Summary
Ce manuscrit décrit les protocoles de la prostate microdissection et la castration chirurgicale chez la souris de laboratoire. Nous représentons également des résultats représentatifs produits par ces protocoles. Enfin, nous discutons des avantages et de l'utilisation de ces protocoles.
Introduction
La prostate est le site le plus commun de cancer chez les hommes aux États-Unis. Près de 220.000 hommes chaque année recevront un diagnostic de cancer de la prostate, et environ 27.000 hommes succomberont à leur maladie 1. Les hommes ont un risque de 1 sur 7 à vie d'un diagnostic de cancer de la prostate aux États - Unis 1. Hyperplasie bénigne de la prostate (HBP), un élargissement noncancerous liée à l' âge de la prostate, est également une condition répandue, affectant plus de 80% des hommes de plus de 80 2. En tant que tel, la prostate est l'objet de nombreuses recherches.
Des modèles de souris ont été largement utilisés pour étudier les maladies de la prostate 3. Dans l' ensemble, la prostate de la souris est un excellent représentant de la glande humaine 4, mais il y a des similitudes et des différences entre la souris et de l' anatomie de la prostate et la physiologie humaine 5. Chez les deux espèces, la prostate est située à la base de la vessie, qui entoure l'urètre. La glande de la prostate humaine est un loêtre divisé en quatre zones: centrale, transition, périphérique, et antérieure fibromusculaire stroma. En revanche, la prostate de la souris est composé de trois lobes couplés à des positions différentes autour de l'urètre: antérieure ventrale et dorso. Au niveau cellulaire, la principale différence est que la cellule de base au rapport cellulaire luminale humain est d' environ 1: 1, mais il est de 1: 4 à 6 souris. Le stroma de souris est également différente chez les souris par rapport à l'homme - les humains ont plus étendu des muscles lisses, tandis que la couche musculaire est beaucoup plus mince dans la prostate murin. L'identification correcte, la dissection et la manipulation de la prostate de la souris sont essentiels à la recherche de la prostate de la souris.
Les niveaux d'hormones influencent fortement le développement et l'homéostase de la glande de la prostate chez les humains et les souris. Alors que l' oestrogène semble jouer un rôle dans le développement de la prostate 7, l'hormone la plus importante de la prostate est la testostérone. La testostérone est essentielle pour glandulaire un développementd 'entretien. Soit après la castration chimique ou physique, environ 90% des cellules luminales de la prostate apoptose des adultes et la glande se rétrécit. Si la testostérone est réintroduit à un individu dans des conditions de castration, la prostate est capable de se régénérer à pleine capacité. La testostérone semble également conduire le cancer de la prostate, ce qui explique pourquoi la thérapie de privation androgénique est une stratégie thérapeutique utilisée. Cependant, de nombreux cancers de la prostate deviennent résistantes à la privation androgénique. En outre, les hommes qui suivent un traitement de privation androgénique pour le traitement du cancer de la prostate subissent des cycles de conditions castrés et régénérées. Chez la souris, la castration chirurgicale, ainsi que la régénération hormonale de la prostate en réintroduisant la testostérone, est un outil important pour étudier la résistance à la castration et les effets du cyclisme de la testostérone sur la prostate.
Dans cet article, nous allons discuter et démontrer les techniques appropriées par lequel Locate et la micro-dissection d'une prostate de souris, ainsi que pour castrer chirurgicalement d'une souris.
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Protocol
Ce protocole respecte et suit les lignes directrices établies par la Commission institutionnelle soin et l'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins.
1. Micro-disséquant un Prostate souris
- Euthanasier la souris par asphyxie au dioxyde de carbone ou une méthode approuvée de remplacement, conformément aux soins des animaux et de l'utilisation des lignes directrices institutionnelles.
- Pin de la souris dans une position couchée sur une planche à dissection en mettant une broche à travers chacune des quatre pattes.
- Vaporiser l'abdomen avec 70% d'éthanol.
- Tenir la peau du bas-ventre avec une pince, et d'utiliser des ciseaux pour couper à travers la peau et du péritoine environ 1 cm en avant de l'ouverture du pénis, attention à ne pas couper tous les organes.
- Coupez la peau et du péritoine de l'abdomen inférieur, les deux côtés de l'abdomen à la cage thoracique, l'exposition de la cavité péritonéale.
- Identifier la vessie et des voies urogénitales, et les exposer en déplaçant doucement les organes de graisse et d'autres sur le côté.
- Usiforceps ng, poignée de la déférent à la base près de l'urètre, et l'arracher.
- Répéter l'opération avec les canaux déférents opposés.
- En utilisant des pinces, soigneusement saisir la vessie et tirer vers le haut, tout en utilisant simultanément des ciseaux pour couper à travers l'urètre sous la vessie et de la prostate ventrale (environ 1 cm en dessous de la base de la vessie).
Remarque: Comme la vessie est tiré vers le haut, le (la vessie contenant, une section de l'urètre, les lobes de la prostate et les vésicules séminales) tractus urogénital viendra avec elle. Il peut y avoir une certaine résistance. - Placer l'appareil uro-génital (UGT) dans une boîte de Petri de 60 à 100 mm contenant environ 5 à 10 ml de phosphate de solution saline tamponnée (PBS).
- Effectuer la partie restante du protocole sous un microscope de dissection. Utilisez deux pinces fines, un dans chaque main. Tenir la pince »comme un crayon» et reposer les avant-bras sur la paillasse afin de les stabiliser.
- Utilisez une pince fine pour positionner l'UGT tels que la vessie estsur le dessus, l'urètre est pointé vers le bas, et les vésicules séminales sont positionnées de part et d'autre de la vessie.
- Grip l'urètre avec une pince et retirez soigneusement la graisse avec les autres pinces sans arrachement tout tissu de la prostate. Remarque: Fat apparaîtra relative "brillant" aux tissus environnants.
- Une fois que la graisse est enlevée, utiliser une pince pour déchirer le tissu conjonctif entre les deux lobes ventraux de la prostate et les séparer.
- Pour supprimer l'un des lobes ventraux, utilisez une pince pour saisir un lobe ventral unique près de la pointe, et d'utiliser les autres pinces pour saisir ce lobe à la base aussi proche de l'urètre que possible. Tout en saisissant la base du lobe, utilisez les autres pinces pour saisir l'urètre. Tirez le lobe loin de l'urètre avec une entreprise, un mouvement fluide. Assurez-vous qu'aucun tissu de la prostate reste attaché à l'urètre. Placer le lobe dans le milieu approprié, en fonction de la prochaine étape expérimentale.
- Pour fixer et paraffine intégrer les sample pour l' analyse histologique, placez le lobe dans 10% de formaline neutre tamponnée (FBN) 8.
- Placez le lobe dans le milieu de congélation, comme OPO, pour la cryoconservation et sectionnant 8.
- Placez le lobe dans du PBS froid pour l' isolement cellulaire unique pour la culture ou la cytométrie de flux 9.
- Répétez l'étape 1.15 avec l'autre lobe ventral.
- Pour supprimer l'un des lobes antérieurs, utilisez une pince pour tirer doucement le lobe loin de la vésicule séminale, en veillant à ne pas percer la vésicule séminale. Une fois que le lobe est indépendante de la vésicule séminale, l'enlever de la même façon que le lobe ventral à l'étape 1.15.
- Répétez l'étape 1.17 de l'autre lobe antérieur.
- Retournez le tractus urogénital restant sur de telle sorte que la prostate dorsale est visible.
- Pour supprimer l'un des lobes dorsolatéral, utilisez une pince à déchirer le tissu conjonctif entre les deux lobes dorsolatéral et aussi le tissu conjonctif entre les lobes et til région postérieure des vésicules séminales. Enlever le lobe d'une manière similaire à celle du lobe ventral à l'étape 1.15.
- Répétez l'étape 1.20 avec l'autre lobe dorsolatéral.
2. Castration chirurgicale
Note: Ceci est une opération de survie, de sorte que l'asepsie, l'anesthésie, la gestion et la douleur sont importants pour l'achèvement éthique et réussie de ce protocole. Suivez tous les soins des animaux et de l'utilisation des lignes directrices institutionnelles. Utiliser une source de chaleur externe, par exemple une couverture d'eau en recirculation, au cours de l'intervention chirurgicale pour éviter l'hypothermie. Ne pas laisser un animal sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait repris connaissance suffisante pour maintenir décubitus sternale. Ne retournez pas un animal qui a subi une intervention chirurgicale à la compagnie d'autres animaux jusqu'à guérison complète. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant utilisation en chirurgie.
- Sur une surface propre, stérile anesthésier la souris à l' aide de mesures appropriées (par exemple 2% d'isoflurane inhalées) et positionner le mOuse en position couchée. Remarque: Les méthodes d'anesthésie alternatives, telles que la kétamine, peuvent également être utilisés, selon le protocole approuvé pour les animaux.
- Vérifiez les réflexes de la souris en pinçant les orteils. Si la souris ne réagit pas, passez à l'étape suivante. Si elle ne réagit, attendez 1-3 min et vérifier à nouveau. Rasez la zone chirurgicale avec un rasoir électrique.
- préparer aseptique l'abdomen de la souris à l'aide des gommages alternées de 70% d'éthanol et d'iode ou de procédures recommandées par le personnel vétérinaire institutionnel ou IACUC.
- L'utilisation d'un scalpel stérile, faire une incision verticale de 1 cm à travers la peau dans la ligne médiane de l'abdomen inférieur, environ 1,5 cm en avant vers le pénis.
- Faire une petite incision (<1 cm) à travers le péritoine, attention à ne pas couper tous les organes.
- En utilisant des pinces stériles, saisir le bord de coupe du péritoine et soulevez-le délicatement de façon à être en mesure de voir la cavité péritonéale en dessous.
- En utilisant une autre pince stérile, atteindre dans ee de la cavité péritonéale et l'adhérence soit le pad testiculaire gauche ou à droite de graisse, en dehors de la vessie. Tirez le coussinet adipeux à travers l'ouverture dans le péritoine et la peau jusqu'à ce que le testis sort aussi bien. Faites attention de ne pas blesser d'autres tissus ou organes lors de cette étape.
- L'utilisation d'un stylo cautérisation, couper à travers le coussinet adipeux qui tient le testicule. Couper lentement à travers l'artère testiculaire avec le stylo cautérisation Note: Si l'artère testiculaire est coupée trop vite, il peut y avoir trop de saignement et la souris peuvent être euthanasiés.
- Une fois que le pad de graisse et de l'artère sont coupés, enlever le testicule et la graisse pad.
- Répétez les étapes 2,6-2,9 avec l'autre testicule. Remarque: Une autre méthode pour l'enlèvement des testicules consiste à ligaturer une intervention chirurgicale de l'artère testiculaire, puis en coupant le récipient avec des ciseaux.
- Suturer le péritoine fermé avec une suture absorbable.
- Staple la peau fermée avec des agrafes chirurgicales.
- Administrer un analgésique pour gérer la douleur, et le lieula souris dans une cage propre sur une cage plus chaude pendant 5-10 min. Surveiller la souris pour des signes de douleur ou de saignement.
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Representative Results
Les six lobes de la prostate ont été retirés de la prostate par l' intermédiaire d' une souris microdissection (figure 1). Tractus urogénital intégral (UGT) se compose de tous les lobes de la prostate, la vessie, les vésicules séminales et l'urètre (figure 1a). Le canal déférent se fixe à l'urètre, mais il est inutile de la prostate microdissection, et peuvent ainsi être détachées avant le retrait de l'UGT en coupant l'urètre (figure 1b-1c). Le tractus urogénital restera ensemble une fois retiré de l'abdomen (figure 1d). A ce stade, l'UGT reste couverte dans les tissus adipeux, ce qui doit être enlevée pour accéder aux lobes de la prostate (Figure 1E). Les six lobes (ventrale antérieure et paires dorsolatérales) peuvent être vus entourant l'urètre à la base de la vessie. Le tissu de la prostate pur peut ensuite être éliminé en suivant le protocole ci - dessus (figure 1f). Ces lobes peutplacer dans le milieu approprié pour analyse ultérieure.
Castration est l'ablation des testicules, qui sont les principaux producteurs de testostérone. La testostérone est présente dans la souris jusqu'à ce que la castration a lieu, après quoi la prostate régresse (figure 2a). La régénération hormonale par la réintroduction de la testostérone peut suivre la castration (Figure 2b). Nous avons effectué la castration, suivie de deux cycles de régénération hormonale, et les niveaux de testostérone ont été suivis dans le sérum de la souris par ELISA (Figure 3). Dans des conditions de castration, les niveaux de testostérone disparaissent pratiquement. En variante, le tamoxifène (un modulateur de récepteur d'oestrogène sélectif) ne montre aucune différence significative de l'état normal hormono. Après la castration, la testostérone a été réintroduit à la souris, ce qui provoque des niveaux de testostérone à pic spectaculaire (Figure 3). Nous avons ensuite micro-disséqué la prostate lOBE des souris et les imagés comme lobes antérieurs individuels (Figure 4a). Nous avons également fixés à la formaline, paraffine et sectionnés le tissu. La figure 4b montre hématoxyline et éosine tissu antérieur de la prostate teinté dans des conditions normales, castrés, et les conditions régénérés. lobes de la prostate castrés rétrécissent pour se rapprocher d'un dixième de la taille d'une prostate normale, et que la régénération hormonale restaure la prostate à sa taille d'origine.
Figure 1: histologie brut du protocole Micro-dissection de la prostate. (A) Le tractus urogénital (UGT) dans son état naturel, exposée dans l'abdomen murin. Les lignes en pointillés regroupent les diverses parties de l'UGT, y compris les vésicules séminales (SV), les lobes de la prostate (de la prostate antérieure (AP) et la prostate ventrale (VP) sont visibles ici), de la vessie (B), et de l'urètre (qui se trouve êtreneath la vessie). Le canal déférent (VD) est également visible. (B) Les canaux déférents ont été enlevés. La flèche pointe dans la région à partir de laquelle le canal déférent a été supprimée. (C) L'UGT a été retiré de l'abdomen en coupant l'urètre au- dessous des lobes de la prostate ventrale. (D) L'UGT a été placé dans du PBS et est vu sous un microscope de dissection. (E) de matières grasses a été retiré de l'UGT, permettant la visibilité de l' ensemble des six lobes de la prostate. Les flèches indiquent les deux lobes antérieurs, les lobes ventraux et les lobes dorsolatérales. (F) Tous les six lobes de la prostate individuels ont été supprimés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Timeline pour Castration et Hormonal Regeneration. (a) La testostérone est présent à des concentrations physiologiques jusqu'à la castration, lorsque la testostérone disparaît et la régression de la prostate commence. (B) Castration supprime la testostérone, jusqu'à ce que la testostérone est réintroduite, provoquant la régénération hormonale de la prostate. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Niveaux de testostérone dans diverses conditions hormonales Testostérone ELISA sous tamoxifène traité, hormonal normal, castré et conditions hormonalement régénérée. x 2 régénérés se rapporte à l'implantation et le retrait de la testostérone synthétique, suivie par l'implantation d'un second cycle de testostérone synthétique. Les barres d'erreur représentent stanécart type. Ce chiffre a été modifié depuis 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Prostate Apparence sous Castration et Régénération Conditions (a) l' aspect brut des lobes antérieur de la prostate dans des conditions castrés, hormonalement normales et hormonalement régénérées.. x 2 régénérés se rapporte à l'implantation et le retrait de la testostérone synthétique, suivie par l'implantation d'un second cycle de testostérone synthétique. (B) fixés au formol, antérieures lobes de la prostate en paraffine sectionnées et colorées à l' hématoxyline et de l' éosine. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un grandversion r de ce chiffre.
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Discussion
Prostate microdissection permet une expérimentation précise du lobe et l' analyse de la prostate de la souris (figure 1). Dans les modèles de souris génétiquement modifiées, les phénotypes peuvent être vus dans un lobe qu'on ne voit pas dans d'autres. En outre, pour l'analyse histologique, ce protocole assure que la quantité maximale de tissus de la prostate pur peut être sectionné et coloré, sans autres tissus du tractus uro-génital présentes dans la section. Enfin, pour des expériences unicellulaires, ce protocole permet l'isolement des cellules de la prostate presque purs. kits d'enrichissement de cellules épithéliales peut en outre purifier les cellules de la prostate à partir de cellules stromales. Limitations à micro-dissection comprennent l'utilisation d'un microscope de dissection, et la courbe d'apprentissage nécessaire d'utiliser une pince fine tout en regardant à travers le microscope de dissection. En variante, le tissu de la prostate peut être sectionnée pour l'histologie dans le cadre de l'UGT, ce qui rend inutile microdissection. Cependant, l'inconvénient de sectionner l'ensemble UGT est qued'autres tissus seront présents dans la section, ce qui en fait pas aussi propre. En outre, pour générer des populations de cellules de la prostate unique, les lobes doivent être séparés de l'UGT pour éviter toute contamination.
La castration chirurgicale est une chirurgie fondamentale pour de nombreux laboratoires de recherche de la prostate et est essentielle pour l'étude des effets de la testostérone sur le développement de la prostate et de la maladie. Ce protocole est rapide (temps typique de l' intervention chirurgicale pour un utilisateur expérimenté est d' environ 5 min) et supprime presque 100% de testosterone de la circulation (figure 3). À noter que les niveaux de testostérone chez les souris diffèrent considérablement, et peuvent varier par autant que 30 fois de souris à 10. Castration supprime cette variation. Après la castration, les chercheurs peuvent décider d'ajouter la testostérone avant de régénérer la prostate (figures 3 - 4). Ceci peut être effectué par voie sous-cutanée à implanter une source de testostérone, tel qu'une pompe osmotique, testostéroneune pastille, ou d' un tube de silastique semi-perméable contenant de la poudre de testostérone 8. En fonction de la quantité de testostérone ajoutée, cette procédure peut fournir physiologique superphysiologiques taux de testostérone dans la circulation (figure 3). Ce protocole peut également être utilisé pour étudier la prostate lignée cellulaire et biologie des cellules souches 11. Une autre option est la castration chimique, ou la thérapie de privation androgénique, via le traitement des souris avec des composés qui inhibent la production de testostérone, comme le dutastéride 12. Cela imite également un traitement commun des patients atteints de cancer de la prostate, qui sont rarement castrés chirurgicalement. Cependant, la castration chirurgicale fournit une méthode fiable, permanente pour l'élimination de la quasi-totalité de la testostérone. Il est important de considérer que les glandes surrénales synthétisent également des espèces androgenes, tels que l'androstènedione et déhydroépiandrostérone, qui peut être converti en testostérone, mais en quantités beaucoup plus faibles, par rapport aux testicules13. Dans certains cas, les glandes surrénales peuvent également être enlevées par voie chirurgicale, mais cette procédure est plus difficile.
Dans l'ensemble, ces deux protocoles sont utiles pour une myriade de recherche sur les maladies de la prostate, ainsi que des études hormonales. Ces protocoles sont un moyen fiable et cohérente pour analyser la prostate biologie dans des conditions normales hormonalement, castrés, ou hormonale régénérées.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Certains des chiffres dans ce manuscrit ont été généreusement fournies par le laboratoire de Bart O. Williams. Les auteurs sont pris en charge par l'Institut national du cancer accorde U54CA143803, CA163124, CA093900, CA143055 ET.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
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