Summary
Эта рукопись описывает протоколы для простаты микро-рассечение и хирургической кастрации в лабораторной мыши. Мы также изображают репрезентативные результаты, полученные этими протоколами. Наконец, мы обсудим преимущества и использование этих протоколов.
Introduction
Простаты является наиболее распространенным местом рака у мужчин в США. Почти 220 000 человек каждый год будут диагностированы с раком простаты, и приблизительно 27 000 человек будет поддаваться их болезни 1. Мужчины имеют 1 в 7 пожизненный риск диагноза рака простаты в США 1. Доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ), возрастная нераковые увеличение предстательной железы, также широко распространенное заболевание, затрагивающей более 80% мужчин старше 80 лет 2. Таким образом , простата находится в центре внимания многочисленных исследований.
Мышиные модели широко используются для изучения заболеваний предстательной железы 3. В целом, простата мыши является отличным представителем человеческой железы 4, но существуют сходства и различия между мышью и анатомии простаты и физиологии человека 5. У обоих видов, простата расположена у основания мочевого пузыря, окружающих мочеиспускательный канал. Человеческой предстательной железы является одной лобыть разделена на четыре зоны: центральная, перехода, периферической и передней фиброзно-мышечной стромы. В отличие от этого, простата мыши состоит из трех парных лопастей расположены на разных позициях вокруг мочеиспускательного канала: переднюю, вентральной и дорсолатеральной. На клеточном уровне, основное отличие состоит в том , что базальных клеток к просвету соотношение клеток у человека составляет приблизительно 1: 1, но это 1: 4 у мышей 6. Мышиный стромы также различна у мышей по отношению к человеку - у людей есть более обширные гладкие мышцы, в то время как мышечный слой гораздо тоньше, в мышиной простаты. Надлежащую идентификацию, рассечение, и обработка простаты мыши имеют важное значение для исследования мыши простаты.
Уровни гормонов существенно влияют на развитие и гомеостаз предстательной железы у людей и мышей. В то время как эстроген - видимому, играет роль в развитии простаты 7, наиболее важный гормон в предстательной железе тестостерон. Тестостерон имеет важное значение для развития железистой А.Н.d техническое обслуживание. После физических или химической кастрации, примерно 90% от полостной клеток в Apoptose взрослого простаты, и железа сжимается. Если тестостерон повторно вводят человека в условиях кастрации, простата способна самовосстанавливаться на полную мощность. Тестостерон также кажется водить рак простаты, поэтому андрогенов терапия является широко используемым терапевтической стратегией. Тем не менее, многие случаи рака простаты становятся устойчивыми к андрогенной депривации. Кроме того, люди, подвергающиеся андрогенов терапии для лечения рака предстательной железы подвергаются циклы кастрированных и регенерированных условий. У мышей, хирургическая кастрация, наряду с гормональной регенерации простаты путем восстановления тестостерона, является важным инструментом для изучения сопротивления кастрации и влияние велосипедного тестостерона на простату.
В этой статье мы будем обсуждать и демонстрировать правильные методы, с помощью которых к Locatе и микро-рассекают простаты мыши, а также хирургическим путем кастрировать мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол отвечает и соответствует руководящим принципам, установленным в Институциональная уходу и использованию животных комитета Университета Джона Хопкинса по.
1. Микро-рассечение Мышь простаты
- Эвтаназии мышь асфиксией диоксидом углерода или альтернативным способом, утвержденным в соответствии с руководствами институциональными уходу и использованию животных.
- Закрепление мышь в положении лежа на спине на рассечение борту, поставив штифт через каждую из четырех лап.
- Спрей живота с 70% этанола.
- Держите кожу нижней части живота с пинцетом и использовать ножницы, чтобы вырезать через кожу и брюшину приблизительно 1 см кпереди от отверстия пениса, стараясь не резать любые органы.
- Срежьте кожу и брюшину от нижней части живота, что на обеих сторонах живота к грудной клетке, выставляя в брюшную полость.
- Определение мочевого пузыря и мочеполового тракта, и подвергать их, осторожно двигая жир и другие органы в сторону.
- Usiнг пинцеты, сцепление семяпровода у основания вблизи мочеиспускательного канала, и оторвать ее.
- Повторите с противоположным проток семявыносящих.
- Использование щипцов, тщательно хватку мочевой пузырь и потяните его вверх, в то время как одновременно, используя ножницы, чтобы вырезать через мочеиспускательный канал ниже мочевого пузыря и брюшной предстательной железы (примерно на 1 см ниже основания мочевого пузыря).
Примечание: По мере того как мочевой пузырь вытягивается вверх, весь мочеполового тракта (содержащий мочевой пузырь, участок уретры, все долек предстательной железы и семенных пузырьках) придет с ним. Там может быть некоторое сопротивление. - Поместите урогенитального тракта (UGT) в 60-100 мм чашки Петри, содержащие приблизительно 5-10 мл фосфатно-солевой буфер (PBS).
- Выполните оставшуюся часть протокола под микроскопом рассечение. Используйте два тонких щипцов, по одному в каждой руке. Удерживая пинцет ", как карандаш" и отдохнуть предплечья на скамье так, чтобы стабилизировать их.
- Используйте тонкий пинцет, чтобы позиционировать ВСТ таким образом, что мочевой пузырьсверху, мочеиспускательный канал направлен вниз, и семенные пузырьки расположены по обе стороны от мочевого пузыря.
- Возьмитесь за уретра с одним пинцетом и осторожно отодвинуться жир с другими щипцами без отторжения любой ткани простаты. Примечание: Жир появится "блестящий" по отношению к окружающей ткани.
- После того, как жир удаляется, используйте пинцет, чтобы разорвать соединительной ткани между двумя брюшных долей простаты и разделить их.
- Для удаления одного из вентральных лопастей, используют один пинцет для захвата одного вентральной мочку вблизи вершины, а также использовать другие пинцет для захвата, что лопасть у основания как можно ближе к уретре, насколько это возможно. В то время как все еще сжимая основание лепестка, используйте другие щипцов для захвата мочеиспускательного канала. Потяните лопасть от уретры с твердым, плавным движением. Убедитесь, что никакие ткани простаты не остается прикрепленной к уретре. Поместите лопасть в соответствующую среду, в зависимости от следующего экспериментального этапа.
- Для того, чтобы исправить и парафино-встраивать Sдостаточно для гистологического анализа, поместите лопасть в 10% нейтральном буферном формалине (НСБ) 8.
- Поместите лопасть в морозную среду, такую как ОКТ, для криоконсервации и секционирования 8.
- Поместите лопасть в холодной PBS для выделения отдельных клеток для культивирования или проточной цитометрии 9.
- Повторите шаг 1.15 с другой вентральной доли.
- Для удаления одного из передних лепестков, используйте пинцет, чтобы осторожно потяните мочку подальше от семенных пузырьках, убедившись в том, чтобы не проколоть семенных пузырьках. После того, как лопасть не зависит от семенных пузырьках, удалите его таким же образом, как брюшной доли на этапе 1.15.
- Повторите шаг 1,17 с другой передней доли.
- Флип оставшиеся урогенитальный тракт над таким образом, что спинной железы видна.
- Чтобы удалить одну из дорсолатеральных лепестков, используйте пинцет, чтобы разорвать соединительной ткани между двумя дорсолатеральных долей, а также соединительной ткани между роторами и тон задней области семенных пузырьков. Удалить мочку аналогичным образом, как брюшной доли на этапе 1.15.
- Повторите шаг 1.20 с другой дорсолатеральной доли.
2. Хирургическая кастрация
Примечание: Это операция выживания, поэтому асептики, анестезии и лечения боли имеют важное значение для этического и успешного завершения этого протокола. Следуйте всем рекомендациям институциональных уходу и использованию животных. Используйте внешний источник тепла, например, циркулирующей воды одеяло, во время хирургической процедуры, чтобы предотвратить переохлаждение. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока полностью не выздоровел. Автоклав все хирургические инструменты перед использованием в хирургии.
- На чистой стерильной поверхности анестезию мыши с помощью соответствующих мер (например , 2% вдыхании изофлуран) и поместите мУз в положении лежа на спине. Примечание: Альтернативные методы анестезии, такие как кетамин, также могут быть использованы в зависимости от утвержденного протокола животного.
- Проверить рефлексы мыши, зажимая пальцами. Если мышь не реагирует, переходите к следующему шагу. Если это не реагирует, подождите 1-3 мин и снова проверьте. Бритье хирургическую область с электрической бритвы.
- Консерванта подготовить живот мыши с помощью чередующихся скрабы из 70% этанола и йода или процедур, рекомендованных институциональном ветеринарных работников или IACUC.
- Используя стерильный скальпель, сделайте 1 см вертикальный разрез через кожу в средней линии нижней части живота, примерно 1,5 см впереди полового члена.
- Сделайте небольшой надрез (<1 см) через брюшину, стараясь не резать любые органы.
- Использование стерильного пинцета, захватывают обрезанный край брюшины и поднимите ее осторожно, чтобы быть в состоянии видеть в брюшную полость под ним.
- С помощью другого стерильного пинцета, достигают в тысе брюшной полости и захват левой или правой тестикул жировой ткани, сбоку от мочевого пузыря. Вытяните жировой ткани через отверстие в брюшине и коже, пока яичко не выходит, а также. Будьте осторожны, чтобы не повредить какие-либо другие ткани или органы во время этого шага.
- Используя прижиганием ручку, прорезать жировое, который держит яичко. Медленно Прорубленный тестикулярной артерии с прижигания пера Примечание: Если тестикулярной артерии вырезают слишком быстро, может быть слишком много кровотечение и мышь, возможно, придется быть умерщвлены.
- После того, как жировой ткани и артерии вырезают, удалите семенников и жировой ткани.
- Повторите шаги 2.6-2.9 с другими семенника. Примечание: альтернативный способ удаления семенников к хирургическим путем лигирования тестикулярной артерии, с последующим разрезанием на судно с помощью ножниц.
- Ушивания брюшины закрыта с рассасывающиеся швом.
- Скоба кожа закрыта с хирургической раны клипов.
- Администрирование обезболивающее, чтобы управлять болью, и местомышь в чистой клетке на клетке теплее в течение 5-10 мин. Монитор мыши на наличие признаков боли или кровотечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Все шесть лепестков простаты были удалены из мыши через простаты микро-рассечение (рисунок 1). Полный мочеполового тракта (ВСТ) состоит из всех долей простаты, мочевого пузыря, семенные пузырьки и мочеиспускательный канал (рис 1а). Семяпровода прикрепляется к уретре, но не является необходимым для простаты микро-рассечение, и , таким образом , может быть отсоединен перед удалением ВСТ путем разрезания мочеиспускательного канала (рис 1b-1c). Мочеполового тракта будут оставаться вместе после удаления из брюшной полости (рис 1d). На данный момент, UGT остается покрытым в жировой ткани, которая должна быть удалена , чтобы получить доступ к долек простаты (рис 1E). Все шесть мочки (вентральный, передний и Дорзолатеральные пары) можно рассматривать окружающий мочеиспускательный канал у основания мочевого пузыря. Чистая ткань предстательной железы затем могут быть удалены в соответствии с протоколом выше (рисунок 1F). Эти лепестки могутбыть помещены в соответствующую среду для дальнейшего анализа.
Кастрация является удаление яичек, которые являются основными производителями тестостерона. Тестостерон присутствует в мыши до кастрации не происходит, и в этот момент простаты регрессирует (фиг.2А). Гормональная регенерация через реинтродукции тестостерона может следовать за кастрацию (рис 2b). Мы проводили кастрацию, а затем два цикла гормональной регенерации, и уровни тестостерона контролировались в сыворотке мышей с помощью ELISA (рисунок 3). В условиях кастрации уровень тестостерона практически исчезают. В качестве альтернативы, тамоксифен (селективный модулятор рецептора эстрогена) не показывает существенной разницы в гормонально нормальное состояние. После кастрации, тестостерон был вновь введен в мышь, в результате чего уровень тестостерона к спайку драматически (рисунок 3). Затем микро-рассеченные простату лOBEs мышей и их как изображается отдельных передних долей (рис 4а). Мы также фиксированные формалином, парафин, и срезы ткани. На рисунке 4б показана гематоксилином и эозином окрашенную ткань передней простаты при нормальных, кастрирован, и регенерируется условия. Кастрированные доли простаты сократится до приблизительно одной десятой размера нормальной простаты, и что гормональная регенерация восстанавливает простаты к исходному размеру.
Рисунок 1: Валовое гистологии протокола Micro-рассечение простаты. (А) урогенитального тракта (ВСТ) в своем естественном состоянии, подвергается в мышиной живота. Пунктирные линии охватывают различные части ВСТ, в том числе семенных пузырьках (SV), долей предстательной железы (передняя простаты (АП) и вентральной простаты (VP) видны здесь), мочевой пузырь (В) и мочеиспускательного канала (расположены бытьНит мочевого пузыря). Семяпровода (VD) также видна. (Б) семяпровода были удалены. Стрелка указывает на области, из которой семяпровода был удален. (С) ВСТ был удален из брюшной полости путем разрезания мочеиспускательного канала ниже вентральных долей простаты. (D) ВСТ был помещен в PBS и рассматривается под микроскопом рассечение. (Е) жир был удален из ВСТ, что позволяет видимость всех шести долей простаты. Стрелки указывают на двух передних долей, брюшных долей, и дорсолатеральных долей. (Е) Все шесть отдельных долей простаты были удалены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: ТимЭлин для кастрации и гормонального регенерации. (а) Тестостерон присутствует при физиологических уровнях до кастрации, когда тестостерон исчезает , и начинается регресс простаты. (Б) кастрации удаляет тестостерон, пока не будет повторно тестостерон, вызывая гормональную регенерацию простаты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: Уровни тестостерона в различных Гормональные Условия Тестостерон ELISA под тамоксифен лечение, гормонально нормальный, кастрирован, и гормонально регенерируют условия. Регенерированный х 2 относится к имплантации и удаления синтетического тестостерона, с последующей имплантацией второго раунда синтетического тестостерона. Усы представляют собой Стандарт отклонение. Эта цифра была изменена с 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Простата Внешний вид при кастрации и регенерации условия (а) Брутто появление долей передней простаты под кастрированных, гормонально нормальных и гормонально регенерированных условиях.. Регенерированный х 2 относится к имплантации и удаления синтетического тестостерона, с последующей имплантацией второго раунда синтетического тестостерона. (Б) фиксированных формалином, парафином передние доли простаты профилированные и окрашивали гематоксилином и эозином. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большоег версии этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Простата микро-рассечение позволяет лепестка конкретных экспериментов и анализа предстательной железы мыши (рисунок 1). В генетически сконструированных моделях мышей, фенотипы можно видеть в одной доле, не видели в других. Кроме того, для гистологического анализа, этот протокол гарантирует, что максимальное количество чистого ткани простаты может быть секционного и окрашивали, без других тканей урогенитального тракта, присутствующих в секции. Наконец, для экспериментов одноклеточных, этот протокол позволяет изоляции почти чистых клеток простаты. Эпителиальные комплекты обогащения клеток может дополнительно очистить клетки простаты из стромальных клеток. Ограничения на микро-рассечение включают использование рассечение микроскопа, а кривая обучения, необходимого для использования тонких щипцов, глядя через рассечение микроскоп. В качестве альтернативы, ткань простаты может быть секционного для гистологического исследования в рамках ВСТ, что делает микро-рассечение ненужным. Тем не менее, недостаток секционирования весь UGT является то, чтодругие ткани будут присутствовать в секции, что делает его не в чистоте. Кроме того, для формирования популяций одноклеточ- простаты, мочки должна быть отделена от UGT, чтобы избежать загрязнения.
Хирургическая кастрация является фундаментальной хирургии для многих исследовательских лабораторий простаты и имеет важное значение для изучения воздействия тестостерона на развитие простаты и болезни. Этот протокол является быстрое (типичное время операции для опытных пользователей составляет около 5 мин) и удаляет почти 100% тестостерона из оборота (рисунок 3). Следует отметить, что уровень тестостерона у мышей существенно различаются, и может изменяться на целых 30 раз от мыши к мыши 10. Кастрация удаляет этот вариант. После кастрации, исследователи могут принять решение о добавлении тестостерона обратно к регенерации простаты (Рисунки 3 - 4). Это может быть сделано путем подкожной имплантации источник тестостерона, такие как осмотический насос, тестостеронагранул или полупроницаемую силиконовая резина трубка , содержащая порошок тестостерона 8. В зависимости от количества тестостерона добавляют, эта процедура может обеспечить физиологические чтобы superphysiological уровни тестостерона в обращении (рисунок 3). Этот протокол также может быть использован для изучения клеток простаты и родословие биологии стволовых клеток 11. Другой вариант заключается в химической кастрации, или андрогенов терапии, с помощью обработки мышей с соединениями , которые ингибируют выработку тестостерона, такие как дутастерид 12. Это также имитирует обычное лечение рака предстательной железы у пациентов, которые редко хирургически кастрированных. Тем не менее, хирургическая кастрация обеспечивает надежный, постоянный метод удаления практически всего тестостерона. Важно учесть, что надпочечники также синтезировать андрогена виды, такие как андростендион и дегидроэпиандростерон, который может быть преобразован в тестостерон, хотя и в значительно меньших количествах, по отношению к яичках13. В некоторых случаях, надпочечники могут также быть удалены хирургическим путем, хотя эта процедура является более трудным.
В целом, эти два протокола, полезны для множества исследований в области заболеваний предстательной железы, а также гормональных исследований. Эти протоколы являются надежным и последовательным способом анализа биологии простаты в гормонально нормальных, кастрируют или гормонально регенерированных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Некоторые из фигур в этой рукописи были любезно предоставлены лабораторией Барта О. Уильямса. Авторы при поддержке Национального института рака предоставляет U54CA143803, CA163124, CA093900 И CA143055.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Roehrborn, C. G.
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Drug discovery in prostate cancer mouse models. Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).
- El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. Unique features of the basal cells of human prostate epithelium. Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).
- Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland. Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).
- Valkenburg, K. C., et al. Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia. Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).
- Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively. Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).
- Wang, X., et al. A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer. Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).
- Pascal, L. E., et al. 5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy. J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
