解剖顕微鏡を通してはっきりと見えるされるように位置リングに搭載されている25 Gカニューレは、45°の角度で立ちます。皿＃2に心を転送します。
- デュモン鉗子を使用して、そっとpまでの鈍的切開を介して、余分な脂肪を除去することによって大動脈を露出させます大動脈のrevent穿刺または引き裂きます。次に、25 Gカニューレを介して大動脈をスライドする鉗子を使用しています。
- ではなく、弁の完全性、したがって、逆行性灌流を危うくします大動脈弁、を越えて、に近い、大動脈を通って下方カニューレを導きます。カニューレが適所に配置されると、大動脈上に予め結んだシルクをスライドさせて、締めます。心を確保するために、大動脈の周りの正方形の結び目を形成するために、第2の結び目を作ります。
- 大動脈が確実に接続されていたら、静かに25 Gカニューレに取り付けたシリンジ内の氷冷HBSSと冠循環から残りの血液を洗い流します。過度の冠状動脈の圧力を避けるために、あまりプッシュしないように注意してください。唯一の非常に遅く、穏やかなフラッシュは、フラッシュを完了するために必要とされます。漏れのない大動脈カニューレ挿入は、この穏やかなフラッシュ中に観察することができます。
- HBSSの流れを開始するために灌流ポンプをオンにします。に注意しながら、HBSS充填されたシリンジから（添付心で）25 Gカニューレを削除しますHBSSで満たされたカニューレハブを保ち、暖かいHBSSで満たされた加熱コイルに接続します。 8分間0.5ミリリットル/分の速度で灌流ポンプと心臓の灌流を開始します。
- 最初の心臓がカニューレを挿入され、システム上で灌流された後、繰り返しは第二の心臓のために2.1から2.8を繰り返します。これらのアイソレーションは、慎重な計画とタイミングが要求され、したがって各心臓のために互い違いに配置されます。
3.消化
- HBSSで洗浄した後、予め温め消化溶液10mlを充填した1に、現在のポンプに10ミリリットルのHBSSシリンジを変更します。 /分0.5ミリリットルの流量で12分間消化液で各心臓を灌流。これは、任意の残留血液および内皮細胞が含まれていますように、この最初の消化に由来する画分を収集することはありません。
- 12分後、0.4 ml /分の灌流速度を変更し、冷停止solutを充填した（各消化に第一または第二の心臓に対応するチューブA1またはB1）15mLの円錐を配置VSMCに富む灌流液の収集を開始するために、心臓の下に氷のバケツへのイオン。
- 15分後、すぐに両方の画分を集めた後、10分間、89×gでチューブA2またはB2とスピン円錐管A1とB1に収集円錐形を変えます。ポンプの消化液が充填された注射器は、溶液の1ml未満である場合には、消化液の新たに充填された10mlのシリンジで置き換えます。
- 遠心分離後、各コレクションチューブから吸引上清は、0.5程度ミリリットル残します。温かい停止液（またはメッキメディア）の2mlでA1からペレットを再懸濁し。緩いキャップで37℃のインキュベーターでA1管からB1チューブと場所チューブに再懸濁を追加します。
- すべてのチューブ（A6とB6を介して）は90分の合計収集時間のために使用されるまで繰り返し、3.3と3.4を繰り返します。消化の80分で、respe、心室の中に閉じ込められてもよい任意の細胞を洗い流し、管A6とB6でこれらの細胞を収集するために、心尖部を切断してオープンctively。
注意：時々の心は90分の時点より前にカニューレをオフに分類されます。この問題が発生した場合、心臓を取り出し、消化溶液の2ミリリットルを充填した滅菌35ミリメートルのペトリ皿に置きます。心尖をカットし、静かに消化液で心臓をすすぎます。次に、50ミリリットルの円錐形に滅菌100μmのセルストレーナーを介して消化溶液の2ミリリットルをフィルタリングし、チューブA6やB6に追加します。 - その後のチューブ（A2とB2）の各スピンした後、以前のコレクションチューブ（組み合わせA1とB1）に再懸濁させたVSMCを追加します。また、ポンプ内の消化液が出て実行し、消化を通して、必要に応じて10ミリリットル注射器を切り替えることができないように注意してください。
- すべてのチューブを組み合わせた後、10分間89×gでVSMC富む懸濁液を遠心分離します。
- できるだけ回収チューブから吸引除去などの多くの上清。 1 35mm培養皿上のメディアとプレートメッキの2ミリリットルの残りのペレットを再懸濁。場所培養皿の私24時間37℃のインキュベーターのn。
4.細胞培養
注：バイオセーフティキャビネット内の残りの手順を完了します。
- 24時間後、静かにメッキメディアを吸引除去します。文化は、通常の破片が大量にあります。細胞を洗浄するために、暖かい、滅菌PBSの2ミリリットルを追加し、時計回りの動きで回転させながら穏やかに2本の指に対して皿をタップします。
- 360度回転した後、PBSを吸引し、二回目を繰り返します。 PBSを吸引し、滅菌、温かいPBSの別の2ミリリットルを追加します。プレート上の無破片のほとんどがあることを確認する顕微鏡下で培養皿を確認してください。細胞合流には、この時点で決定することができます。
- デブリが培養皿に残っている場合は、ステップ4.2を繰り返します。培養皿は、破片のクリアされている場合、PBSを吸引し、暖かいメッキメディアの2ミリリットルを追加します。
- 24時間後、培養物から任意の最終的な破片や死んだ細胞を除去するために暖かい、滅菌PBSで再び細胞を洗浄します。 PBSおよびpを吸引細胞上に暖かいメッキメディアの別の2ミリリットルをひもで締めます。
- 毎日細胞にチェックして、新鮮な温めメッキのメディアで48時間ごとを養います。この時点で、細胞は、標準的な細胞培養アッセイのために使用することができます。 VSMCを、プロシージャが完成するまで7日程度かかるかもしれないが、メッキ後、約80％コンフルエント4-5日でなければなりません。 4 35ミリメートル皿（または培養皿の同等の面積に）：その後の継代に分割した場合、1の最大値を使用します。
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Representative Results
我々の冠状VSMC分離技術の新規な態様に、我々は、細胞単離の純度を決定しようとしました。マウス冠状動脈のVSMCは、第一洗浄後の培養中の細胞の形態に基づいて通路2にその形態および免疫蛍光染色アップに基づいて同定された、単離手順は、効果的に心筋細胞および内皮細胞を除去します。 VSMCは、通路2（ 図1）までその形態を保持しています。しかしながら、外膜および間質線維芽細胞による汚染の可能性があります。この潜在的な交絡を除外するために、我々はSM22αのために単離された細胞を染色し、α平滑筋アクチン（α-SMA）、VSMCの両方が通路1-2（ 図2）で、7,8、およびビメンチン、線維芽細胞マーカー9マーカー 。我々は、我々はまた、私たちの細胞の単離は、CD31 / PECAM染色（人間のコロンを欠いていることを示している通路2を介してこれらのマーカーの変化は認められなかっ陽性対照として使用進微小血管内皮細胞）、このアイソレーションプロトコルを使用して内皮細胞の混入がないことを示します。まとめると、我々の細胞の単離手順は、冠循環からのVSMCのほぼ純粋な集団を生成し、現在さらなる実験のために使用することができます。
図1：明視野、位相差条件の下で10倍の倍率で撮像されたヘテロ接合のdb / dbマウスから単離された代表的な培養冠動脈たVSMC培養冠状動脈のVSMC（継代2）。スケールバー=100μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：Immunofl培養された冠状動脈のVSMCのuorescence染色。SM22α、α-SMA、ビメンチン、およびCD31 / PECAMのための抗体で標識された通路を1-2でヘテロ接合（DB / DB）マウスから冠状動脈のVSMCをメッキ。 10倍の倍率で撮影した画像。有意な変化は経過とともに観察されませんでした。スケールバー=100μmでは。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この研究の目的は、マウスの心臓からの滑らかな冠血管の収量を増加させるために、既存の細胞単離プロトコールを適合させることでした。血管平滑筋の生物学における先駆的な仕事の大部分は培養ラット大動脈平滑筋細胞を用いて行きました。これらの研究は、VSMC増殖、移動および肥大7を制御する分子機構の基本的な知識を提供しました。フィールドが進むにつれてしかし、それは、VSMC表現型および機能が血管床特定多数の要因によって制御されたことが明らかになりました。例えば、末梢血管に比べ、冠状動脈が損傷に対する応答で成長の異なるパターンを示し、チャネル、受容体およびシグナル伝達分子10,11のユニークな配列を表示し、別の機能的応答を表示します。血管が収縮する心筋によって収縮期の間に圧縮されるので、冠状動脈床は、また、ユニークな血行力学的な力に曝されます。我々の最近の仕事は、そのコロンを示唆しています2型糖尿病のdb / dbマウスにおける進の微小血管のリモデリングは、大動脈や腸間膜抵抗血管1,12異なっていました。低通路のVSMCを用いたin vitro試験でこれらの違いを考慮する分子機構を理解することは必要です。マウス大動脈や腸間膜動脈のVSMCを単離し、培養するための異なる、よく確立された方法の様々がありますが、現在、マウス冠循環3からのVSMCを単離する上で公開されている唯一の研究があります。
このプロトコルでは、冠循環から初代マウスVSMCを単離するための改良された方法を示します。私たちのプロトコルが緩くテンらによって発表され1に基づいている。3。我々は独自の手法に適用した修正が濃縮された集団とのVSMCのより高い収率を提供します。これらの結果を達成するために必要な重要なステップは、カニューレの正しい配置、穏やかなフラッシュを含みます心のingが過剰血液を除去し、消化の終了時に、心尖を切断します。 3つのうち、カニューレの配置が最も重要です。冠循環は、大動脈弁のすぐ遠位冠状動脈口から灌流されます。したがって、左心室にカニューレを挿入介して弁の完全性の破壊が悪く冠動脈灌流および生存したVSMCの数の劇的な減少につながります。冠循環の穏やかな洗浄は、培養に使用される最終ペレットから余分な血液を除去しますだけでなく、カニューレの正しい配置が達成されるかどうかを判断します。最後に、消化中に、いくつかのVSMCは、このように細胞を放出し、メッキで大きな合流が得られる消化の終了時に頂点を切断し、心室の中に閉じ込められてしまうことがあります。
利用することができる重要な変更は、25 Gの強制経口投与針やハーバード装置、マウスの大動脈cannulの使用であります針カニューレの代わりインチ胃管栄養針を使用している場合しかし、1は、針の端部にボールを持って冠状動脈口をブロックしないように細心の注意を取る必要があります。針の調整前灌流する必要がある場合に穏やかな洗浄ステップが明らかになる。また、消化液に使用されるコラゲナーゼのタイプは、最適VSMCの単離のために重要です。タイプIIコラゲナーゼは純粋ではない - それは例えば、トリプシン、クロストリパイン、およびカゼイナーゼなどの他の酵素が含まれています。したがって、ダイズトリプシン阻害剤の量は、消化溶液に加え、消化に利用コラゲナーゼの特定のロットに基づいて調整する必要があるかもしれません。
技術の1つの制限は、全体の冠循環からのVSMCが単離されていることです。冠動脈微小血管に焦点を当てた我々の以前の研究（直径80-120μm）の1,2、しかしマウスの主冠状動脈が大きい（> 160ミクロン）13。また、この技術niqueはまた、冠状静脈循環だけでなく、動脈循環から細胞を分離します。
ランゲンドルフ技術は100年以上にわたって使用されてきたが、マウスゲノム操作のより最近の進歩（ 例えばノックイン、ノックアウト、変異）は、多種多様なアプリケーションのための私達の更新された技術を利用するユニークな機会を提供します。単離および培養後、細胞を薬剤とともにウイルス感染および処置を含む、さらなる実験のために使用することができます。遺伝的に改変マウスや標準的な細胞培養の共同使用は、ネズミ冠循環からのVSMCのより深い調査が可能になります。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は（PALとK99HL116769 AJTにするR01HL056046）国立衛生研究所によってサポートされ、全国小児病院で研究所（PALとAJTへ）しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
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