Summary
El objetivo de este protocolo es demostrar las técnicas de aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular primaria murino (CMLV) de la circulación coronaria. Una vez que se han aislado CMLV, que se pueden utilizar para muchas técnicas de cultivo estándar.
Abstract
Mientras que el aislamiento y cultivo de las células del músculo liso vascular (CMLV) de buques de gran tamaño está bien establecida, hemos tratado de aislar y cultivar las CMLV de la circulación coronaria. Corazones con arcos aórticos intactos se retiraron y se sometieron a perfusión a través de Langendorff retrógrada con solución de digestión que contiene 300 unidades / ml de inhibidor de tripsina de soja ml de colagenasa tipo II, 0,1 mg / 1 y M CaCl 2. Los perfundidos se recogieron a intervalos de 15 min durante 90 min, se sedimentaron por centrifugación, se resuspendieron en medio de siembra, y se sembraron en placas de cultivo de tejidos. CMLV se caracterizaron por la presencia de SM22α, α-SMA y vimentina. Una de las principales ventajas del uso de esta técnica es la capacidad de aislar las CMLV de la circulación coronaria de los ratones. Aunque el pequeño número de células obtenidas pueden limitar algunas de las aplicaciones para las que se puedan usar las células, CMLV coronarias aisladas se puede utilizar en una variedad de técnicas de cultivo celular bien establecidos y ASSAys. Los estudios que investigan las CMLV de ratones modificados genéticamente pueden proporcionar más información sobre los procesos de señalización asociados con patologías vasculares estructura-función y.
Introduction
El objetivo de este método es aislar células de músculo liso vascular (CMLV) de la circulación coronaria murino para uso en cultivo de células y ensayos de cultivo celular estándar. Hemos desarrollado esta técnica para evaluar los mecanismos moleculares de la remodelación vascular en diabetes. Hemos informado anteriormente hacia el interior remodelación hipertrófica en las arteriolas coronarias septales en el modelo de ratón db / db de la diabetes 1. Debido a la limitada cantidad de tejido que se encuentra en las coronarias septales murinos, técnicas experimentales estándar que investigan cambios en las proteínas (por ejemplo, Western blot) en ratones db / db y de control son difíciles en el mejor. Además, hemos demostrado previamente que el bloqueador del receptor de angiotensina (ARB) losartán reduce la remodelación observada en los ratones db / db 2. Por lo tanto, el aislamiento de las CMLV primarias de la circulación coronaria nos permite investigar más a fondo los cambios en las CMLV fenotipo o vías de señalización activadas en ratones diabéticos, que pueden ser contribuciónting a la remodelación de las arteriolas coronarias adverso.
Numerosos estudios han dilucidado vías de señalización canónica utilizando CMLV aislados de aorta de roedores, en lugar de en cada lecho vascular específico. Sin embargo, hemos demostrado vascular-cama remodelación específico en coronaria, la aorta, y circulaciones mesentéricos de ratones db / db 1, lo que sugiere las CMLV en cada lecho vascular puede ser diferente. Por lo tanto, es necesario aislar CMLV de cada lecho vascular con el fin de comprender mejor los cambios patológicos que se producen en cada conjunto de CMLV. Hay una gran cantidad de diferentes métodos para el aislamiento y cultivo de las CMLV de la aorta. Sin embargo, en la actualidad, sólo hay un estudio que se ha publicado sobre el aislamiento de CMLV desde el ratón circulación coronaria 3. Teng et al. fue el primero en informar de un método para aislar CMLV de la circulación coronaria del ratón; Sin embargo, hemos modificado el protocolo de manera significativa, ya que también aislaron cel endotelialls. Otros laboratorios también han utilizado el protocolo de Teng et al. Aislar miocitos arteriales coronarias y de las vías respiratorias células musculares lisas 4,5. Las alteraciones que hemos incorporado producirán una población de células altamente enriquecida para CMLV de la circulación coronaria.
La perfusión retrógrada del corazón de los mamíferos aislado, o la técnica de Langendorff, se estableció en 1897 por Oscar 6 Langendorff y sigue siendo ampliamente utilizado hoy en día para el aislamiento de células cardiovasculares. La técnica que aquí se presenta, junto con el avance de las modificaciones genéticas modernas murinos, proporciona una valiosa herramienta para la investigación más profunda del comportamiento molecular de CMLV de la circulación coronaria.
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Protocol
Declaración de Ética: Este estudio se realizó de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud, el cual fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión en el Hospital Nacional de Niños.
1. Preparación / Configurar
Nota: Esta técnica de aislamiento requiere dos serpentines de calefacción Langendorff de lado a lado posicionado en un soporte de anillo, y conectado en paralelo a un baño de agua circulante.
- A su vez en baño de agua circulante y ajustar la temperatura para alcanzar una temperatura final de 33-34 ° C en la punta de la cánula de Langendorff (el baño de agua utilizado en esta configuración se establece en 40 ° C debido a una pérdida de 6-7 ° C de la temperatura a través de los tubos). Encender las bombas de perfusión y establecer la velocidad de perfusión de 0,5 ml / min.
- Limpiar ambos de los serpentines de calentamiento con camisa de agua, la tubería adjunta y 25 de cánula de calibre lavando cada una con 50 ml de 70% de etanol, seguidos por 100 ml de agua ultrapura tratada en autoclave.
- Limpiar los serpentines de calefacciónempujando el aire con una jeringa y se lava con 10 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin rojo de fenol. Deja HBSS en los serpentines de calefacción y tubos.
- Adjuntar un 10 ml jeringa luer-lock estéril llena de temperatura ambiente HBSS sin rojo de fenol al tubo. Asegúrese de que no queden burbujas de aire atrapadas dentro de las bobinas de tubos de calefacción y al colocar la jeringa llena de HBSS ya que esto podría causar una embolia de aire durante la digestión para impactar negativamente en el aislamiento CMLV.
- Retire la cánula de calibre 25 de los serpentines de calefacción y el lugar en otra jeringa de 10 ml estéril lleno de HBSS enfriado con hielo sin rojo fenol. Tenga esto en hielo hasta que esté listo para su uso. Repita este procedimiento para la otra cánula.
- Preparar solución enzimática La digestión.
- Pesar colagenasa tipo 2 de acuerdo con el número de lote específico para 75 ml de solución de digestión para lograr una concentración final de 300 unidades / ml.
- Disolver la colagenasa en 75 ml de HBSS con rojo de fenol. A continuación, añadir 1,5 ml de 00,1 mg / ml de inhibidor de tripsina de soja y 75 l de 1 M CaCl 2 a la mezcla.
- Si se utiliza la solución de digestión de inmediato, deje que se caliente a 37 ° C. Si no es así, lo coloca a 4 ° C durante un máximo de 6 horas. Esta solución se debe hacer todos los días frescos.
- Prepare los medios de solución de parada / chapado.
- Agregar 100 ml de FBS inactivado por calor, 5 ml de L-glutamina, 5 ml de aminoácidos no esenciales, 5 ml de HEPES, y 1 ml de primocin a 500 ml de alta glucosa (4,5 g / L) DMEM. se recomienda la esterilización del filtro.
- Alícuota de 6 ml de la solución de parada en cada uno de los doce tubos de 15 ml cónicos, numeradas de A1 a A6 y B1-B6 y a 4 ° C. Alícuota de 50 ml de solución de paro en un cónica 50 ml y colocar en 37 ° C incubadora.
Nota: Este paso también se puede preparar el día antes del aislamiento si es necesario. Esta solución de parada se utiliza como los medios de comunicación de chapado siguientes de aislamiento de células.
- Preparar dos jeringas de 1 ml equipada con una aguja de 30 Gcon 100 l de heparina (1.000 unidades / ml).
- Cortar un trozo de 5 cm de seda 5-0 quirúrgica. Atar un nudo suelto en la seda quirúrgica con un extremo doble de larga que la otra. Colocar sobre la cánula de calibre 25, pero no apriete. Repita para el otro 25 G cánula.
- Llenar cuatro 35 mm placas de Petri estériles (# 1-4) con 2 ml de, enfriada con hielo, HBSS sin rojo fenol estéril. Mantener en hielo.
2. La eutanasia, el aislamiento del corazón y la canulación
- Antes del aislamiento del corazón, asegúrese de que la solución de digestión y cónico de 50 ml de solución de parada están calientes. Retire la jeringa llena con HBSS-25 G unida cánula del hielo y colocar en una pinza de bureta (o abrazadera de soporte del anillo) en un soporte de anillo.
- Anestesiar a los ratones utilizando 3% de isofluorano. Confirmar el ratón se anestesia por un toque del dedo del pie en cada extremidad posterior. Si los espasmos en las piernas, el ratón aún no está anestesiado por lo espere 1 minuto y repita el toque del dedo del pie.
- Exponer la vena yugular mediante la eliminación de la piel de unand piel en la parte anterior del cuello con unas tijeras. A continuación, el uso de fórceps para quitar cuidadosamente la grasa que rodea la vena yugular. Después de la eliminación de grasa, inyectar lentamente 100 l de heparina (1.000 unidades / ml). Coloque una esponja quirúrgica sobre la vena para evitar el sangrado excesivo.
- Después de 1 minuto, a tórax abierto para exponer el corazón, corazón ascensor con pinzas curvas y consumo de la que el uso de tijeras, asegurándose de mantener intacta la aorta ascendente a través de la primera rama braquiocefálico. Inmediatamente colocar el corazón en una placa de 35 mm (# 1) con helado de HBSS sin rojo fenol y enjuague.
Nota: Realice los siguientes 4 pasos con un microscopio de disección. - Posicionar el 25 G cánula que se monta en el soporte de anillo en un ángulo de 45 ° para que la punta se encuentra justo debajo de la superficie de HBSS enfriado con hielo en un plato # 2 y es claramente visible a través del microscopio de disección. Transferir el corazón al plato # 2.
- El uso de pinzas Dumont, exponer la aorta quitando suavemente el exceso de tejido adiposo mediante disección roma appunción revenir o desgarro de la aorta. A continuación, el uso de fórceps para deslizar la aorta por encima del 25 G cánula.
- Guía de la cánula hacia abajo a través de la aorta, cerca de, pero no más allá de la válvula aórtica, que pondrá en peligro la integridad de la válvula y por lo tanto, la perfusión retrógrada. Una vez que la cánula está en su lugar, deslice la seda pre-atada sobre la aorta, y apriete. Ate un segundo nudo para formar un nudo cuadrado alrededor de la aorta para garantizar el corazón.
- Una vez que la aorta está ligado de forma segura, lave cuidadosamente el resto de la sangre de la circulación coronaria con el HBSS enfriado con hielo en la jeringa conectada a la cánula 25 G. Tenga cuidado de no empujar demasiado para evitar la presión excesiva coronaria. Sólo se requiere un color muy lento y suave para completar la descarga. canulación aórtica sin fugas también se puede observar en esta suave al ras.
- Encienda la bomba de perfusión para iniciar el flujo de HBSS. Retire la cánula 25 G (adjunta con el corazón) de la jeringa llena de HBSS, teniendo cuidado demantener el cubo de la cánula llena con HBSS, y conectarlo a los serpentines de calefacción calientes rellenos de HBSS. Comience la perfusión del corazón con la bomba de perfusión a una velocidad de 0,5 ml / min durante 8 min.
- Después de la primera corazón se canula y se perfundió en el sistema, repita los pasos 2.1 a 2.8 para el segundo corazón. Estos aislamientos serán escalonados para cada corazón, por lo tanto se requiere una cuidadosa planificación y el calendario.
3. La digestión
- Después de lavar con HBSS, cambiar la 10 ml jeringa HBSS actualmente en la bomba para uno lleno con 10 ml de solución de digestión pre-calentado. Perfundir cada corazón con solución de digestión de 12 minutos a una velocidad de 0,5 ml / min. No recoger las fracciones derivadas de esta primera digestión, ya que contendrá cualquier sangre remanente y las células endoteliales.
- Después de 12 min, cambiar la velocidad de perfusión de 0,4 ml / min, colocar una cónica 15 ml (A1 tubo o B1, correspondiente a la primera o segunda corazón para cada digestión) lleno de solut parada fríaión en un cubo de hielo, bajo el corazón con el fin de iniciar la recopilación de perfusión CMLV enriquecida.
- Después de 15 min, cambiar el cónica colección para A2 tubo o tubo B2 y cónica giro A1 y B1 en 89 xg durante 10 min inmediatamente después de la recogida de las dos fracciones. Cuando la jeringa llena con la solución de la digestión de la bomba con menos de 1 ml de solución, reemplazar con un llenado recién jeringa 10 ml de solución de digestión.
- Después de la centrifugación, aspirado de sobrenadante de cada tubo de recogida, dejando aproximadamente 0,5 ml. Resuspender pellet de A1 con 2 ml de solución de parada en caliente (o medio de siembra). Añadir resuspensión del tubo de A1 a B1 tubo y el tubo lugar en la incubadora a 37ºC con la tapa suelta.
- Repita los pasos 3.3 y 3.4 hasta que todos los tubos (a A6 y B6) se utilizan durante un tiempo total de 90 min de recogida. A 80 minutos de la digestión, cortar el ápice del corazón para eliminar cualquier célula que pueden estar atrapadas dentro del ventrículo y recoger estas células en el tubo A6 y B6, respectively.
Nota: De vez en cuando el corazón se caerá la cánula antes del punto de tiempo de 90 min. Si esto ocurre, recuperar el corazón y el lugar en un 35 mm placa de Petri estéril llena con 2 ml de solución de digestión. Cortar la punta del corazón y enjuagar suavemente el corazón con solución de digestión. A continuación, filtrar los 2 ml de solución de digestión a través de un colador de células estéril micras 100 en una cónica 50 ml y añadir a A6 tubo o B6. - Después de cada giro de los tubos subsiguientes (A2 y B2), añadir las CMLV resuspenderse para el tubo de recogida anterior (combinado A1 y B1). Además, tenga cuidado de no dejar que la solución de digestión en la bomba y se queda sin cambiar las jeringas de 10 ml como sea necesario a lo largo de la digestión.
- Después de que todos los tubos se combinan, se centrifuga la suspensión VSMC-rico a 89 xg durante 10 min.
- Aspirar tanto sobrenadante de los tubos de recogida como sea posible. Resuspender el sedimento restante en 2 ml de chapado medios de comunicación y la placa en una placa de cultivo de 35 mm. Lugar placa de cultivo in incubadora a 37ºC durante 24 horas.
4. Cultura de la célula
Nota: Complete los pasos restantes de la cabina de bioseguridad.
- Después de 24 horas, aspirar suavemente el medio de siembra. La cultura tendrá normalmente una gran cantidad de escombros. Para lavar las células, añadir 2 ml de tibia, PBS estéril y golpee suavemente el plato contra dos dedos mientras se gira en sentido horario.
- Después de girar 360 °, aspirar el PBS y repetir una segunda vez. Aspirar el PBS y añadir otros 2 ml de PBS estéril, caliente. Compruebe la placa de cultivo bajo el microscopio para asegurarse de que hay muy poco o ningún residuo en la placa. confluencia celular también se puede determinar en este momento.
- Si los desechos se mantiene en la placa de cultivo, repita el paso 4.2. Si la placa de cultivo esté libre de escombros, aspirar el PBS y añadir 2 ml de medio de siembra caliente.
- Después de 24 horas, se lavan las células una vez más con agua tibia, PBS estéril para eliminar cualquier residuo final o células muertas de la cultura. Aspirar el PBS y pata para otros 2 ml de medio de siembra caliente en las células.
- Comprobar en las células de todos los días y alimentar cada 48 h con medio de siembra frescas calentado. En este punto, las células se pueden utilizar para ensayos de cultivo celular estándar. CMLV deben ser aproximadamente 80% confluentes 4-5 días después de la siembra, aunque puede tardar hasta 7 días hasta que se perfeccionó el procedimiento. Si la división de pasajes posteriores, utilice un máximo de 1: 4 platos de 35 mm (o de un área comparable de placas de cultivo).
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Representative Results
Debido al aspecto novedoso de nuestra técnica de aislamiento CMLV coronaria, hemos tratado de determinar la pureza de la celda de aislamiento. CMLV coronarias de ratón se identificaron en base a su morfología y tinción de inmunofluorescencia hasta el paso 2. Basándose en la morfología de las células en cultivo después del primer lavado, el procedimiento de aislamiento elimina eficazmente los miocitos cardíacos y las células endoteliales. Las CMLV conservan su morfología hasta el paso 2 (Figura 1). Sin embargo, existe la posibilidad de contaminación por fibroblastos adventicios e intersticiales. Para descartar este potencial factor de confusión, teñidas células aisladas para SM22α, α-actina de músculo liso (α-SMA), ambos marcadores VSMC 7,8, y vimentina, un marcador de fibroblastos 9, en pasajes 1-2 (Figura 2). Hemos observado ningún cambio de estos marcadores a través del paso 2. También se muestra que nuestro aislamiento de células carece de CD31 / tinción PECAM (coron humanacélulas endoteliales microvasculares ary utilizados como control positivo), indicando la ausencia de contaminación de las células endoteliales usando este protocolo de aislamiento. Colectivamente, nuestro procedimiento de aislamiento de células produce una población casi puro de CMLV de la circulación coronaria y ahora se puede utilizar para la experimentación adicional.
Figura 1: CMLV. Coronarias cultivadas representativas CMLV cultivadas coronarias (paso 2) aislados de ratones heterocigotos db / db proyectado en un aumento de 10X en condiciones de contraste de fase de campo claro. Las barras de escala = 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: inmunofltinción de fluorescencia de CMLV coronarias cultivadas. plateada CMLV coronarias de heterocigotos (db / db) en ratones pasajes 1-2 marcadas con anticuerpos para SM22α, α-SMA, vimentina y CD31 / PECAM. Imágenes tomadas en un aumento de 10X. Ningún cambio significativo se observó con el pasaje. Las barras de escala = 100 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El propósito de este estudio fue adaptar los protocolos de aislamiento de células existentes para aumentar el rendimiento de liso vascular coronaria del corazón murino. La mayor parte del trabajo pionero en la biología del músculo liso vascular se realizó con células de músculo liso de aorta de rata cultivadas. Estos estudios proporcionan conocimientos fundamentales de los mecanismos moleculares que controlan el crecimiento de VSMC, migración y la hipertrofia 7. Sin embargo, como el campo avanzaba, se hizo evidente que VSMC fenotipo y la función estaba controlado por una serie de factores específicos de la cama vascular. Por ejemplo, en comparación con los vasos periféricos, las arterias coronarias muestran diferentes respuestas funcionales, muestran distintos patrones de crecimiento en las respuestas a la lesión y muestran una gama única de canales, receptores y moléculas de señalización 10,11. El lecho coronario también está expuesta a fuerzas hemodinámicas únicas, ya que los vasos se comprimen durante la sístole por el miocardio de contratación. Nuestro trabajo reciente sugiere que coronremodelación microvascular aria de tipo 2 ratones diabéticos db / db difería de los vasos de resistencia de la aorta y mesentérica 1,12. Para comprender los mecanismos moleculares que dan cuenta de estas diferencias, los estudios in vitro utilizando el paso bajo las CMLV son necesarios. Aunque hay una variedad de diferentes y bien establecidos métodos para aislar y cultivar las CMLV de arteria aorta o mesentéricas murinos, en la actualidad, sólo hay un estudio que se ha publicado sobre el aislamiento de CMLV del ratón circulación coronaria 3.
En este protocolo, se demuestra un método mejorado para el aislamiento de CMLV murinos primarios de la circulación coronaria. Nuestro protocolo se basa libremente en uno publicado por Teng et al. 3. Las modificaciones que hemos aplicado a la técnica original proporcionan una población enriquecida y más alto rendimiento de CMLV. Los pasos críticos necesarios para lograr estos resultados incluyen la correcta colocación de la cánula, a ras suaveING del corazón para eliminar el exceso de sangre, y el corte de la punta del corazón al final de la digestión. De los tres, la colocación de la cánula es de la mayor importancia. La circulación coronaria se perfunde de la ostia coronaria justo distal a la válvula aórtica. Por lo tanto la interrupción de la integridad de la válvula a través de inserción de la cánula en la cámara ventricular izquierda dará lugar a mala perfusión coronaria y una reducción dramática en el número de CMLV viables. lavado suave de la circulación coronaria no sólo eliminará el exceso de sangre desde el sedimento final utilizado para el cultivo, sino también determinará si se consigue la correcta colocación de la cánula. Por último, durante la digestión, algunos CMLV pueden quedar atrapadas dentro de los ventrículos, reduciendo así el vértice en la conclusión de la digestión se liberar las células y producir una mayor confluencia en placas.
Una modificación importante que puede ser utilizado es el uso de una aguja G 25 sonda o un Aparato de cannul aorta ratón Harvarduna en lugar de la cánula de la aguja. Sin embargo, cuando se utiliza la aguja de sonda, hay que tener mucho cuidado de no bloquear los orificios coronarios con el balón en el extremo de la aguja. La etapa de lavado suave revelará si es necesario un ajuste de la aguja antes de la perfusión. Además, el tipo de colagenasa utilizado en la solución de digestión es importante para el aislamiento de VSMC óptima. Colagenasa tipo II no es puro - contiene otras enzimas tales como tripsina, clostripaína, y caseinasa. Por lo tanto, la cantidad de inhibidor de tripsina de soja añadido a la solución de digestión puede ser necesario ajustar en base a la cantidad específica de colagenasa utilizado en la digestión.
Una limitación de esta técnica es que CMLV de toda la circulación coronaria son aislados. Nuestros estudios anteriores se centraron en los microvasos coronarios (80-120 micras de diámetro) de 1,2, sin embargo, las principales arterias coronarias en los ratones son más grandes (> 160 m) 13. Además, esta tecnologíanique también aísla las células de la circulación venosa coronaria, no sólo la circulación arterial.
Si bien la técnica de Langendorff se ha utilizado durante más de 100 años, los más recientes avances de la manipulación del genoma del ratón (por ejemplo knock-in, knock-out, mutaciones) proporcionan una oportunidad única para utilizar nuestra técnica actualizada para una amplia variedad de aplicaciones. Después del aislamiento y cultivo, las células se pueden usar para experimentos adicionales, incluyendo la infección viral y el tratamiento con agentes farmacológicos. El uso conjunto de los ratones modificados genéticamente y cultivos celulares norma permitirá una investigación más profunda de las CMLV de la circulación coronaria murino.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R01HL056046 a PAL y K99HL116769 a AJT), y el Instituto de Investigación del Hospital Nacional de Niños (para PAL y AJT).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
| HEPES 1 M solution | Fisher | MT-25-060 | |
| Primocin - 20 ml | Invivogen | ant-pm-2 | |
| DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
| MEM NEAA 10 mM 100x | Life Technologies | 11140-050 | |
| L-Glut 200 mM - Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
| Sterile Cell Strainer 100 µm nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
| Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
| Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
| Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 25 mg | Sigma | T6522 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
| 5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
| 11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
| Circulating heated water pump | any brand will work |
References
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