Summary
Dette håndskrift beskriver protokoller for prostata mikro-dissektion og kirurgisk kastration i laboratoriet mus. Vi skildrer også repræsentative resultater produceret af disse protokoller. Endelig diskuterer vi fordele og udnyttelsen af disse protokoller.
Introduction
Prostata er den mest almindelige sted for cancer i mænd i USA. Næsten 220.000 mænd hvert år vil blive diagnosticeret med prostatakræft, og ca. 27.000 mænd vil bukke under for deres sygdom en. Mænd har en 1 i 7 levetid risiko for prostatakræft diagnose i USA en. Godartet prostatahyperplasi (BPH), en aldersrelateret noncancerous forstørrelse af prostata, er også en udbredt tilstand, som påvirker mere end 80% af mænd over 80 2. Som sådan prostata er fokus for betydelig forskning.
Musemodeller har vidt blevet anvendt til at undersøge sygdomme i prostata 3. Samlet set musen prostata er en fremragende repræsentant for den humane kirtel 4, men der er ligheder og forskelle mellem mus og menneske prostata anatomi og fysiologi 5. Hos begge arter er prostata placeret i bunden af blæren, der omgiver urinrøret. Den humane prostatakirtel er en enkelt lovære, opdelt i fire zoner: central, overgang, perifer, og forreste fibromuskulær stroma. I modsætning hertil muse prostata består af tre parrede lapper på forskellige steder omkring urinrøret: anterior, ventrale, og dorsolaterale. På et cellulært niveau, den vigtigste forskel er, at den basale celle til luminal celle-forhold i human er ca. 1: 1, men det er 1: 4 i mus 6. Det murine stroma er også anderledes i mus i forhold til mennesker - mennesker har mere omfattende glat muskel, mens den muskel lag er meget tyndere i murine prostata. Den korrekte identifikation, dissektion, og håndtering af musen prostata er afgørende for mus prostata forskning.
Hormonniveau drastisk påvirke udviklingen og homeostase af prostata hos både mennesker og mus. Mens østrogen synes at spille en rolle i prostata udvikling 7, det vigtigste hormon i prostata er testosteron. Testosteron er afgørende for glandular udvikling end vedligeholdelse. Efter enten fysisk eller kemisk kastration, ca. 90% af de luminale celler i den voksne prostata apoptose, og kirtlen skrumper. Hvis testosteron genindføres til en person under kastration betingelser, prostata er i stand til at regenerere sig selv til fuld kapacitet. Testosteron synes også at drive prostatacancer, hvilket er grunden til androgen deprivation terapi er en almindeligt anvendt terapeutisk strategi. Men mange prostatakræft bliver resistente over for androgen deprivation. Derudover mænd undergår androgen deprivation terapi til behandling af prostatacancer underkastes cyklusser af kastrerede og regenererede betingelser. Hos mus, kirurgisk kastration, sammen med hormonal regenerering af prostata ved at genindføre testosteron, er et vigtigt redskab til at studere kastration modstand og virkningerne af testosteron cykle på prostata.
I denne artikel, vil vi diskutere og demonstrere de rigtige teknikker ved at søge efter disse datae og mikro-dissekere en mus prostata, såvel som til kirurgisk kastrere en mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol opfylder og følger de retningslinjer fastsat af Johns Hopkins University Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Micro-dissekere en mus Prostata
- Aflive musen ved kuldioxid kvælning eller et andet godkendt metode i overensstemmelse med de institutionelle dyr pleje og brug retningslinjer.
- Pin musen i liggende position til en dissektion bord ved at sætte en stift gennem hver af de fire poter.
- Spray maven med 70% ethanol.
- Hold huden på underlivet med pincet, og bruge en saks til at skære gennem huden og peritoneum ca. 1 cm anterior til åbningen af penis, passe på ikke at skære nogen organer.
- Skåret væk huden og peritoneum fra underlivet, op begge sider af maven til brystkassen, udsætter det peritoneale hulrum.
- Identificer blæren og urogenitale kanal, og udsætte dem ved forsigtigt at bevæge fedt og andre organer til siden.
- Using pincet, greb sædlederen på basen nær urinrøret, og rive det væk.
- Gentag med det modsatte sædlederen.
- Med pincet, forsigtigt greb blæren og træk den op, samtidig med en saks for at skære gennem urinrøret under blæren og ventral prostata (ca. 1 cm under bunden af blæren).
Bemærk: Som blæren trækkes op, vil hele urogenitale kanal (indeholdende blære, en sektion af urinrøret, alle prostata lapper, og sædblærerne) kommer med den. Der kan være en vis modstand. - Placer urogenitalkanalen (UGT) i en 60-100 mm petriskål indeholdende ca. 5-10 ml phosphatbufret saltvand (PBS).
- Udfør den resterende del af protokollen under en dissektion mikroskop. Brug to fine tænger, en i hver hånd. Hold pincet "som en blyant" og hvile underarmene på bænken toppen for at stabilisere dem.
- Brug fine tænger til at placere UGT, således at blæren erpå toppen, er urinrøret pegede ned, og sædblærerne er på hver sin side af blæren.
- Grip urinrøret med en pincet og forsigtigt trække væk fedt med de andre pincet uden at rive væk enhver prostata væv. Bemærk: Fat vises "shiny" i forhold til det omgivende væv.
- Når fedtet er fjernet med pincet for rive bindevævet mellem de to ventrale kamre af prostata og adskille dem.
- At fjerne en af de ventrale lapper, anvende en pincet til at gribe en enkelt ventrallap nær spidsen, og bruge de andre pincet til greb, lap på basen så tæt på urinrøret som muligt. Mens stadig gribende bunden af lap, bruge de andre pincet til at gribe urinrøret. Træk lobe væk fra urinrøret med en fast, jævn bevægelse. Sørg ingen prostata væv forbliver fastgjort til urinrøret. Placer lap i det passende medium afhængig af den næste eksperimentelle trin.
- For at rette og paraffin-indlejre srigelig til histologisk analyse, placere lap i 10% neutral-bufferet formalin (NBF) 8.
- Placer lap i frysning medium, såsom OLT for nedfrysning og sektionering 8.
- Placer lap i koldt PBS for enkelt celle isolation for kultur eller flowcytometri 9.
- Gentag trin 1.15 med den anden ventrallap.
- For at fjerne en af de forreste lapper, bruge pincet til forsigtigt at trække lap væk fra sædblæren, og sørg for ikke at punktere sædblæren. Når lappen er uafhængig af sædblæren, fjerne det på samme måde som den ventrallap i trin 1.15.
- Gentag trin 1.17 med den anden forreste lap.
- Flip den resterende urogenitale kanal over så at den dorsale prostata er synlig.
- At fjerne en af de dorsolaterale lapper pincet til at rive bindevævet mellem de to dorsolaterale lapper og også bindevæv mellem lapperne og than posteriore område af sædblærerne. Fjern lap på en lignende måde som den ventrallap i trin 1.15.
- Gentag trin 1.20 med den anden dorsolaterale lap.
2. kirurgisk kastration
Bemærk: Dette er en overlevelse kirurgi, så aseptik, anæstesi, og smertebehandling er vigtige for den etiske og vellykket gennemførelse af denne protokol. Følg alle institutionelle dyr pleje og brug retningslinjer. Brug en ekstern varmekilde, såsom en recirkulerende vand tæppe, under den kirurgiske procedure for at forhindre hypotermi. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået kirurgi til selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. Autoklavér alle kirurgiske instrumenter før anvendelse i kirurgi.
- På en ren, steril overflade bedøver musen ved hjælp af passende foranstaltninger (fx 2% inhaleret isofluran), og placer mOuse i en liggende stilling. Bemærk: Alternative anæstesi metoder, såsom ketamin, kan også anvendes, afhængigt af den godkendte dyreprotokollen.
- Kontrollér musens reflekser ved at klemme tæerne. Hvis musen ikke reagerer, skal du fortsætte til næste trin. Hvis det reagerer, vent 1-3 minutter og tjek igen. Barbere det kirurgiske område med en elektrisk barbermaskine.
- Aseptisk forberede maven på mus ved hjælp vekslende scrubs af 70% ethanol og jod eller procedurer, der er anbefalet af den institutionelle veterinære personale eller IACUC.
- Anvendelse af en steril skalpel en 1 cm vertikal incision gennem huden i midterlinjen af underlivet, ca. 1,5 cm anterior til penis.
- Lav et lille snit (<1 cm) gennem bughinden, passe på ikke at skære nogen organer.
- Brug steril pincet, greb den afskårne kant i bughinden og løft den forsigtigt op, så de er i stand til at se bughulen under.
- Brug en anden steril pincet, nå ind the bughulen og greb enten venstre eller højre testikel fedt pad, lateral til blæren. Træk fedtpuden gennem åbningen i peritoneum og huden, indtil testiklerne kommer ud samt. Pas på ikke at skade andre væv eller organer i dette trin.
- Ved hjælp af en cautery pen, skære gennem fedtpuden, der holder testis. Skær langsomt gennem testikel arterie med kautering pen Bemærk: Hvis testikel arterie er skåret for hurtigt, kan der være for meget blødning og musen måske skal aflives.
- Når fedtpuden og arterie er skåret, fjernes testiklerne og fedtpuden.
- Gentag trin 2,6-2,9 med den anden testis. Bemærk: En alternativ fremgangsmåde til fjernelse af testiklerne er at kirurgisk ligering testikel arterie, efterfulgt af afskæring fartøjet med en saks.
- Sutur bughinden lukket med absorberbar sutur.
- Staple huden lukket med kirurgiske sårklemmer.
- Administrere en analgetisk at styre smerte og stedmusen i en ren bur på et bur varmere i 5-10 min. Overvåg musen for tegn på smerte eller blødning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alle seks prostata lapper blev fjernet fra en mus via prostata mikro-dissektion (figur 1). Den komplette urogenitalkanalen (UGT) er sammensat af alle prostata lapper, blære, seminalis vesikler og urinrøret (figur 1A). Sædlederen tillægger urinrøret, men er unødvendigt for prostata mikro-dissektion, og kan således frigøres før fjernelse af UGT ved at skære urinrøret (figur 1b-1c). Urogenitalkanalen vil forblive sammen når fjernet fra maven (fig 1d). På dette tidspunkt forbliver UGT dækket i fedtvævet, som skal fjernes for at få adgang til prostata lapper (figur 1e). Alle seks flige (ventrale, anterior, og dorsolaterale par) kan ses omkring urinrøret ved bunden af blæren. Pure prostatavæv kan derefter fjernes følge protokollen ovenfor (Figur 1f). Disse lapper kanplaceres i det passende medium til yderligere analyse.
Kastration er fjernelse af testiklerne, som er de primære producenter af testosteron. Testosteron er til stede i musen, indtil kastration forekommer, ved hvilket punkt prostata regredere (figur 2a). Hormonelle regenerering via genindførelse af testosteron kan følge kastration (figur 2b). Vi udførte kastration, efterfulgt af to cyklusser af hormonal regenerering, og testosteron-niveauer blev overvåget i museserum ved ELISA (figur 3). Under kastration betingelser, testosteron niveauer stort set forsvinder. Alternativt tamoxifen (en selektiv østrogen receptor modulator) viser ingen signifikant forskel i forhold til den hormonalt normale tilstand. Efter kastration, testosteron blev genintroduceret til musen, forårsager testosteron niveauer til spike dramatisk (Figur 3). Vi derefter mikro-dissekeret prostata lObes fra musene og afbildes dem som individuelle forreste lapper (figur 4A). Vi har også formalin-fikseret, paraffin-indlejret, og sektioneret vævet. Figur 4b viser hæmatoxylin og eosin farvede forreste prostata væv under normal, kastreret, og regenereres betingelser. Kastrerede prostata lapper skrumpe at tilnærme en tiendedel af størrelsen af en normal prostata, og at hormonal regenerering genskaber prostata til sin oprindelige størrelse.
Figur 1: Gross Histologi af prostata Micro-dissektion protokol. (A) Den urogenitale kanal (UGT) i sin naturlige tilstand, blotlagt i murine maven. De stiplede linier omfatte de forskellige dele af UGT, herunder sædblærerne (SV), prostata lapper (anterior prostata (AP) og ventrale prostata (VP) er synlige her), blære (B), og urinrøret (placeret væreneath blæren). Sædlederen (Vd) er også synlig. (B) sædlederen er fjernet. Pilen peger på den region, hvorfra sædlederen er fjernet. (C) UGT er fjernet fra maven ved at skære urinrøret under de ventrale prostata lapper. (D) UGT er blevet placeret i PBS og ses under en dissektion mikroskop. (E) fedtet er fjernet fra UGT, der giver mulighed for synligheden af alle seks kamre af prostata. Pilene peger på de to forreste lapper, de ventrale lapper og dorsolaterale lapper. (F) Alle seks individuelle prostata lapper er blevet fjernet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: TimEline for kastrering og Hormonel Regeneration. (a) Testosteron er til stede ved fysiologiske niveauer indtil kastration, når testosteron forsvinder, og regression af prostata begynder. (B) Kastration fjerner testosteron, indtil testosteron genindføres, forårsager hormonal regenerering af prostata. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Testosteronniveauer i Forskellige Hormonelle Betingelser Testosteron ELISA under tamoxifen behandlet, hormonelt normal, kastreret, og hormonelt regenereret betingelser. Regenereret x 2 henviser til implantation og fjernelse af syntetisk testosteron, efterfulgt af implantation af en anden runde af syntetisk testosteron. Fejl søjler repræsenterer standard afvigelse. Dette tal er blevet ændret fra 5. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Prostata Udseende under Kastration og Regeneration betingelser (a) Gross udseende forreste prostata lapper under kastrerede, hormonalt normale, og hormonelt regenererede betingelser.. Regenereret x 2 henviser til implantation og fjernelse af syntetisk testosteron, efterfulgt af implantation af en anden runde af syntetisk testosteron. (B) Formalin-fikseret, paraffinindlejrede forreste prostata lapper sektioneret og farvet med hæmatoxylin og eosin. Klik her for at se et stortr version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prostata mikro-dissektion tillader lobe-specifikke eksperimenter og analyse af muse prostata (figur 1). I gensplejsede musemodeller, kan fænotyper ses i en lap, som ikke ses i andre. Også for histologisk analyse, denne protokol sikrer, at den maksimale mængde af ren prostata væv kan sektioneret og farves, uden andre urogenital tarmkanalen væv til stede i afsnittet. Endelig for encellede eksperimenter, denne protokol giver mulighed for isolation af næsten rene prostata celler. Epitelcelle berigelse kits kan yderligere rensning prostataceller fra stromaceller. Begrænsninger i mikro-dissektion indbefatter anvendelsen af en dissektion mikroskop, og indlæringskurven nødvendigt at anvende fine tænger mens du ser gennem dissektion mikroskop. Alternativt kan prostatavæv skal skæres til histologi som en del af UGT, hvilket gør mikro-dissektion unødvendig. Den ulempe at sektionering hele UGT er imidlertid, atandre væv vil være til stede i afsnittet, gør det ikke så rene. Hertil kommer, for at generere enkelt prostata cellepopulationer, lapperne skal separeres fra UGT at undgå forurening.
Kirurgisk kastration er en grundlæggende operation for mange prostata forskningslaboratorier og er afgørende for studiet af virkningerne af testosteron på prostata udvikling og sygdom. Denne protokol er hurtig (typisk tidspunktet for kirurgi for en erfaren bruger er omkring 5 min) og fjerner næsten 100% af testosteron fra omløb (figur 3). Notatet testosteronniveau i mus adskiller sig væsentligt, og kan variere med så meget som 30 gange fra mus til mus 10. Kastration fjerner denne variation. Efter kastration, kan forskerne vælge at tilføje testosteron igen at regenerere prostata (figur 3 - 4). Dette kan gøres ved subkutant implanteres en kilde af testosteron, såsom en osmotisk pumpe, en testosteronpellet, eller en semipermeabel silastic-rør indeholdende testosteron pulver 8. Afhængigt af mængden af testosteron tilsat, kan denne procedure give fysiologiske at superphysiological testosteronniveauer i kredsløbet (figur 3). Denne protokol kan også anvendes til at studere prostata celle afstamning og stamcellebiologi 11. En anden mulighed er kemisk kastration, eller androgen deprivation terapi, via behandling af mus med forbindelser, som inhiberer produktionen af testosteron, såsom dutasterid 12. Dette efterligner også en fælles behandling af prostatacancer patienter, som er sjældent kirurgisk kastrerede. Imidlertid kirurgisk kastration tilvejebringer en pålidelig, permanent fremgangsmåde til fjernelse af næsten hele testosteron. Det er vigtigt at overveje, at binyrerne også syntetisere androgen arter, såsom androstendion og dehydroepiandrosteron, som kan omdannes til testosteron, men i meget mindre mængder, i forhold til testiklerne13. I nogle tilfælde, binyrerne kan også fjernes kirurgisk, selvom denne fremgangsmåde er vanskeligere.
Samlet set har disse to protokoller er anvendelige til et utal af forskning i prostata sygdomme, såvel som hormonale undersøgelser. Disse protokoller er en pålidelig og konsekvent måde at analysere prostata biologi i hormonelt normale, kastreret eller hormonalt regenererede betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Nogle af tallene i dette manuskript var generøst leveres af laboratoriet Bart O. Williams. Forfatterne er understøttet af National Cancer Institute giver U54CA143803, CA163124, CA093900 OG CA143055.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools | Roboz | Various | |
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | |
| OCT medium | VWR | 25608-930 | Must be placed on dry ice to freeze, and stored at -80 °C |
| PBS | Life Technologies | 10010 | |
| Isoflurane | Johns Hopkins | Also available from vendors online | |
| Cautery Pen | Medline | ESCT002 | |
| Silk suture | AD Surgical | M-S330R19 | |
| Surgical Wound Clips | Roboz | RS-9265 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- Roehrborn, C. G.
- Valkenburg, K. C., Williams, B. O.
- Shappell, S. B., et al. Prostate pathology of genetically engineered mice: definitions and classification. The consensus report from the Bar Harbor meeting of the Mouse Models of Human Cancer Consortium Prostate Pathology Committee. Cancer Res. 64 (6), 2270-2305 (2004).
- Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Drug discovery in prostate cancer mouse models. Expert Opin Drug Discov. , 1-14 (2015).
- El-Alfy, M., Pelletier, G., Hermo, L. S., Labrie, F. Unique features of the basal cells of human prostate epithelium. Microsc Res Tech. 51 (5), 436-446 (2000).
- Prins, G. S., Huang, L., Birch, L., Pu, Y. The role of estrogens in normal and abnormal development of the prostate gland. Ann N Y Acad Sci. 1089, 1-13 (2006).
- Valkenburg, K. C., et al. Activation of Wnt/beta-catenin signaling in a subpopulation of murine prostate luminal epithelial cells induces high grade prostate intraepithelial neoplasia. Prostate. 74 (15), 1506-1520 (2014).
- Lukacs, R. U., Goldstein, A. S., Lawson, D. A., Cheng, D., Witte, O. N. Isolation, cultivation and characterization of adult murine prostate stem cells. Nat Protoc. 5 (4), 702-713 (2010).
- Michiel Sedelaar, J. P., Dalrymple, S. S., Isaacs, J. T. Of mice and men--warning: intact versus castrated adult male mice as xenograft hosts are equivalent to hypogonadal versus abiraterone treated aging human males, respectively. Prostate. 73 (12), 1316-1325 (2013).
- Wang, X., et al. A luminal epithelial stem cell that is a cell of origin for prostate cancer. Nature. 461 (7263), 495-500 (2009).
- Pascal, L. E., et al. 5alpha-Reductase inhibition coupled with short off cycles increases survival in the LNCaP xenograft prostate tumor model on intermittent androgen deprivation therapy. J Urol. 193 (4), 1388-1393 (2015).
- Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
