Summary
Dette manuskriptet beskriver protokollene for prostata mikro-disseksjon og kirurgisk kastrering i laboratoriet mus. Vi viser også representative resultatene som produseres av disse protokollene. Til slutt diskuterer vi fordeler og utnyttelse av disse protokollene.
Introduction
Prostata er den vanligste stedet for kreft hos menn i USA. Nesten 220 000 mennesker hvert år vil bli diagnostisert med prostatakreft, og ca 27 000 mennesker vil bukke under for sin sykdom 1. Menn har en 1 i 7 levetid risiko for prostatakreft diagnose i USA en. Benign prostatahyperplasi (BPH), en aldersrelatert noncancerous forstørrelse av prostata, er også en utbredt tilstand, påvirker over 80% av menn over 80 to. Som sådan, er prostata fokus for betydelig forskning.
Musemodeller har blitt brukt mye for å studere sykdommer i prostata 3. Totalt sett er musen prostata en utmerket representant for den menneskelige kjertel 4, men det er likheter og forskjeller mellom mus og menneske prostata anatomi og fysiologi 5. I begge artene, er den prostata plassert på undersiden av blæren rundt urinrøret. Den menneskelige prostatakjertel er en enkelt lovære, delt inn i fire soner: sentral, overgang, perifer, og anterior fibromuscular stroma. I motsetning til musa prostata består av tre sammenkoblede fliker på forskjellige posisjoner rundt urinrøret: fremre, ventral, og dorsolateral. På cellenivå, er hovedforskjellen at basal celle til celle luminal-forholdet hos mennesker er ca. 1: 1, men det er 1: 4 i mus 6. Den murine stroma er også forskjellig i mus i forhold til mennesker - mennesker har mer omfattende glatt muskulatur, mens muskelen laget er mye tynnere i murine prostata. Riktig identifisering, disseksjon og håndtering av musen prostata er avgjørende for mus prostata forskning.
Hormonnivået drastisk påvirke utviklingen og homeostase av prostatakjertelen hos både mennesker og mus. Mens østrogen ser ut til å spille en rolle i utvikling prostata 7, er det viktigste hormonet i prostata er testosteron. Testosteron er viktig for kjertel utvikling end vedlikehold. Etter enten fysisk eller kjemisk kastrering, omtrent 90% av den luminale cellene i voksen prostata apoptose, og pakkboksen krymper. Hvis testosteron gjeninnføres til et individ i henhold til kastrerings betingelser, prostata er i stand til å regenerere seg selv til full kapasitet. Testosteron ser også ut til å kjøre prostatakreft, som er grunnen til androgen deprivasjon terapi er en vanlig terapeutisk strategi. Men mange prostatakreft blir resistent mot androgen deprivasjon. I tillegg menn som gjennomgår androgen deprivasjon terapi for behandling av prostatakreft gjennomgå sykluser av kastrerte og regenerert forhold. I mus, kirurgisk kastrasjon, sammen med hormonelle regenerering av prostata ved å gjeninnføre testosteron, er et viktig redskap for å studere kastrering motstand og effekten av testosteron sykling på prostata.
I denne artikkelen vil vi diskutere og demonstrere de riktige teknikkene ved å Locate og mikro-dissekere en mus prostata, så vel som å kirurgisk kastrering en mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen møter og følger retningslinjer fastsatt av Johns Hopkins University Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Micro-dissekere en mus prostata
- Avlive musen ved karbondioksidasfyksiering eller en alternativ godkjent metode i henhold til institusjonelle dyrepleie og retningslinjer for bruk.
- Pin mus i en liggende stilling til en disseksjon bord ved å sette en pinne gjennom hver av de fire poter.
- Spray magen med 70% etanol.
- Hold i huden av den nedre del av magen med tang, og bruke saks for å skjære gjennom huden og peritoneum omtrent 1 cm anterior til åpningen av penis, forsiktig med å kutte noen organer.
- Skjær bort huden og bukhinnen fra nedre del av magen, opp begge sider av magen til brystkassen, utsette bukhulen.
- Identifisere blæren og urogenitaltraktus, og utsette dem ved forsiktig bevegelse fett og andre organer til siden.
- USIng tang, grep sædlederen på basen i nærheten av urinrøret, og rive den bort.
- Gjenta med motsatt sædlederen.
- Ved hjelp av pinsett, forsiktig grep blæren og trekke den opp, og samtidig bruke saks for å klippe gjennom urinrøret under blæren og ventral prostata (omtrent 1 cm under bunnen av blæren).
Merk: Som blæren er trukket opp, vil hele urogenitaltractus (som inneholder blæren, en del av urinrøret, alle prostata lapper, og sædblærene) kommer med det. Det kan være noen motstand. - Plasser urogenitaltraktus (UGT) inn i en 60-100 mm petriskål inneholdende omtrent 5-10 ml fosfatbufret saltvann (PBS).
- Utføre den resterende del av protokollen under et mikroskop disseksjon. Bruk to fine tang, en i hver hånd. Hold tang "som en blyant" og hvile underarmene på benken toppen, slik som å stabil dem.
- Bruk fin pinsett til å plassere UGT slik at blæren erpå toppen, er det urinrør peker nedover, og sæd-vesiklene er plassert på hver side av blæren.
- Grip urinrøret med en pinsett og trekk forsiktig bort fettet med de andre tang uten å rive bort noen prostatavevet. Merk: Fat vises "skinnende" i forhold til omkringliggende vev.
- Når fettet er fjernet, kan du bruke pinsett for å rive bindevevet mellom de to ventrale fliker av prostata og skille dem.
- For å fjerne en av ventral lapper, bruke en pinsett til å gripe en enkelt ventral lapp nær spissen, og bruke de andre tang for å feste det lapp på basen så nær urinrøret som mulig. Mens han fortsatt gripende bunnen av lapp, bruke de andre tang til grep urinrøret. Trekk lapp bort fra urinrøret med en fast, jevn bevegelse. Pass på at ingen prostatavevet er fortsatt knyttet til urinrøret. Plasser lapp inn i det passende medium, avhengig av den neste eksperimentelle trinn.
- Å fikse og parafin-bygge inn sgod for histologisk analyse, plasser lapp i 10% nøytral-bufret formalin (NBF) 8.
- Plasser lapp i frysemedium, for eksempel oktober, for nedfrysing og seksjonering 8.
- Plasser lapp i kaldt PBS for enkelt celle isolasjon for kultur eller flowcytometri 9.
- Gjenta trinn 1.15 med den andre ventral lobe.
- For å fjerne en av de fremre lapper Bruk pinsett til å trekke forsiktig lapp fra sædvæske, og pass på ikke å punktere sædvæske. Når lapp er uavhengig av sædblære, fjerne den på samme måte som den ventrale lapp i trinn 1.15.
- Gjenta trinn 1.17 med den andre fremre lapp.
- Vend de rester urogenitaltractus løpet slik at rygg prostata er synlig.
- For å fjerne en av dorsolateral lapper Bruk pinsett til å rive bindevevet mellom de to dorsolateral lapper og også bindevevet mellom flikene og than posterior regionen sædblærene. Fjern det lapp på en lignende måte som den ventrale lapp i trinn 1,15.
- Gjenta trinn 1.20 med den andre dorsolateral lapp.
2. Kirurgisk Kastrering
Merk: Dette er en overlevelse kirurgi, så asepsis, anestesi og smertebehandling er viktig for den etiske og vellykket gjennomføring av denne protokollen. Følg alle institusjonelle dyr omsorg og retningslinjer for bruk. Bruk en ekstern varmekilde, for eksempel en resirkulerende vann teppe, under den kirurgiske prosedyren for å hindre nedkjøling. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke returner et dyr som har gjennomgått kirurgi i selskap med andre dyr før fullt restituert. Autoklav alle kirurgiske instrumenter før bruk i kirurgi.
- På en ren, steril overflate bedøve mus ved hjelp av egnede tiltak (f.eks 2% inhalert isofluran) og plasser mOuse i liggende stilling. Merk: Alternative anestesi metoder, slik som ketamin, kan også anvendes, avhengig av den godkjente dyr protokollen.
- Sjekk musens reflekser ved å knipe tærne. Hvis musen ikke reagerer, går du videre til neste trinn. Hvis den reagerer, vent 1-3 min og sjekk igjen. Barbere den kirurgiske området med en elektrisk barbermaskin.
- Aseptisk forberede magen av musen med vekslende skrubb av 70% etanol og jod eller prosedyrer anbefalt av institusjonelle veterinær ansatte eller IACUC.
- Ved hjelp av en steril skalpell, lage en 1 cm vertikalt snitt gjennom huden i midtlinjen av den nedre del av magen, ca 1,5 cm anterior til penis.
- Lag et lite snitt (<1 cm) gjennom bukhinnen, forsiktig med å kutte noen organer.
- Ved hjelp av steril tang, grep klippekanten av peritoneum og løfte den forsiktig opp, slik som å være i stand til å se bukhulen under.
- Ved hjelp av en annen steril tang, nå i the bukhulen og grep enten på venstre eller høyre testikkel fettpute, lateral til blæren. Trekk fett puten gjennom åpningen i peritoneum og huden til testis kommer i tillegg. Vær forsiktig så du ikke skader noen andre vev eller organer under dette trinnet.
- Ved hjelp av en kirurgi penn, skjære gjennom fett puten som holder testiklene. Skjær sakte gjennom testiklene arterien med kirurgi penn Merk: Hvis testiklene arterien er kuttet for fort, kan det bli for mye blødning og musen kan måtte avlives.
- Når fett puten og arterien er kuttet, fjerne testikkel og fett pad.
- Gjenta trinn 2,6-2,9 med den andre testikkelen. Merk: En alternativ metode for fjerning av testiklene er å kirurgisk ligere den testikkelarterien, fulgt av å kutte beholderen med en saks.
- Sy peritoneum lukket med absorberbare sutur.
- Staple huden lukket med kirurgiske sår klipp.
- Administrere et analgetikum å håndtere smerte, og stedetmusen i et rent bur i et bur varmere i 5-10 min. Overvåk musen for tegn på smerte eller blødning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle seks prostata lapper ble fjernet fra en mus via prostata mikro disseksjon (figur 1). Den komplette urogenitaltraktus (UGT) er sammensatt av alle prostata lapper, blæren, sædblære, og urinrøret (Figur 1a). Vas deferens festes til urinrøret, men er unødvendig for prostata mikro-disseksjon, og kan derfor tas av før fjerning av UGT ved å kutte urinrøret (figur 1b-1c). Den urogenitaltractus vil forbli sammen en gang fjernet fra magen (figur 1d). På dette punktet, forblir UGT dekket i fettvev, som må fjernes for å få tilgang til prostata lapper (figur 1E). Alle seks fliker (ventral, fremre og dorsolateral par) kan ses rundt urinrøret ved bunnen av blæren. Ren prostatavevet kan deretter fjernes følge protokollen ovenfor (figur 1f). Disse lappene kanvære plassert i det passende medium for videre analyse.
Kastrering er fjerning av testiklene, som er de viktigste produsentene av testosteron. Testosteron er til stede i mus før kastrering skjer, noe som medførte at prostata regresses (figur 2a). Hormonell regenerering via gjeninnføring av testosteron kan følge kastrering (figur 2b). Vi utførte kastrering, etterfulgt av to sykluser med hormonelle regenerering, og testosteronnivåer ble overvåket i museserum ved hjelp av ELISA (Figur 3). Under kastrering forhold, testosteronnivå nærmest forsvinne. Alternativt kan tamoxifen (en selektiv østrogenreseptor-modulator) viser ingen signifikant forskjell i den hormonelt normal tilstand. Etter kastrering, testosteron ble re-introdusert til mus, forårsaker testosteronnivå å pigge dramatisk (figur 3). Vi deretter mikro-dissekert prostata lOBE av musene og avbildes dem som individuelle fremre fliker (figur 4a). Vi har også formalinfiksert, parafininnebygd, og seksjonert vev. Figur 4b viser hematoxylin og eosin farget anterior prostata vevet under normal, kastrert, og regenerert forhold. Kastrerte prostata fliker krympe å tilnærme en tiendedel av størrelsen på en vanlig prostata, og at hormonelle regenerering gjenoppretter prostata til sin opprinnelige størrelse.
Figur 1: Brutto Histologi av Prostate Micro-disseksjon protokollen. (A) urogenitaltractus (UGT) i sin naturlige tilstand, eksponert i murine magen. De stiplede linjer omfatter de forskjellige deler av UGT, herunder de seminale vesikler (SV), prostata lapper (anterior prostata (AP) og ventral prostata (VP) er synlig her), blære (B), og urinrøret (lokalisert bliNeath The blæren). Sædlederen (VD) er også synlig. (B) De sædlederen er fjernet. Pilen peker på hvilken region sædlederen er fjernet. (C) UGT er fjernet fra magen ved å kutte urinrøret under den ventrale prostata fliker. (D) UGT har blitt plassert i PBS og er sett under et mikroskop disseksjon. (E) fett er blitt fjernet fra den UGT, slik at synligheten av alle seks lapper av prostata. Pilene peker på de to fremre lapper, ventrale fliker og dorsolateral fliker. (F) Alle seks individuelle prostata lappene er fjernet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: TimEline for Kastrering og hormon Regeneration. (a) Testosteron er til stede på fysiologiske nivåer før kastrering, da testosteron forsvinner og regresjon av prostata begynner. (B) Kastrering fjerner testosteron, før testosteron er gjeninnført, forårsaker hormonelle regenerering av prostata. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Testosteronnivå i ulike hormonelle betingelser Testosteron ELISA henhold tamoxifen behandlet, hormonelt normal, kastrert, og hormonelt regenerert forhold. Regenerert x 2 refererer til implantasjon og fjerning av syntetisk testosteron, fulgt av implantering av en andre runde av syntetisk testosteron. Feilfelt representerer standard avvik. Dette tallet har blitt forandret fra fem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Prostata Utseende etter kastrering og regenerering betingelser (a) Brutto utseende av fremre prostata lapper henhold kastrerte, hormonelt normale, og hormonelt regenererte forhold.. Regenerert x 2 refererer til implantasjon og fjerning av syntetisk testosteron, fulgt av implantering av en andre runde av syntetisk testosteron. (B) Formalin fiksert, parafininnstøpte fremre prostata lapper seksjonert og farget med hematoxylin og eosin. Klikk her for å se et stortr versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prostata mikro-disseksjon muliggjør lobe-spesifikk eksperimentering og analyse av mus prostata (figur 1). I genmanipulerte musemodeller, kan fenotyper sees i en lapp som ikke er sett i andre. Også for histologisk analyse, sikrer denne protokollen at den maksimale mengden av ren prostatavevet kan seksjoneres og beiset, uten andre urogenitaltractus vev som finnes i seksjonen. Til slutt, for encellede eksperimenter, tillater denne protokollen for isolering av nesten ren prostata celler. Epiteliale celle berikelse kits kan ytterligere rense prostata celler fra stromale celler. Begrensninger i mikro-disseksjon inkluderer bruk av en disseksjon mikroskop, og læringskurven nødvendig å bruke fin pinsett mens du ser gjennom disseksjon mikroskop. Alternativt kan prostatavevet være seksjonert for histologi som en del av UGT, slik at mikro-disseksjon unødvendig. Imidlertid er ulempen til seksjonering hele UGT somandre vev vil være tilstede i seksjonen, slik at det ikke så ren. I tillegg, for generering av enkelt prostata cellepopulasjoner, flikene må være atskilt fra den UGT for å unngå forurensning.
Kirurgisk kastrering er en grunnleggende operasjon for mange prostata forskningslaboratorier og er vesentlig for studiet av effekten av testosteron på prostata utvikling og sykdom. Denne protokollen er rask (typisk tidspunktet for kirurgi for en erfaren bruker er ca 5 min) og fjerner nesten 100% av testosteron fra sirkulasjon (figur 3). Av notatet, testosteronnivå hos mus signifikant forskjellig, og kan variere med så mye som 30 ganger fra mus til mus 10. Kastrering fjerner denne variasjonen. Etter kastrering, kan forskerne bestemme seg for å legge til testosteron tilbake i å regenerere prostata (figur 3 - 4). Dette kan gjøres ved subkutan implantering av en kilde av testosteron, slik som en osmotisk pumpe, et testosteronpellet, eller en semi-permeabel silastiske rør inneholdende testosteron pulver 8. Avhengig av mengden av testosteron tilsatt, kan denne fremgangsmåten gi fysiologiske til superphysiological testosteronnivået i kretsløpet (figur 3). Denne protokollen kan også brukes til å studere prostata celle avstamning og stamcellebiologi 11. Et annet alternativ er kjemisk kastrering, eller androgen deprivasjon, via behandling av mus med forbindelser som inhiberer produksjonen av testosteron, som for eksempel dutasterid 12. Dette etterligner også en felles behandling av prostatakreftpasienter, som er sjelden kirurgisk kastrerte. Imidlertid gir kirurgisk kastrering en pålitelig og permanent fremgangsmåte for fjerning av praktisk talt alt testosteron. Det er viktig å tenke på at binyrene også syntetisere androgen arter, for eksempel androstendion og dehydroepiandrosteron, som kan omdannes til testosteron, men i mye mindre mengder, i forhold til testiklene13. I noen tilfeller, binyrene kan også fjernes kirurgisk, selv om denne fremgangsmåten er mer vanskelig.
Samlet er disse to protokollene er anvendbare for et utall av forskning på prostata sykdommer, så vel som hormonelle studier. Disse protokollene er en pålitelig og konsistent måte å analysere prostata biologi i hormonelt normale, kastrerte eller hormonelt regenerert forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Noen av tallene i dette manuskriptet ble sjenerøst gitt av laboratoriet av Bart O. Williams. Forfatterne er støttet av National Cancer Institute gir U54CA143803, CA163124, CA093900 OG CA143055.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Roehrborn, C. G.
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Drug discovery in prostate cancer mouse models. Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).
- El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. Unique features of the basal cells of human prostate epithelium. Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).
- Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland. Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).
- Valkenburg, K. C., et al. Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia. Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).
- Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively. Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).
- Wang, X., et al. A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer. Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).
- Pascal, L. E., et al. 5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy. J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
