Summary
이 원고는 실험실 쥐의 전립선 마이크로 해부 및 수술 거세에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한이 프로토콜에 의해 생성 된 대표적인 결과를 도시한다. 마지막으로, 우리는 장점과 이러한 프로토콜의 사용에 대해 설명합니다.
Introduction
전립선은 미국에서 남성 암의 가장 흔한 사이트입니다. 매년 전립선 암으로 진단됩니다 거의 220,000 남자, 약 27,000 남자는 질병 일에 굴복한다. 남성은 미국 1에서 전립선 암 진단 1 7 일생 위험이 있습니다. 양성 전립선 비대증 (BPH), 전립선의 연령과 관련된 비 암성 확대는 80 이상이 남성의 80 %에 영향을 미치는, 또한 광범위한 조건이다. 이와 같이, 전립선은 많은 연구의 초점이다.
마우스 모델은 3 전립선 질환을 연구하기 위해 널리 사용되어왔다. 전체 마우스 인간 전립선 선 (4)의 우수한 대표하지만, 유사성과 마우스 및 인간 전립선 해부학 생리학 (5) 사이의 차이가있다. 두 종에서 전립선은 요도를 둘러싸고, 방광의 기지에 위치해 있습니다. 인간의 전립선은 단일 보라입니다중앙, 전환, 주변 장치 및 전방 fibromuscular 기질 : 네 개의 구역으로 분할합니다. 전방, 복부 및 배면 측면 : 반대로 마우스 전립선 요도 주위의 상이한 위치에서 세 쌍의 돌출부로 구성된다. 세포 수준에서의 주된 차이점은 인체 내강의 셀 비율은 기저 세포가 1인지 : 1이지만 1 : 생쥐 6 4. 뮤린 기질은 인간에 대해 생쥐에서 다르다 - 근육 층 쥐 전립선 훨씬 얇다 동안 인간은, 더 광범위한 평활근있다. 마우스 전립선의 적절한 식별, 해부, 취급 마우스 전립선 연구에 필수적이다.
호르몬 대폭 인간 및 마우스 모두에서 전립선의 발달 및 항상성에 영향을 미친다. 에스트로겐 전립선 개발 7 역할을 보이는 반면, 전립선 암에서 가장 중요한 호르몬 테스토스테론이다. 테스토스테론은 선의 개발을 위해 필수적이다D 관리. 중 물리적 또는 화학적 거세에 따라, 약 90 성인 전립선 apoptose의 내강 세포의 %, 그리고 선이 줄어 듭니다. 테스토스테론은 거세 조건 하에서 개별적으로 재 도입되는 경우, 전립선 전체 용량 자체를 다시 생성 할 수있다. 테스토스테론은 남성 호르몬 결핍의 치료에 일반적으로 사용되는 치료 전략 이유 전립선 암을 유도하는 것으로 보인다. 그러나 많은 전립선 암은 안드로겐 박탈에 저항하게된다. 또한, 전립선 암의 안드로겐 결핍 치료 요법을받은 남성 거세 및 재생 조건이 사이클을 겪는다. 마우스에서 수술 거세는 남성 호르몬을 재 도입하여 전립선의 호르몬 재생과 함께 거세 저항성 전립선에 테스토스테론 순환의 효과를 연구 할 수있는 중요한 도구입니다.
이 글에서, 우리는 토론하고 locat입니다하기로 적절한 기술을 시연 할 예정이다전자 마이크로 해부 마우스 전립선뿐만 아니라 마우스를 외과 적 거세하기.
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Protocol
이 프로토콜은 충족하고 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회가 설정 한 가이드 라인을 따른다.
1. 마우스 전립선을 마이크로 - 해부
- 이산화탄소 질식이나 기관 동물 관리 및 사용 지침서에 따라 다른 방법에 의해 승인 된 마우스를 안락사.
- 네 발 각을 통해 핀을 넣어 해부 보드에 부정사 위치에 마우스를 고정.
- 70 % 에탄올로 복부를 스프레이.
- 집게와 하복부의 피부를 잡고, 피부의 실수로 모든 장기를 절단하지 않도록주의 음경의 개방, 약 1cm의 전방을 복막 가위를 사용합니다.
- 복강을 노출, 하복부, 흉곽에 복부의 최대 양쪽에서 피부와 복막을 버려야.
- 방광 및 비뇨 기관을 식별하고 부드럽게 옆으로 지방과 다른 기관을 이동하여 그들을 노출.
- USING 포셉, 그립 요도 근처 기지에서 정관을하고, 그것을 멀리 눈물.
- 반대 정관으로 반복합니다.
- 동시에 방광과 복부 전립선 (방광의 기초 아래 약 1cm) 아래 요도를 통해 절단 가위를 사용하는 동안주의 깊게, 방광을 그립 집게를 사용하고 당기십시오.
주 : 방광이 인상되기 때문에, 전체 비뇨 기관 (함유 방광, 요도, 모든 전립선 돌출부 및 정낭의 단면)이 함께 제공된다. 약간의 저항이있을 수 있습니다. - 약 5-10 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 함유하는 60-100mm 페트리 접시에 비뇨 기관 (UGT)를 놓는다.
- 해부 현미경 프로토콜의 나머지 부분을 수행한다. 이 미세 집게, 각 손에 하나를 사용하십시오. "연필과 같은"는 집게를 잡고 그들을 안정 할 수 있도록 벤치 위에 팔을 휴식.
- 방광이라는 UGT 같은 위치를 미세 핀셋을 사용하여위에 요도 아래로 지적되고 정낭 방광의 양측에 위치된다.
- 그립 하나 집게 조심스럽게와 요도는 전립선 조직을 멀리 찢어하지 않고 다른 집게와 멀리 지방을 빼냅니다. 참고 : 지방이 주변 조직에 "반짝"상대적으로 표시됩니다.
- 지방이 제거되면, 전립선 개의 복부 로브 사이의 결합 조직을 찢고 구분 집게를 사용한다.
- , 복부 로브 중 하나를 제거 팁 근처에 그립에 하나의 복부 로브를 하나 집게를 사용하여 그립에 다른 집게를 사용하려면이 가능한 요도에 가깝게 기지에서 로브. 여전히 로브의 기초를 파지하는 동안 그립에 다른 집게 요도를 사용합니다. 기업, 부드러운 움직임으로 떨어져 요도에서 로브를 당깁니다. 확실히 더 전립선 조직이 요도에 부착 남아합니다. 다음 실험 단계에 따라 적절한 매체에 로브를 놓습니다.
- 수정하고들 파라핀은-포함하려면충분한 조직 학적 분석을 위해, 10 % 중성 완충 포르말린 (NBF) 8의 로브를 배치합니다.
- 냉동 보존를 들면, 10월 등의 매체를 동결하고 8 절편의 로브를 놓습니다.
- 문화 단일 세포 분리를위한 차가운 PBS의 로브를 놓고 9 유동 세포 계측법.
- 다른 복부 로브와 단계를 반복 1.15.
- 확인 정낭에 구멍 않도록주의하면서 조심스럽게 거리 정낭에서 로브를 당겨 집게를 사용하여, 전방 로브 중 하나를 제거하십시오. 로브는 정낭의 독립되면, 단계 1.15에서 복부 로브와 같은 방식으로 제거합니다.
- 다른 전방 로브와 단계를 반복 1.17.
- 지느러미 전립선이 표시되도록를 통해 나머지 비뇨 기관 플립.
- 두 배면 측면 로브 또한 로브와 t 사이의 결합 조직 사이의 결합 조직을 찢어 집게를 사용하여 배면 측면 로브 중 하나를 제거하려면그는 정낭의 영역을 후부. 단계 1.15에서 복부 로브와 유사한 방식으로 로브를 제거합니다.
- 다른 배면 측면 로브와 단계를 반복 1.20.
2. 수술 거세
참고 :이 생존 수술이기 때문에, 무균, 마취 및 통증 관리는이 프로토콜의 윤리적 및 성공적인 완료에 중요하다. 모든 기관 동물 관리 및 사용 지침을 따르십시오. 저체온증을 방지하기 위해 수술 중 이러한 재순환 물 블랭킷 같은 외부 열원을 사용한다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. 수술에 사용하기 전에 모든 수술 도구를 압력솥.
- 깨끗한 무균 표면에 적절한 조치 (예를 들면 2 % 흡입 이소 플루 란)를 사용하여 마우스를 마취하고, m 위치부정사 위치에 여러개. 참고 예 케타민 마취 같은 대체 방법들이 또한 사용될 수 있고, 승인 동물 프로토콜에 따라.
- 발가락을 곤란하게하여 마우스의 반사 신경을 확인합니다. 마우스가 반응하지 않는 경우, 다음 단계로 진행합니다. 이 반응 할 경우, 1-3 분 후에 다시 확인합니다. 전기 면도기로 수술 영역을 면도.
- 무균 기관 수의 직원이나 IACUC에서 권장하는 70 % 에탄올 및 요오드 또는 절차의 교류 스크럽을 사용하여 마우스의 복부를 준비합니다.
- 멸균 메스를 사용하여 음경에, 하복부의 중간 선에서 약 1.5 cm 전방을 피부를 통해 1 cm 수직 절개를합니다.
- 주의 모든 장기를 절단하지, 복막을 통해 작은 절개 (<1cm)을 확인합니다.
- 멸균 집게 그립 복막의 절단 가장자리를 사용하여 아래 복강를 참조 할 수 있도록 조심스럽게 들어 올립니다.
- 다른 멸균 집게를 사용하여, 일에 도달전자 방광에 측면 복강 그립 중 하나를 왼쪽 또는 오른쪽 고환 지방 패드. 고환뿐만 아니라 빠져 나올 때까지 복막과 피부의 구멍을 통해 지방 패드를 당깁니다. 이 단계에서 다른 조직이나 장기를 손상하지 않도록주의하십시오.
- 소작 펜을 사용하여 고환을 잡고 지방 패드를 통해 절단. 소작 펜 주와 고환 동맥을 통해 천천히 잘라 : 고환 동맥이 너무 빨리 절단하는 경우가 너무 많은 출혈 일 수 있으며, 마우스를 안락사해야 할 수 있습니다.
- 지방 패드와 동맥이 절단되면, 고환과 지방 패드를 제거합니다.
- 를 반복하여 다른 정소와 2.6-2.9 단계를 반복합니다. 참고 : 고환의 제거를위한 다른 방법은 수술 가위로 용기를 절단 다음에 고환 동맥을 결찰하는 것입니다.
- 복막은 흡수성 봉합사로 폐쇄 봉합.
- 스테이플 피부는 수술 상처 클립을 마감했다.
- 통증을 관리 할 수있는 진통제를 관리, 및 장소5 ~ 10 분 동안 따뜻한 케이지에 깨끗한 케이지에서 마우스. 통증이나 출혈의 흔적이 마우스를 모니터합니다.
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Representative Results
여섯 전립선 로브는 전립선의 미세 절개를 통해 마우스 (그림 1)에서 제거되었습니다. 전체 비뇨 기관 (UGT)은 모든 전립선 로브 방광, 정낭, 요도 (도 1a)로 구성된다. 정관 요도에 부착하지만, 전립선 미세 해부 불필요하며, 따라서 요도 (도 1b 내지도 1c)를 절단하여 UGT의 제거 전에 분리 될 수있다. 비뇨 생식 기관이 함께 남아 한 번 복부 (그림 1D)에서 제거됩니다. 이 시점에서, 전립선은 UGT 로브 (도 1E)에 접근하기 위해 제거 될 필요가 지방 조직에 덮여 유지. 여섯 개의 돌출부 (복부, 전방 및 배면 측면 쌍) 방광 기지 요도 주변을 알 수있다. 순수 전립선 조직이어서 (도 1F) 상기 프로토콜 다음 제거 될 수있다. 이 로브 할 수있다추가 분석을 위해 적절한 중간에 배치 될 수있다.
거세 테스토스테론의 주요 생산자 고환의 제거이다. 거세되는 전립선 (도 2a)를 회귀 가리 발생까지 테스토스테론 마우스에 존재한다. 테스토스테론의 재 도입을 통해 호르몬 재생이 거세 (그림 2b)을 수행 할 수 있습니다. 우리는 호르몬 재생의 2 사이클 다음에, 거세를 수행하고, 테스토스테론 수준은 ELISA (그림 3)에 의해 마우스 혈청에서 관찰 하였다. 거세 조건 테스토스테론 수준 사실상 사라진다. 대안 적으로, 타목시펜 (선택적 에스트로겐 수용체 조절제)는 호르몬 정상 상태에 큰 차이를 보이지 않는다. 거세 후, 테스토스테론은 테스토스테론 수준을 극적으로 (도 3) 스파이크 유발 마우스에 다시 도입 하였다. 우리는 그 다음 전립선 리터를 마이크로 해부쥐의 유체 이탈 경험과 개별 전방 로브 (그림 4a)로 군데. 우리는 또한 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 및 조직을 절단.도 4b 정상에서 헤 마톡 실린 및 에오신 스테인드 전방 전립선 조직을 보여줍니다 거세 및 조건을 재생. 거세 전립선 로브는 십분 정상적인 전립선의 크기를 대략 축소, 그리고 호르몬의 재생은 원래 크기로 전립선을 복원합니다.
그림 1 : 전립선 마이크로 해부 프로토콜의 총 조직학. (a) 쥐 복부에 노출 된 천연 상태에서 비뇨 기관 (UGT). 점선 ()는 전방 전립선 (AP) 및 복부 전립선 (VP 여기에서 볼 수 있습니다) 정낭 (SV), 전립선 로브를 포함하여 UGT의 다양한 부분을 포함 (위치 수, 방광 (B), 및 요도) 블래 노라. 정관 (VD)도 볼 수 있습니다. (b) 정관이 제거되었다. 정관이 제거 된 영역에있는 화살표를 가리킨다. (c) 상기 UGT는 복측 전립선 돌출부 아래 요도를 절단하여 복부에서 제거되었다. (d)를 UGT는 PBS에 배치되었으며, 해부 현미경 아래에서 볼 수있다. (마) 지방은 전립선의 여섯 로브의 가시성에 대한 허용하는 UGT에서 제거되었습니다. 화살표는 두 전방 로브 복부 로브 및 배면 측면 로브 가리. (바) 모든 여섯 개인 전립선 로브가 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 팀테스토스테론이 사라질 때 거세 및 호르몬 재생을위한 엘린. 테스토스테론이 거세까지 생리 학적 수준에서 존재 (a)는, 전립선의 회귀가 시작됩니다. 테스토스테론이 재 도입 될 때까지 (b)는 거세는 전립선의 호르몬 재생을 일으키는 원인이 테스토스테론을 제거합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. 아래 각종 호르몬 조건에서 테스토스테론 ELISA 테스토스테론 수준은 호르몬 정상 처리 거세 및 호르몬 조건을 재생 타목시펜. 재생 × 2는 합성 테스토스테론의 두 번째 라운드의 주입에 의해 다음, 주입 및 합성 테스토스테론의 제거를 의미한다. 오차 막대는 스탠을 나타냅니다dard 편차. 이 그림 5에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 거세 및 재생 조건 하에서 전립선 외관, 거세 호르몬 정상 및 호르몬 재생 조건에서 전방 전립선 엽 (가) 총 모양.. 재생 × 2는 합성 테스토스테론의 두 번째 라운드의 주입에 의해 다음, 주입 및 합성 테스토스테론의 제거를 의미한다. (b)는 포르말린 고정, 파라핀 포함 된 전방 전립선 엽 절단과 헤 마톡 실린 및 에오신으로 염색. 대형을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 R 버전입니다.
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Discussion
전립선 마이크로 해부 엽 특정 실험과 마우스 전립선 분석 (그림 1)을 허용한다. 유전자 조작 마우스 모델에서 표현형은 다른 사람에 보이지 않는 하나의 엽에서 볼 수있다. 또한, 조직 학적 분석을 위해,이 프로토콜은 순수한 전립선 조직의 최대 양 단면에 존재하는 다른 비뇨 기관 조직없이 절편 염색 될 수 있다는 것을 보장한다. 마지막으로, 단일 세포 실험이 프로토콜은 거의 순수한 전립선 세포의 격리를 허용한다. 상피 세포 농축 키트는 더 기질 세포에서 전립선 세포를 정화 할 수 있습니다. 마이크로 해부에 제한은 해부 현미경을 통해 보는 동안 미세 집게를 사용하는 데 필요한 해부 현미경의 사용, 학습 곡선을 포함한다. 대안 적으로, 전립선 조직은 미세 해부 불필요한 만드는 UGT의 일부로 조직학을 위해 절단 될 수있다. 그러나, 전체 UGT를 절편의 단점은 것입니다다른 조직은 깨끗하지 만드는 부분에 존재한다. 또한, 단일 전립선 세포 집단을 생성하기위한 상기 돌출부는 오염을 방지하기 위해 UGT로부터 분리되어야한다.
수술 거세는 많은 전립선 연구소에 대한 근본적인 수술과 전립선 개발 및 질병에 테스토스테론의 영향에 대한 연구에 필수적이다. 이 프로토콜은 (숙련 된 사용자를위한 수술의 일반적인 시간은 약 5 분입니다) 빠르게 순환에서 테스토스테론의 거의 100 % (그림 3)을 제거합니다. 참고로, 쥐에서 테스토스테론 수치는 유의 한 차이가, 마우스 (10) 마우스에서만큼 30 배에 따라 다를 수 있습니다. 거세는이 변화를 제거합니다. 거세 후, 연구진은 전립선 (- 4 그림 3)를 재생하기 위해 다시 테스토스테론을 추가하는 결정할 수 있습니다. 이는 같은 삼투 펌프, 테스토스테론 같은 남성 호르몬의 소스를 주입하는 피하하여 수행 할 수 있습니다펠릿, 분말 또는 테스토스테론 (8)를 포함하는 반투과성 실라 스틱 튜브. 추가 테스토스테론의 양에 따라,이 절차는 순환 (도 3)에서의 테스토스테론 수준 superphysiological 생리을 제공 할 수있다. 이 프로토콜은 또한 전립선 세포 계통 연구 및 세포 생물학 (11)를 막기 위해 사용될 수있다. 또 다른 옵션은 두타 스테 리드 (12) 테스토스테론의 생성을 억제하는 화합물, 생쥐의 처리를 통해 화학적 거세, 안드로겐 결핍 또는 치료이다. 이는 또한 외과 적 거세 거의없는 전립선 암 환자의 일반적인 치료를 모방. 그러나, 수술 거세 거의 모든 테스토스테론의 제거를위한 신뢰할 수있는 영구적 인 방법을 제공한다. 이 부신에도 불구하고, 고환에 비해 훨씬 더 적은 양을 테스토스테론으로 전환시킬 수있다 안드로 스텐 디온 및 데히드 등의 안드로겐 종을 합성하는 것으로 고려하는 것이 중요이 과정은 더 어렵지만 (13). 일부 경우, 부신도 수술을 제거 할 수있다.
전반적으로,이 두 프로토콜은 전립선 질환에 대한 연구의 무수한뿐만 아니라 호르몬 연구에 유용하다. 이러한 프로토콜은 거세, 호르몬 정상, 또는 호르몬 재생 조건에서 전립선 생물학을 분석 할 수있는 안정적이고 일관성있는 방법입니다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 원고의 수치 중 일부는 넉넉한 바트 O. 윌리엄스의 실험실에 의해 제공되었다. 저자는 U54CA143803, CA163124, CA093900, 및 CA143055는 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 부여 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
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