Protocol
Declaración de Ética: Los protocolos para el manejo de animales fueron aprobados por el Vanderbilt Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC, protocolos número M / 10/117 (porcina) y M / 10/219 (ratones) y llevado a cabo de acuerdo con las normas de AAALAC-International. el uso de tejidos cardíacos humanos peraltadas fue aprobado por la Universidad de Vanderbilt Medical Center IRB (número de protocolo 100887).
1. Recolección de muestras y almacenamiento
- Hacer fresco glutaraldehído 4% en solución tampón de fosfato 0,1 M (PB).
PRECAUCIÓN: El glutaraldehído es tóxico, lleve guantes y el trabajo en una campana de humos.- Hacer una solución 0,2 M social de PB, pH 7,4 usando 21,8 g de Na 2 HPO 4 y 6,4 g NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) a 1.000 ml de dH2O
- Añadir 400 l de 50% de glutaraldehído a 2,5 ml de solución madre de PB y 2,1 ml de dH2O
- Sumergir un trozo (no más de 2 cm 2) de tejido en la solución de glutaraldehído al 4%. Nota: Las piezas más pequeñas se pueden utilizar también, pero deberían ser de tamaño suficiente (no más pequeña que 5 mm 2) para ser fácilmente visualizado por el ojo a fin de facilitar los pasos posteriores del protocolo.
- Se incuba a temperatura ambiente durante 1 hora, a continuación, almacenar indefinidamente a 4 ° C.
2. Descelularización de tejido cardíaco
- Hacer una solución de NaOH acuoso al 10% fresco usando 10 g de lentejas de NaOH / 100 ml de dH 2 O.
PRECAUCIÓN: soluciones de NaOH son corrosivos y pueden causar quemaduras a los álcalis, usar guantes. - Enjuague el tejido en dH2O
- Se incuba en una solución de NaOH al 10% a temperatura ambiente durante 6 - 10 días (hasta que los cambios de tejido de color marrón rojizo a grisáceo o blanco).
- Enjuague con H2O destilada hasta que el tejido se vuelve transparente.
- Sumergir el tejido en ácido tánico al 1% durante 4 horas a temperatura ambiente. Use 1 ml 5% solución de reserva por 4 ml de dH2O
PRECAUCIÓN: El ácido tánicoes un fuerte irritante, use guantes. - Enjuague en dH2O durante la noche.
3. Osmication y deshidratación de los tejidos del corazón (en la campana de humos para la Seguridad)
- Hacer una solución 0,2 M de stock de tampón de cacodilato de sodio utilizando 21,4 g de cacodilato de sodio, cloruro de calcio 10,0 g y 450 ml dH 2 O. Mezcla, a continuación, añadir ácido clorhídrico como sea necesario para ajustar el pH a 7,4. Qs a 500 ml con dH2O
PRECAUCIÓN: cacodilato de sodio y ácido clorhídrico son tóxicos, usar guantes y el trabajo en una campana de humos. - Hacer solución madre acuosa al 2% de tetróxido de osmio en campana de humos para la seguridad disolviendo 1 g de cristal de tetróxido de osmio en 50 ml de dH2O
PRECAUCIÓN: El tetróxido de osmio es un grave peligro de inhalación; la fijación de vapor de las membranas mucosas o los ojos es posible, por lo tanto, manejar sólo en la campana de humos con guantes. Se recomienda utilizar un protector contra salpicaduras. - Enjuague el tejido en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (de la mezcla de la solución 1: 1 con dH
- Repita el paso anterior dos veces, para un total de tres enjuagues de amortiguamiento.
- Sumergir el tejido en el 1% tetróxido de osmio en tampón cacodilato de sodio 0,1 M (de la mezcla de cacodilato de sodio social y acciones de tetróxido de osmio 1: 1) en el rotador durante 1 hora.
- Enjuague el tejido en tampón cacodilato 0,1 M de sodio 3 veces durante 5 minutos cada uno en los rotadores.
- Enjuague tejido usando concentraciones crecientes de etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, y, finalmente, 100%) durante 15 minutos cada uno en los rotadores.
4. Corte transversal preparación de superficies para SEM
- Transferir el tejido en etanol al 100% a un plato poco profundo de Petri que contiene también 100% de etanol.
- Mantenga dos cuchillas de afeitar muy afilados de tal manera que los planos de los lados están en contacto uno con el otro y la cruz bordes de corte para formar dos lados de un triángulo equilátero por encima de la muestra. Para lograr esto, usar la mano izquierda para colocar una cuchilla en el extremo derecho de la muestra ycorte hacia la izquierda. Al mismo tiempo, usar la mano derecha para colocar la segunda hoja en el extremo izquierdo de la muestra y la rebanada hacia la derecha. Por lo tanto, las cuchillas se deslizan uno contra el otro desde direcciones opuestas para hacer un solo corte suave.
- Deslizar los lados de hoja plana uno contra el otro para hacer un corte muy limpio de la muestra con una distorsión mínima o fuerza de desgarro, preferiblemente exponiendo tan grande un área de superficie como sea posible sin dañar la muestra.
- Repita este procedimiento para cada muestra para exponer las posibles superficies de sección transversal más limpias para su examen en el SEM.
5. El punto crítico de secado (CPD) de tejido cardíaco
- Utilice una espátula o pinzas para transferir tejido para el soporte de muestra de la secadora punto crítico (CPD), asegurando que el tejido se mantiene en etanol al 100% en todo momento. Asegúrese de que el soporte se sumerge en etanol y que la transferencia se consigue con el tejido expuesto al aire durante no más de unos pocos segundos.
- Operar CPD por nosotrosmanual del er 3 para completar la purga y relleno para reemplazar los ciclos de etanol con dióxido de carbono líquido.
- CPD operar según el manual del usuario para lograr un secado punto crítico de las muestras y devolverlos a la presión atmosférica con ventilación controlada de CO2.
6. Montaje de muestras de tejido del corazón para SEM
- Preparar un trozo de muestra SEM para cada muestra, adhiriendo una lengüeta adhesiva de carbono a la superficie superior del tramo de aluminio.
- Con la ayuda de un microscopio estereoscópico, se adhieren cuidadosamente la muestra para el precinto adhesivo con la superficie de la sección transversal de interés hacia arriba (lejos de la pestaña, visible), y lo más cerca posible de manera paralela con el plano de la superficie de la muestra trozo. No introduzca ni toque la superficie de interés.
- Romper un aplicador de madera para lograr un cepillo cónico, ideal para la aplicación de pintura. Aplicar pintura de plata o de carbono en la base y los lados de la probeta, para mejorar la adherencia al trozo.
- Extender una línea muy fina de plata o de carbono pintar hasta un borde de la superficie de interés, para proporcionar un camino de carga de la superficie de interés a tierra.
- Aplicar 2 o 3 pequeños toques de plata o pintura de carbono alrededor del perímetro de la pestaña de carbono, para proporcionar una ruta conductora de la superficie de la aleta de carbono para el talón de metal y por lo tanto a tierra.
- Deje que se seque la pintura conductora durante dos horas.
- Operar revestidor de bombardeo iónico por el manual del usuario para aplicar un recubrimiento relativamente pesado (intervalo objetivo de 30 - 40 nm) de aleación de oro-paladio u oro. Bomba cámara de muestras a aproximadamente 0,1 mbar; programar el temporizador de 40 segundos. Conjunto de válvula abierta al (flujo de gas argón moderada) 08:00 posición. Pulse Iniciar para iniciar el revestimiento por bombardeo iónico a 30 mA. descarga luminiscente púrpura debe ser visible en la cámara de muestra.
7. SEM El examen de muestras de tejido del corazón
- Realizar microscopía electrónica de barrido relativamente bajo voltaje de aceleración para minimizar la formación de imágenes pos problemas asociados con la mala disipación de la carga en la muestra (carga). Sugerido condición de imagen inicial son: 5 kV voltaje de aceleración, distancia de trabajo de 10 mm.
- Con la asistencia de un operador con experiencia, empleo aumenta la distancia de trabajo para ampliar la profundidad de campo en condiciones de formación de imágenes que requieren foco de fibras en múltiples planos focales, o fibras que se extienden de considerable longitud en la dimensión z.
- Para el microscopio usado aquí (véase la Tabla de Materiales), en el acceso a la interfaz de usuario en la pestaña de navegación arriba a la derecha.
- Acceder a la ficha Coordenadas del menú escenario. Para aumentar la distancia de trabajo, introduzca un valor mayor en milímetros para la coordenada z continuación, haga clic en la pestaña Ir a la etapa de mover la muestra a la distancia de trabajo introducido.
- Con la ayuda de un operador experimentado, emplear inclinación espécimen y rotación para posicionar la superficie de ortogonal interés para el haz de electrones. la inclinación adicional de 10 a 30 grado dees de esta posición puede mejorar la observación y documentación de la estructura de la matriz.
- Para el microscopio usado aquí (véase la Tabla de Materiales), en la interfaz de usuario, haga clic y mantenga pulsado el botón derecho del ratón, a continuación, deslice hacia la izquierda o hacia la derecha para enfocar la muestra cerca de la periferia del plano de la superficie preparada de interés, teniendo en cuenta la distancia de trabajo enfocado .
- Navegar con el mando de control de interfaz de usuario Manual de moverse cerca del borde opuesto de la superficie y repita el enfoque. Si la distancia de trabajo no es aproximadamente igual a la primera posición, la muestra de inclinación para lograr la aproximación de acuerdo en ambos lugares mediante la ficha Coordenadas del menú de la etapa (véase el apartado 7.2) e introduzca un valor de inclinación en el T de coordenadas.
- Girar noventa grados espécimen (Anotar el valor en R Coordinar campo) y repetir el proceso hasta que todas las posiciones se concentran aproximadamente a la misma distancia de trabajo.
Nota: presión variable SEM se puede emplear para mejorar la disipación de la cargasi está disponible. De alto vacío es el modo de funcionamiento estándar para la microscopía electrónica de barrido.
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Representative Results
La técnica resaltado se aplicó a los tejidos cardíacos de un donante de trasplante de corazón humano no utilizado (Figura 1), tejidos explantados de los receptores de trasplante, los corazones de tipo salvaje y ratones distróficos (Figura 3), y en muestras de corazón post-infarto de miocardio de un cerdo modelo de lesión del corazón (Figura 2). Como se muestra en la Figura 1, la matriz cardíaco humano es un intrincado tejido de proteínas reticuladas que muestran un patrón de panal de abeja cuando se ve en sección transversal. Cada estructura de "nido de abeja" es de aproximadamente 40 micras de ancho, normalmente destinado a neutralizar una sola miocitos, al considerar la vista en planta en la Figura 1. Cuando está conectada mediante discos intercalados, varios cardiomiocitos se puede prever como una varilla en sentido longitudinal a través del "túnel" cuando la metáfora se extiende a la tridimensionalidad. La figura 1 también destacadosla importancia del proceso de corte, con mayor precisión produciendo datos topográficos más reveladoras (Figura 1, arriba a la izquierda) de secciones que se "rompieron" durante el proceso de corte (Figura 1, arriba a la derecha).
La eliminación de las células residentes cardiacas, vasos sanguíneos y células circulatorias antes de procesar SEM revela detalles ultra-estructurales adicionales que serían menos apreciable por SEM de bloques de tejido cardíaco enteros. Cada colágena "puntal" individuo, por ejemplo (Figura 1, paneles inferiores) es aparentemente alineados a intervalos regulares y perpendicular a las miofibrillas sarcómeros. Esta disposición es adecuada para ayudar a mantener la estructura del corazón por deformaciones de contador de acción ejercidas durante los ciclos de contracción y relajación, similar a la "urdimbre y la trama 'de textiles que ayuda a mantener el cuerpo de la tela y la forma en contra de estiramiento.
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Figura 1:. Representativos de exploración Microscopio electrónico de la disposición tridimensional de la matriz extracelular en Descelularizado ventricular izquierda tejido obtenido de un donante de corazón humano desaprovechado Los dos paneles superiores muestran la matriz en la sección transversal a bajo aumento (bares = 500 micras), proporcionando una vista aérea de la arquitectura de los tejidos del corazón humano normal. A mayor aumento, se puede observar mejor la típica estructura en forma de panal de fibras de apoyo que proporcionan soporte mecánico para las miofibrillas regularmente espaciados (barras del panel izquierdo y derecho mediana = 100 micras y 50 micras, respectivamente). Tras una inspección más cercana, cada uno 'nido de abeja' se compone de fibras que se organizan en paralelo entre sí, mientras perpendicular a cardiomiocitos residentes (bares panel inferior izquierda y derecha = 10 micras y 5 micras, respectivamente).TTP: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Además de proporcionar información estructural, SEM de tejidos descelularizados puede hacer una evaluación adecuada, cualitativa de los cambios de la matriz extracelular en respuesta a una lesión o formas no perjudiciales de la miocardiopatía. Por ejemplo, esta técnica se utilizó recientemente para examinar las matrices extracelulares de los tejidos cardíacos porcina post-infartados 43. Durante el curso de este experimento a gran animal, diseñado específicamente para evaluar la eficacia de la isoforma GGF2 de NRG-1β como un agente terapéutico potencial para la insuficiencia cardíaca, porcina post-infartada que recibió la administración de NRG-1β intravenosa exhibió golpear alteraciones en la matriz cardiaca , en comparación con los tejidos cardíacos no tratados de animales post-infartados. Estos resultados fueron publicados posteriormente 43, y el TEchnique ha seguido siendo una herramienta valiosa para la construcción en este descubrimiento inicial, fortuito. La figura 2 incluye micrografías ejemplo, producidos durante el curso de este estudio, que ponen de relieve las diferencias drásticas entre las matrices de matriz-tratados NRG-1β no tratada y.
Figura 2:. Representativos de exploración Microscopio electrónico de ventrículo izquierdo de la matriz extracelular en no tratados y NRG-1 β cerdos tratados con, después de NaOH Maceración La matriz de la sección transversal destaca la disposición espacial regular de fibras en el infarto de miocardio post-tratamiento (post-IM) cerdos (arriba a la izquierda), en comparación con los animales tratados post-IM-NRG-1β (arriba a la derecha). Cuando se ve en longitud, la matriz en el ganado porcino sin tratar exhibe una apariencia gruesa, mate-como (parte inferior izquierda), mientras que la matriz de NRG-1ß tratados con cerdosmuestra la disposición espacial regular de fibras (abajo a la derecha). barra blanca = 40 micras (los cuatro paneles). Pueden encontrarse más detalles y cifras se incluyen en el manuscrito 43 asociado. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Exploración de los cambios de la matriz que se producen en los corazones distróficos también ha dado información cualitativa en la progresión y el desarrollo de un modelo animal de la distrofia muscular de cardiomiopatía distrofia (DMD). En ratones mdx, un modelo de ratón de uso común de la DMD, existen diferencias significativas y dependientes de la edad entre los de tipo salvaje y corazones mdx cuando se ve por SEM después de la fijación y el tratamiento NaOH. Como se muestra en la figura 3, componentes de la matriz eran relativamente normal en 6 semanas de edad, los corazones mdx que carecen de distrofina funcional con respecto a los ratones normales. más interesting, organización matriz extracelular estaba claramente perturbado o tal vez degradado en ratones de más edad con deficiencia de distrofina en comparación con los ratones mdx jóvenes, que ilustra la naturaleza progresiva de la DMD en el corazón. No se espera que tales diferencias profundas, porque los ratones mdx son poco representativas de la miocardiopatía DMD humana debido al hecho de que exhiben un fenotipo de cardiomiopatía mucho más suave y la tasa de mortalidad más lento que los seres humanos con DMD 48. Esto sugiere que incluso pequeños cambios en la función del corazón puede ser capturado utilizando la técnica de visualización presentada en este manuscrito. Esta metodología también debería ser fácilmente adaptable a las matrices extracelulares de otros órganos, para los que hay actualmente disponibles Asimismo, no hay terapias fibrosis de metas.
Figura 3: Micrografías representativas electrónicos de barrido de izquierda Venventricular matriz extracelular de tipo salvaje frente a ratones mdx. La matriz de la izquierda ventricular cardíaca en ratones de tipo salvaje (panel superior) es similar a la observada en otras especies. La matriz en ratones mdx a las 6 semanas de edad parece relativamente normal, aunque ligeramente "esponjoso" en apariencia (panel medio). A la inversa, la matriz cardiaco de ratones mdx de edad avanzada aparece gravemente degenerado (panel inferior), indicando que el proceso distrófico puede ser capturado cualitativamente usando SEM en, tejidos macerados-NaOH fijos. Barra blanca = 10 micras (los tres paneles). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Cruz preparación sección de superficie es el paso más crítico durante el protocolo. Para preservar la estructura fina, las muestras deshidratadas deben permanecer en etanol al 100% en todo momento hasta introducido en el proceso de secado de punto crítico. Por lo tanto el corte en lonchas de los especímenes para lograr superficies de exploración EM deben hacerse mientras las muestras se sumergieron en etanol en un plato poco profundo. También es fundamental que la superficie expuesta no se toca o sondeó durante la manipulación posterior. No hay grandes modificaciones se prevén para la aplicación de esta técnica a otros tipos de tejidos para las observaciones de matriz similares, aunque la parte SEM del protocolo podría requerir resolución de problemas básicos de microscopía electrónica independientemente del origen de la muestra. Imágenes recogidas de las muestras fibrosas son propensos a artefactos introducidos por la disipación de carga pobres ( "carga"). problemas de carga general pueden minimizarse mediante la reducción de voltaje de aceleración, el aumento de velocidad de barrido (también llamado tiempo de permanencia) Y la reducción de tamaño de punto del haz de electrones. La integración de varias exploraciones recogió la suficiente rapidez para evitar artefactos de carga producirá una imagen de señal comparable a la calidad del ruido y sin los artefactos de carga presentes en una mayor calidad de imagen de barrido lento, sola.
Esta técnica es intrínsecamente cualitativa y así complementa cuando se considera junto con mediciones cuantitativas (por ejemplo, tricrómico de Masson o picoserius tinción con rojo, la medición del contenido de hidroxiprolina, espectrometría de masas y RNASeq) para determinar cómo las diferencias estructurales visualizados podrían estar relacionados con diversos estados de desarrollo o enfermedades. Sin embargo, a pesar de esta limitación, el método es significativa más allá de la fibrosis cardiaca específicamente, debido a que la matriz extracelular es un componente esencial de casi todos los órganos en el cuerpo. En el corazón, la matriz cardíaca proporciona soporte mecánico crítico para el bombeo continuo caracterizado por el complejo de estiramiento, torsión, y deformación, lo que le confiere una óptima entrada y flujo de salida de la sangre oxigenada y desoxigenada 49 para los> 2.5 millones de latidos que se producen durante la vida humana promedio. Dada la capacidad de regeneración extremadamente bajo de tejido cardiaco, una matriz dinámica que puede ser remodelado de acuerdo a las necesidades contextuales tiene un sentido lógico. Con sólo una ligera extensión de la imaginación, se podría inferir que existen dianas terapéuticas para la manipulación de remodelación de la matriz para mejorar el proceso de curación, al tiempo que limita la fibrosis adverso. La aplicación de la técnica demostrada en un mínimo muestra la sofisticación y la belleza de la matriz cardíaca y, al hacerlo, subraya aún más su importancia funcional.
Mientras que el valor de las medidas cuantitativas es un principio básico para la evaluación de prácticamente todos los estudios experimentales, la técnica destacadas aquí se puede utilizar para revelar variaciones ultraestructurales cualitativos que no sólo complementan mediciones de matriz estándarpero podría sugerir caminos alternativos de investigación para comprender las alteraciones bioquímicas fundamentales que ponen de relieve los cambios cualitativos. Previstos de futuras aplicaciones de esta técnica son su uso en modelos de enfermedades cardiacas y tejidos humanos como una herramienta complementaria para evaluar los cambios de la matriz, así como el uso ampliado para estudiar otros órganos para que los cambios de la matriz son un componente de proceso de la enfermedad.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| Carbon Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | order to fit stubs |
| Double Edge Razor Blades Stainless Steel | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/pkg |
| Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| Gluteraldehyde, 50% Solution | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, distillation purified |
| Hydrochloric Acid | Electron Microscopy Sciences | 16760 or 16770 | 100 ml |
| Monosodium Phosphate NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| Silver Conductive Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| Tannic Acid, 5% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| Trihydrate Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| Gold-palladium Alloy or Gold | Refining Systems, Inc. | varies | specific to the sputter coater make and model |
| Critical Point Dryer | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| Plain Wooden Applicators | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 Environmental SEM | FEI | Q250 SEM | |
| Sputter Coater | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| Alluminum SEM Sample Stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | specific to the miscroscope |
References
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