Abstract
Durante el desarrollo de nuevos agentes vasoactivos, control de la presión sanguínea arterial es crucial para evaluar la eficacia de los nuevos fármacos propuestos. De hecho, la investigación se centra en el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas potenciales utilizando ratones alterados genéticamente requiere una evaluación fiable a largo plazo de la variación de la presión arterial sistémica. Actualmente, el estándar de oro para la obtención de mediciones a largo plazo de la presión arterial en ratones ambulatorios utiliza implantables de radio-transmisores, que requieren canulación de la arteria. Esta técnica elimina la necesidad de inmovilización, de restricción, o anestesiar los animales que introducen el estrés y artefactos durante el muestreo de datos. Sin embargo, el seguimiento de la presión arterial en ratones a través de cateterismo puede ser bastante difícil debido al pequeño tamaño de las arterias. Aquí presentamos una guía paso a paso para ilustrar los pasajes claves cruciales para una exitosa implantación subcutánea de radio-transmisores y c arteria carótidaanulación en ratones. También se incluyen ejemplos de la actividad de la presión arterial a largo plazo tomadas de ratones con libertad de movimientos después de un período de recuperación post-cirugía. Después de este procedimiento permitirá que los registros de presión arterial directa fiables de varios animales al mismo tiempo.
Introduction
La hipertensión es uno de los principales factores de riesgo para enfermedades cardiovasculares, podría decirse que se trata de un importante problema de salud pública tanto en los países desarrollados y en desarrollo 1. Varios modelos animales de hipertensión experimental se han desarrollado para imitar las respuestas hipertensivas como los observados en los seres humanos 2. Entre otros, el ratón ambulatoria representa un modelo excelente para estudiar la génesis y la progresión de la hipertensión que permite en el análisis in vivo de las consecuencias de la exposición crónica a la hipertensión.
La presión sanguínea (BP) de vigilancia en ratones ha ayudado a los investigadores a desentrañar varios mecanismos involucrados en la fisiología y la patofisiología de enfermedades tales como la hipertensión y la insuficiencia cardíaca 3, 4. De hecho, la manipulación del genoma de ratón permitió la generación de modelos de genes transgénicos o de orientación adecuado para el estudio de la hipertensión 5, 6. Sin embargo, incluso una manipulación suavede los ratones conscientes induce emociones que potencialmente pueden introducir artefactos durante la adquisición de datos, mientras que el uso de la sedación o tranquilizantes afectan profundamente la presión arterial 7. Estos aspectos son particularmente importantes y deben tenerse en cuenta a la hora de intentar monitorización de la PA a largo plazo.
Hay varias maneras de grabar BP en ratones, y una comparación entre las técnicas más comunes disponibles en la actualidad se ha discutido en otra parte 8, 9. Sin embargo, las recomendaciones de la AHA para la medición BP concluyeron que la medición intra-arterial de la presión arterial se prefiere generalmente debido a su capacidad para medir directamente BP durante un período prolongado de tiempo 10. Radiotelemetría junto con la medición directa de la presión arterial es el método del estado de la técnica para el control de las funciones fisiológicas del despierta y se mueve libremente animales de laboratorio y reducir al mínimo el estrés y artefactos asociados con el medio ambiente-9, 11.Radiotelemetría ofrece la posibilidad de recopilar automáticamente la presión arterial, la frecuencia cardíaca, la temperatura corporal y la actividad de los animales de varios animales conscientes.
Aunque esta metodología se está volviendo muy popular en muchos laboratorios, la implantación de radio-telemetría en ratones puede ser técnicamente difícil. Aquí se muestra un protocolo de paso a paso que ilustra cómo implantar un transductor de presión en ratones. La técnica implica la inserción subcutánea de la sonda en el cuerpo del ratón, el canal del catéter hasta el cuello y hacia adelante cerca del arco aórtico a través de la arteria carótida izquierda. datos remotamente capturadas se muestran en vivo en el monitor de la computadora. Los datos también se almacenan para su análisis "fuera de línea".
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Protocol
Ética declaración: Todos los animales procedimientos mencionados en este video-artículo fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Tennessee Centro de Ciencias de la Salud.
Nota: Utilice instrumentos de microcirugía estériles durante todo el procedimiento quirúrgico. Los instrumentos quirúrgicos pueden esterilizarse utilizando un esterilizador de infrarrojos a una temperatura de esterilización óptima de 1500 ° F (815,6 ° C). Telémetros pueden ser reutilizados, sin embargo, antes de insertarla en el animal asegurarse para esterilizar todo el transmisor de acuerdo con las instrucciones del fabricante y que la punta del catéter se ha rellenado con un gel especial proporcionado por el fabricante.
1. Los animales experimentales
- Obtener una aprobación del IACUC para todos los experimentos que se realizarán. La consulta con IACUC institucional es muy recomendable sobre los requisitos para el uso de analgésicos postoperatorios después de este procedimiento.
- Mantener a los animales en csalas de lima-controlada que tienen una temperatura ambiente de 21 ° C, 60% de humedad relativa y un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas con acceso libre a comida y agua.
Nota: Debido a que el cuerpo del ratón tiene que acomodar la sonda de telemetría (aproximativamente 1 cm de diámetro x 2 cm de longitud), es preferible utilizar ratones que pesan 20 g o más.
2. Anestesia y preparación Operativo
- Pesar el ratón usando una balanza de precisión y registrar su peso. Asegúrese de manejar el animal suave y silenciosa.
- Colocar el animal en la cámara de inducción y cerrarla. Ajuste del caudal de oxígeno a 0,5 L / min y la concentración de isoflurano al 4-5%.
- Cuando el ratón se pierde la conciencia, colocarlo en una placa de calentamiento corporal se mantuvo a 36 - 37 ° C. Mantener la anestesia a través del cono de nariz con el conjunto de isoflurano al 2% (mantener el caudal a 0,5 l / min).
- Preparar las regiones de operación mediante la eliminación del pelo de la parte posterior del cuello y tél cara ventral del cuello mediante la aplicación de crema de depilación.
- Se trata el sitio de la incisión con 3 aplicaciones de lavado quirúrgico (solución de betadine) alternando con alcohol isopropílico al 70%.
3. Cirugía
- Coloque el ratón en una posición supina. Compruebe si hay reflejos pellizcando el pie, y ajustar la anestesia hasta que no haya respuesta. Realiza una de aproximadamente 1 cm de la línea media incisión por debajo del cuello del ratón con un bisturí. En el lado izquierdo de la corte de crear un espacio subcutáneo separando cuidadosamente la piel del tejido conectivo subyacente.
- Da la vuelta al ratón, y el uso de un bisturí para hacer una incisión en la piel de aproximadamente 1,5 cm de la izquierda de la cara dorsal detrás de la escápula. Crear un bolsillo subcutáneo a lo largo del flanco del animal lo suficientemente grande para acomodar el dispositivo. Inserte el transmisor en el bolsillo.
- Inserte una pequeña pinza pinza hemostática en la incisión hacia atrás y maniobrarlo subcutáneamente hacia la parte anteriorabertura del cuello. El uso de la pinza-pinza hemostática insertado, agarre suavemente un tubo de polietileno no tóxico (4 cm de largo x 1 mm de diámetro).
- Tire de la pinza a través del túnel a cabo la incisión lateral en la parte posterior hasta que el tubo sobresale de ambos incisión abdominal y dorsal, suelte el tubo de la pinza hemostática. Desde la parte posterior, inserte el sensor de catéter en el tubo de túnel de la punta del catéter de detección de presión a través del cuello. Desde la parte anterior del cuello, tirar y sacar el tubo de polietileno y cerrar la incisión dorsal mediante clips metálicos.
- separar cuidadosamente las glándulas mandibulares utilizando aplicadores con punta de algodón estéril y retraer la glándula mandibular izquierdo usando un gancho de estancia elástica. El uso de pinzas curvas de punta fina, localizar la arteria carótida a lo largo del lado izquierdo de la tráquea. Mantener el sitio quirúrgico estéril por colocar y asegurar un campo estéril.
- Con cuidado, aislar el vaso del tejido circundante y suavemente separar elnervio vago (de color blanquecino) que es a lo largo de la arteria carótida lejos de la arteria. Tenga cuidado de no cortar o dañar el nervio o la arteria.
- Pasar tres piezas de no absorbible 7-0 sutura debajo de la sección de la arteria carótida aislado. Atar la sutura craneal para cerrar el flujo de sangre. Tirar de la sutura que está más cerca del esternón para ocluir temporalmente el flujo de sangre de la aorta.
- Hacer un nudo flojo usando la sutura media. Esto se utiliza para asegurar el catéter en el vaso. Cortar una pequeña incisión en la arteria entre el cráneo y las suturas del esternón utilizando micro-tijeras.
- Agarrar el catéter con pinzas especiales de canulación buque, teniendo cuidado de no apretar el catéter para evitar la pérdida de gel de la sonda. Suavemente, agarra la arteria con una punta fina curvados fórceps pinzas, recuperar el catéter, y la inserta en el recipiente a través de la pequeña incisión.
- Apretar el nodo de sutura media alrededor de la arteria y avanzar suavemente el gatoheter. liberar suavemente el hilo de sutura que está próximo al esternón y continuar avanzando el catéter hacia la aorta transversal.
- Observe la marca en el catéter que da un índice aproximado de hasta qué punto es necesario insertar el catéter. Una vez que se alcanza el punto, suavemente apriete tanto el hilo de sutura superior alrededor del catéter e inferior. El catéter se fija a la arteria carótida por los nudos de sutura.
- Cerrar la incisión de la piel con no absorbible 5-0 sutura. Una vez cerrado, sellar la incisión con adhesivo tisular.
4. Medidas de recuperación quirúrgicos y BP
- Vigilar estrechamente los animales para el retorno de posturas y comportamientos normales. Durante la 24 horas después de la cirugía de la analgesia periodo administrar según las indicaciones de un veterinario personal.
- Una vez que los animales se han recuperado (5 - 7 días después de la cirugía), alojarlos individualmente en una jaula rectangular ratón colocado en la parte superior de la placa de receptor de telemetría.
- Gire el tr implantadoansmitters "on" y "off" mediante el uso de un dispositivo magnético posicionados brevemente cerca del animal desde el exterior de la jaula.
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Representative Results
Los datos pueden ser adquiridos de forma remota por un receptor; trazas se visualizan en una pantalla de ordenador para el control de calidad (Figura 1a). Los detalles tales como Identificación de los animales, la presión arterial diastólica y la presión arterial sistólica también se muestran (Figura 1b). La PA se puede grabar de forma continua (24/7), o por intervalos programados cortos (es decir, 60 seg adquisición cada hora). Los datos pueden almacenarse automáticamente en un disco duro para su posterior análisis. BP datos promediados de una grabación continua de 3 días se muestran (Figura 2), es posible apreciar la variación del ritmo circadiano entre el ciclo de luz y oscuridad. Promedio de la tasa de variación de la presión y el corazón se calculó y se representó frente al tiempo.
Figura 1. Los trazados típicos de la presión arterial de 4 Diferentes ratones implantados con telemétrico de dispositivos. Los trazados (A) que muestra los cambios de presión arterial en tiempo real (mmHg) durante un intervalo de 5 minutos. Los datos se adquieren simultáneamente a partir de cuatro ratones adultos diferentes 5 días después de la implantación. (B) localización en mayor resolución temporal extraída de A, es posible apreciar arterial diastólica de presión sistólica y los valores, la duración del ciclo de BP, y el ritmo cardíaco. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Presión Figura 2. A largo plazo sangre arterial Muestra de variación del ritmo circadiano. Un promedio de los datos de presión que ilustran los valores de (A) Presión sistólica (SP), (B) la presión diastólica (DP), (C) la presión arterial media (MAP), y (D) ra corazónte expresa en latidos / min. Los datos fueron extraídos de grabaciones continuas tomadas durante el día (ciclo de luz, L) o de la noche (ciclo de oscuridad, D). La grabación comenzó 7 días después de la cirugía. Todos los datos se expresan como media ± SEM (n = 4 ratones). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Implantable radiotelemetría ha mejorado significativamente en la última década; tamaño de la sonda más pequeño hace que el implante menos traumático para el animal, vida de la batería prolongada ayuda a reducir los costes, y las frecuencias telémetro independientes eliminar la diafonía entre los receptores. La telemetría se considera el método del estado de la técnica para recoger una amplia variedad de parámetros fisiológicos se mueva libremente animales sin los artefactos asociados con el uso de restricción, la interacción humana, o anestesia que son requeridos por otras técnicas 8,9.
Sin embargo, algunas de las desventajas de su técnica están asociados con los costes iniciales de instrumento y software. Los transmisores son frágiles y susceptibles a los daños, y la batería finalmente se ejecuta fuera del poder y necesitan ser reemplazados. A pesar de que la empresa ofrece para la renovación de esas sondas dañadas a un menor costo, el costo puede ser todavía prohibitivo para algunos laboratorios.Por otra parte, este procedimiento puede ser técnicamente difícil y se requiere práctica para lograr una medición fiable de BP. Por último, hay algo de post-cirugía mortalidad asociada, que en nuestras manos es de aproximadamente 5%. Esto puede aumentar drásticamente si un tratamiento específico tiene que ser probado o si una manipulación genética en peligro la salud del ratón.
Los siguientes factores críticos son esenciales para la ejecución exitosa del procedimiento: mantener la hidratación de los tejidos con solución salina estéril durante todo el procedimiento. Siempre debe sostener el transmisor con gran cuidado; evitar la celebración por el sensor de presión ya que esto puede causar que el gel se escape hacia fuera o dañar el transmisor. Al insertar el catéter, atar la sutura central con un nudo doble, ya que el no hacerlo resultará en el catéter que sale del recipiente. La longitud necesaria del catéter que tiene que ser insertada en la carótida puede cambiar de acuerdo con la cepa de ratón y el peso usado en que particuestudio lar. Por lo tanto, es muy recomendable para ejecutar un experimento preliminar para determinar qué tan profundo que sea insertado para evitar la oclusión de la aorta del catéter. Por último, vigilar el animal al día y asegurarse de que la piel sobre el transmisor no se estira o necrótico. Si se produce la necrosis o infección extendida, la eutanasia a los animales de acuerdo con la política institucional.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
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