Summary
Detta protokoll styr effektivt mus embryonala stamceller härrörande slutgiltig endoderm till mogna luftvägsepitelceller. Denna differentiering teknik använder tre-dimensionell decellulariserade lung ställningar för att styra lung härstamning specifikation, i ett definierat, serumfritt odlings inställning.
Abstract
Lung härstamning differentiering kräver integration av komplexa miljö signaler som innehåller tillväxtfaktorsignalering, cell-cell interaktioner och cell-matrix-interaktioner. På grund av denna komplexitet, till rekapitulation av lungutveckling in vitro befrämja differentiering av stamceller till lungepitelceller har varit en utmaning. I detta protokoll är decellulariserade lung byggnadsställningar som används för att efterlikna den 3-dimensionella miljön i lungan och generera stamcellshärledda luftvägsepitelceller. Mus embryonala stamceller först differentieras till endoderm härstamning med hjälp av en embryoid kropp (EB) odlingsmetod med aktivin A. endoderm celler därefter ympas på decellulariserade byggnadsställningar och odlades vid luft-vätske-gränssnitt för upp till 21 dagar. Denna teknik främjar differentiering av ympade celler till funktionell epitelceller i luftvägarna (cilie celler, klubb celler och basalceller) utan ytterligare tillväxtfaktor tillskott. Denna kultur inställning definieras, Serum-fri, billig och reproducerbar. Även om det finns begränsad förorening från icke-lung endoderm linjer i kultur, detta protokoll genererar endast epitelceller i luftvägarna populationer och inte ger upphov till alveolära epitelceller. Luftvägsepitel som genereras med detta protokoll kan användas för att studera cell-matrix interaktioner vid lung organogenesen och sjukdom modellering eller läkemedelsupptäckts plattformar luftvägsrelaterade sjukdomar såsom cystisk fibros.
Introduction
Riktad differentiering av pluripotenta celler till lung härstamning är beroende av exakta signaleringshändelser i mikro 1,2. På grund av den dynamiska karaktären av denna process har det varit en utmaning att efterlikna de exakta händelserna lung organogenes in vitro. Nya rapporter har använt stegvis härstamning begränsande strategi med löslig tillväxtfaktor tillskott av tvådimensionella kulturer för att uppnå lungdifferentiering 3-8. I stegvisa differentieringsprotokoll, pluripotenta celler, om embryonala stamceller (ESC) eller inducerade pluripotenta stamceller, först differentieras till den slutgiltiga endoderm GRODDBLAD. Endodermala celler därefter skjuts till en främre endoderm öde och därefter till lung progenitorceller, som identifierats av uttrycket av homeodomänen innehållande transkriptionsfaktor NKX2-1. Dessa lung progenitorceller var ytterligare differentieras till proximal (luftvägarna) eller distala (alveolära) lungepitelceller with fortsatt tillväxtfaktor tillskott. Sådana två-dimensionella strategier har haft viss framgång i att skapa lung epitelceller, men det finns flera begränsningar, inklusive oklara effektivitet, eventuella föroreningar från andra endodermala linjer, avsaknaden av en 3-dimensionell (3D) struktur, och i vissa fall användning av odefinierade kulturer med serum supplementation. Kultur av pluripotenta eller differentierade celler på decellulariserade lung byggnadsställningar används alltmer som en analys för att bedöma regenerativ potentialen hos sådda celler i forma lung epiteliala strukturer 3,5,6,8,9. Sådana rapporter kultur seedade celler på ställningar med fortsatt tillväxtfaktor eller serum tillskott.
Lungutveckling involverar division, migration, genuttryck och differentiering av enskilda celler som svar på miljömässiga signaler. Den extracellulär matrix (ECM) är en gallerverk av glykoproteiner som förutom att ge strukturellt stöd, riktar tissue morfogenes genom att integrera och reglera dessa processer 10,11. Med hjälp av lung ECM ställningen som en naturlig plattform för endoderm kultur för att bättre efterlikna lungan utvecklings milieu in vivo, har vi genererat-stamcellshärledda epitelceller i luftvägarna i en definierad 3D-kultur inställning med hög effektivitet och reproducerbarhet.
Råttlunga ECM ställningar genererades av decellularisering samt mus ESC-härledda endodermala celler genererades och därefter ympas på dessa ställningar. Dubbel expression av CXCR4 och c-kit-proteiner indikerar en slutgiltig endoderm cellidentiteten och celler positivt för både Sox2 & NKX2-1 uttryck identifieras som luftvägarna (proximal lung) progenitorceller. Slutgiltiga endoderm celler odlades vid luftvätskegränssnittet (ALI) för upp till tre veckor för att generera funktionella luftvägsepitelceller in vitro.
Detta protokoll gynnar lung härstamning differentiering av definitiva endoderm så tidigt som 7 dagar, observerades med uppkomsten av NKX2-1 + / Sox2 + tidiga proximala lung stamceller. Vid dag 14 och 21 av kultur mogna luftvägarna epitelceller cellpopulationer framträder inklusive cilie (TUBB4A +), klubb (SCGB1A1 +), och basala (TRP63 +, KRT5 +) celler med morfologiska och funktionella likheter med infödda mus luftvägar. Detta protokoll visar betydelsen av 3D-matrismikro för att uppnå robust differentiering till epitelceller i luftvägarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök utfördes i enlighet med Animal Care kommitténs riktlinjer sjukhuset för sjuka barn Research Institute.
1. Scaffold Framställning
- Decellularisering av lungor
- Euthanize vuxna Wistar-råttor med hjälp av CO 2 kammare. Placera djur i kammaren och starta 100% CO2 exponering vid en fyllningsgrad 10-30% av kammarvolymen per minut.
- Observera djur för medvetslöshet; Detta kommer att ske efter ca 2-3 min. Om medvetslöshet inte sker under denna tid, kontrollera fyllnadsgrad och kammartätningen. Efter medvetslöshet, observera djur för bleka ögonfärg och bristande andning. Om båda efterlevs, upprätthålla CO2 fyllning i 1-2 minuter och sedan ta bort djur från kammaren för förfarandet.
- Säkra djuret till dissekera yta genom att fixera framtassar och bakben, och spraya ner bröstet och buken område med 70% etanol. Komma åt hjärtat och lungs genom att öppna brösthålan med hjälp av en vertikal incision längs bröstbenet.
- Gör små snitt genom membranet först att förorsaka lungorna att dra tillbaka, vilket minskar risken för punktering lungorna. Ligera nedre hålvenen med en sutur och placera ett litet snitt i vänster förmak med små dissekera sax.
- Med användning av en förberedd 10 ml spruta med en 25 G-nål fylld med hepariniserad Hanks balanserade saltlösning (HBSS) (10 U / ml heparin i HBSS), starta lung perfusion genom att föra in nålen i den högra kammaren för att driva bufferten genom lungkretsloppet (hastighet av 2 ml / min). Upprepa tills lungorna blir vita och vätskan flödar från vänster förmak är klart.
- Efter perfusion, exponera luftstrupen och cannulate med en plastkateter nära sköld brosk och säkra på plats med en sutur.
- Setup en gravitation perfusion systemet genom att fastställa en 10 ml spruta till en retort stativ och klämma. Ta bort och discard sprutkolven. Säkra högsta påfyllningspunkten på sprutbehållaren på 20 cm ovanför lungorna. Bifoga en två-vägskranen till änden av sprutan, och en lång plastslang till den andra änden av avstängningskranen för att leverera decellulariseringslösning till den kanylerade luftstrupen. Häll lösningen i sprutan och låt lösningen för att fylla fäst plastslang och kateter.
- Lavage lungorna genom att fylla till total lungkapacitet (ungefär 12 ml) under 1 min och ta bort plastkatetern från luftstrupen för att tillåta fluid att strömma ut ur lungorna. Fyll inte spruta mer än 10 ml när lavaging lungor för att hålla trycket under 20 cm H2O
- Upprepa sköljning av lungorna åtta gånger med decellulariseringslösning, följt av 10 sköljningar med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Dissekera luftstrupe och lungor fri från halsen och bröstkorgen och ta bort från djuret. Hålla vävnaden i kall PBS vid 4 ° C tills förberedelse för vibratome sigctioning.
- Euthanize vuxna Wistar-råttor med hjälp av CO 2 kammare. Placera djur i kammaren och starta 100% CO2 exponering vid en fyllningsgrad 10-30% av kammarvolymen per minut.
- Tjock anitt
- Förbereda cirka 15 ml av 2% och 4% (vikt / volym) agaros, och tillräckligt 6% (vikt / volym) agaros för inbäddning alla lober i små rektangulära block. Upplösa lågsmältande agaros pulver i PBS genom mikrovågsbehandling. Överföra agarosen till 50 ml rör på ett värmeblock och upprätthålla temperatur över 40 ° C för att undvika gelning.
- Dissekera decellulariserade lunga vid slutet av varje lobära luftrör att lösgöra varje lob (kraniepartiet, mitt, tillbehör, och stjärtfenan rätt lober och den vänstra loben) med hjälp av en liten sax. Pat torka varje lob med användning av absorberande ark för att avlägsna överskott PBS och placera i 2% (w / v) agaros medan värmeblocket.
- Ta bort varje lob efter 5 min av beläggningen i agaros, placera i en petriskål och låt ytan gel under 1 minut på en kall platta.
- Placera försiktigt lober tillbaka in 4% (vikt / volym) agaros, cool efter 5 min, och upprepa beläggning en gång mer med 6% (vikt / volym) agaros.
- Efter sekventiell corande av varje lob, bädda varje lob separat i 6% (vikt / volym) agaros av metall bas formar med minst 3 mm agaros omgivande vävnad från kanterna. Orient varje lob med användning av pincett genom att positionera loben största platt kant vid ytan av metallformen som vetter mot försöksledaren. Denna kant kommer att vara sidan fäst vid provplattan för vibratome sektionering.
- Låt block gela på kall platta i minst 30 minuter innan snittning med vibratome. Lagra block i en fuktad kammare under upp till 12 h vid 4 ° C före vibratome snittning.
- Setup vibratome genom att fylla sektionekammaren med kall PBS 12. Bibehålla kall temperatur genom snittning med den omgivande isbad. Ta bort block från metallformar och använda ett rakblad för att trimma ner överskott agaros omgivande lober, medan cirka 3 mm från kanten av vävnaden.
- Fixera vävnaden till centrum av provet plattan med användning av lim, och dränka plattan i than PBS-fyllda snitt kammare. Inställning sektione gränser på vibratome genom att välja följande värden hastighet, amplitud, och tjocklek respektive: 0,2 mm / sek, 1,85 mm, och 350 nm.
Notera: Både längsgående och tvärgående sektioner av loben orientering är acceptabla. - Avsnitt varje lob helt. Manuellt skurna sektioner fria använder en liten sax, om ett avsnitt inte är helt åtskilda av bladet vid slutet av sektionen sekvensen. Samla ställningssektioner försiktigt och förvara i PBS på is fram till nästa steg.
Obs: Sektioner som genereras kommer att innehålla både de proximala och distala lungområden och båda källorna kan användas för recellularization; dock kommer de flesta av ytan omfattar distala lungan.
- Sanering av ställningssektioner
- Överför 350 mikrometer tjocka ställningssektioner från PBS till mikrocentrifugrör (upp till 30 sektioner / rör) och behandla med nukleas (90 U / ml i PBS) (se lista över material) för 12-24 timmar vid RT, påen rotator.
- Efter nukleasbehandling, överföringssektioner som använder pincett till nya mikrocentrifugrör och behandla med antimikrobiell lösning (200 U / ml penicillin streptomycin och 25 mikrogram / ml amfotericin B i PBS) under sterila förhållanden under 6 h vid RT, på en rotator.
Obs: Byggnadsställningar kan lagras i antimikrobiell lösning för upp till en vecka vid 4 ° C före användning. - Efter sanering steg med antimikrobiell lösning, skölj ställningar två gånger med PBS under sterila förhållanden och överföra till serum fri differentiering media (SFDM) före sådd med celler.
2. endodermalt Cellberedning
- Slutgiltig endoderm Induktion
- Behåll mus ESC linjer som feeder-fri, serumfri kultur med hjälp av 2i villkor 13. Börja endoderm induktion genom att avlägsna celler från vidhäftande pluripotenta kulturen genom trypsinisering.
- Resuspendera celler i SFDM och frö vid en täthet av 20.000celler / ml i låga vidhäftande plattor för tre dagar utan media förändring för att möjliggöra EB bildning.
- Efter tre dagar överföra försiktigt EBS i 50 ml koniska rör med hjälp av en 10 ml pipett och tillåta dem att samlas på botten i 3 min vid RT.
- Försiktigt aspirera media och tillsätt färskt SFDM medium kompletterat med 50 ng / ml aktivin A.
- Fröceller tillbaka på de låga vidhäftande plattor vid en 1: 2 densitet och kultur för ytterligare tre dagar för att uppnå slutgiltig endoderm differentiering.
- Slutgiltig endoderm anrikning
- Samla dag sex EB, dissociera med trypsin och etikett för c-KIT och CXCR4 uttryck med hjälp av konjugerade fluorescerande antikroppar 14.
- Sortera märkta celler med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för uttryck av båda markörerna för att erhålla en anrikad slutgiltig endoderm population 15.
3. Recellularization Setup
- Luft-vätske-gränssnittkultur inställnings
- Överför varje decellulariserade byggnadsställningar sektion (steg 1.2.9) från SFDM på en hydrofob flytande membran (8 pm porstorlek) med hjälp av steril pincett. Säkerställa byggnadsställning sektioner är jämnt fördelade på membran.
- Förbereda 6- eller 12-brunnars plattor genom att fylla brunnar med 1 eller 0,5 ml av SFDM, respektive. Placera försiktigt membran i brunnar, vilket gör att membranet att flyta på toppen av media, vilket skapar en inställnings luft-vätskekultur.
- Sådd av 3D byggnadsställningar
- Efter FACS för definitiva endoderm markörer (steg 2.2.2) räkna sorterade cellerna med hjälp av en hemocytometer, spinn ner vid 400 xg under 5 min och återsuspendera i SFDM. Resuspendera celler för att erhålla en volym innehållande ca 100.000 celler / 10 pl / byggnadsställningar.
- Att recellularize byggnadsställningar, pipett 10 ul av celler direkt på varje förberedd avsnitt från steg 3.1.2.
- Byt SFDM media i kulturer varje 48 timmar. Aspirera gamla medier genom att hålla plattan vid en liten lutningatt undvika att störa kultur. Långsamt tillsätta färsk SFDM till kultur längs sidan av brunnen för att förhindra sjunkande flytande membran.
- Upprätthålla luft vätska kulturer för upp till 21 dagar för att uppnå differentiering av ympade celler i till mogen luftvägsepitel.
Note: Recellularized sektioner kan behandlas för vävnadsfärgning och immunofluorescent (IF) mikroskopi vid någon tidpunkt under cellkultur 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Såsom anges i detta protokoll, för robust differentiering slutgiltiga endoderm mogna luftvägarna epitelceller kan uppnås med hjälp av utökad odling av sådda celler på decellulariserade lungställningssektioner. Det rekommenderas att decellulariserade byggnadsställningar karakteriseras för att säkerställa (1) värdceller är helt bort, och (2) extracellulära matrisproteiner bevaras före användningen ställningar för differentiering. Decellularisering kan bedömas med hjälp av vävnad färgning med hematoxylin och eosin (H & E) och 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), som visas i figur 1A. Hög förstoring svepelektronmikroskop (SEM) analys av byggnadsställningar bekräftar frånvaron av värdceller och intakta matrisarkitektur, som visas i figur 1B. Ytterligare karakterisering av den återstående byggnadsställning genom dragprovning och immunfärgning för matrisproteiner kan utföras för att säkerställa preservatjon av ECM efter decellulariseringen 16.
Icke vidhäftande kultur av ekonomiska och sociala råd i SFDM medier för sex dagar resulterar i bildning av cellaggregat (EBS), såsom visas i figur 2A. Tre dagar av Aktivin A behandlingsresultat i definitiv endoderm induktion. Härstamning begränsning av ESC till definitiv endoderm kan bekräftas genom uppreglering och uttryck av endoderm linjeassocierade gener och proteiner 17, och kan inte göras gällande morfologiskt. Endoderm induktion effektivitet varierar från 50-70% beroende på ESC linje som används. Experiment utfördes i mus ESC linjer: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (dsRed -MST), och 129 / Ola (Bry-GFP / Foxa2-hCD4), medan all data som illustreras i detta manuskript använder R1 cellen linje. Den dubbla positiva CXCR4 + / c-KIT + slutgiltig endoderm population sorteras såsom illustreras i figur 2B, ympadespå 3D-lung ställningar, och odlades under upp till 21 dagar vid luft-vätske-gränssnitt SFDM. Det är viktigt att sortera och anrika för definitiv endoderm som begränsad organisation och differentiering uppnås med odling av osorterade celler från heterogena dag 6 EB som visas i figur 2C. Strukturer bildade av sorterade celler på byggnadsställningar är påminner om utveckla lung- (embryonala dag 13,5) såsom visas i fig 2C-D. Enligt vår erfarenhet har en såddtäthet av 100000 sorterade celler / scaffold gav den bästa scaffold återpopulations.
Differentieringen till lungan härstamning observeras så tidigt som 7 dagar efter ställnings kultur. Epitelceller i luftvägarna progenitorceller positiva för NKX2-1 och Sox2 detekteras med hjälp av IF konfokala analys såsom visas i fig 3A. Sox2 positiv, NKX2-1 negativa celler är troliga pluripotenta endodermala celler som inte har differentierade till lungan lineage. Med längre kultur dessa celler kan börja uttrycka NKX2-1 eller genomgå apoptos utan tillräckligt stöd i mikromiljö. Om en analys av dag 21 kulturer avslöjar en mogen airway epithelial population innehållande TUBB4A + cilierade celler, SCGB1A1 + klubb celler och TRP63 + / KRT5 + basalceller, såsom visas i figur 3B. SEM-analys av ytan på dagen 21 kulturer avslöjar morfologiska likheten mellan stamcellshärledda kulturerna Mus luftvägar.
Båda isolerade matrisproteiner (kollagen I, kollagen IV, fibronektin, laminin) och decellulariserade råttnjur ställningar var oförmögna att främja lung-härstamning differentiering när ympades med slutgiltig endoderm och odlades under samma betingelser som beskrivits ovan 16. Detta visar att 3D-mikromiljön som skapas av lunghärledda byggnadsställningar är distinkt från njurhärledda byggnadsställningar i dess förmåga att främja lung-härstamning differentiering av seeded endodermala celler.
Figur 1. decellularisering Tekniken avlägsnar cellulära komponenter och bevarar ECM. (A) H & E (top panel) och DAPI (undre panelen) färgning av naturliga och decellulariserade lungvävnad som visar frånvaro av kärnor efter decellularisering. Högra panelen visar exempel på vävnadssnitt från lungor utan optimal decellularisering. Pilspetsar visar återstående kärnor på ställningar på grund av ofullständig decellulariseringen, betonar vikten av att optimera tekniken innan recellularization. Skalstreck = 25 | im. (B) SEM-bilder av naturliga och decellulariserade lunga, visar frånvaro av celler och bevarande av matrisarkitektur decellulariserade byggnadsställningar. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka häratt se en större version av denna siffra.
Figur 2. Sorterat ESC-derived definitiva endoderm resulterar i optimal recellularization. (A) Dag 6 embryoidkroppar (EBS) efter tre dagar Activin En behandling för att främja definitiv endoderm differentiering. (B) EBS sorteras med FACS för dubbel expression av ytmarkörer CXCR4 och c-KIT för att isolera den slutgiltiga endoderm populationen. Denna population seedas på decellulariserade byggnadsställningar. (C) H & E-färgning av recellularized ställningar vid dag 7 och dag 21 av kultur. Vänstra panelen representerar organiserat, luftvägsliknande strukturer efter sådd med sorterade celler, och högra panelen representerar oorganiserade, mycket proliferativa osorterade celler på byggnadsställningar belyser vikten av sortering av celler före recellularization. Skalabar = 30 | im. (D) H & E-färgning av embryonala dag 13,5 mus lungorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Utökad kultur slutgiltiga endoderm på naturliga lung ställningar styr differentiering till epitelceller i luftvägarna. (A) Proximal lung progenitorceller (NKX2-1 + / Sox2 +) detekteras efter sju dagars odling på decellulariserade byggnadsställningar. Skalstreck = 15 | im. (B) vänstra bilden visar mogna pseudostratified epitelceller (CDH1 +) strukturer kantade av basalmembranprotein laminin på den basala sidan av strukturer. Mitten och höger bild visar mogna luftvägsepitel komplett med cilieceller (TUBB4A +), cluB-celler (SCGB1A1 +) och basalceller (KRT5 + / TRP63 +). Vänstra bilden skala bar = 30 pm; mitten och höger bild skala bar = 15 pm. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här genererar mogna ESC-derived luftvägsepitel med enbart naturliga lung ställningar för att styra differentiering med någon annan tillskott. Denna kultur installationen är definierad, serumfri, billig och reproducerbar. Ingen tillväxtfaktor tillskott av bas differentiering media krävs. Tidigare publicerade metoder för att generera stamcellshärledda lungepitelceller har använt två-dimensionella strategier med tillväxtfaktor tillskott för att främja härstamning begränsning 3,4,8,18,19. Den teknik som beskrivs här är fördelaktig över dessa metoder av flera skäl, bland annat: definierade odlingsbetingelser hög differentiering effektivitets funktionella luftvägsceller, begränsad kontaminering från andra endodermala linjer (sköldkörtel, lever, bukspottkörtel), och en 3D-differentiering mikromiljö. Denna teknik ger liknande resultat med mus härrörande ECM och kan därför ändras för att generera decellulariserade byggnadsställningar med musen lungor. Rat-härledda ESC differentierade till definitiv endoderm och sås på ställningar med hjälp av detta protokoll också differentieras till luftvägsepitel.
Decellulariserade byggnadsställningar kan lagras i saneringslösning vid 4 ° C i upp till 7 dagar före recellularization. Ställningar hålls för längre löptider kan vara funktionella, men vi har inte testat att bekräfta detta. För att uppnå en effektiv organisation och differentiering det krävs för att berika för definitiv endoderm genom FACS efter induktion med aktivin A. Icke-endoderm celler i dag sex EB ofta uttrycker pluripotens markör Oct4 och om såddes på byggnadsställningar kommer att fortsätta att föröka sig utan organisation och specifikation till lung härstamning. Sådd densitet kan också justeras baserat på cellinje-specificitet för att uppnå fullständig recellularization av byggnadsställningar.
En begränsning med detta protokoll är i dess oförmåga att främja differentiering till alveolära epitelceller. Även NKX2-1 + / SOX9 + distala progenitorceller detekteras efter sju dagars odling på ställningar, är denna population inte är närvarande vid dag 14 och dag 21. Markörer för moget typ I-alveolära epitelceller (AQP5) och typ II alveolära epitelceller (SFTPB, SFTPC) inte upptäcks i något skede under byggnadsställning kultur. Detta kan bero på ett krav på ytterligare tillväxtfaktor tillskott och nedsänkta odlingsbetingelser för att främja alveolär härstamning specifikation, medan som beskrivs här, matrixproteiner och återstoden matrisbundna tillväxtfaktorer på decellulariserade byggnadsställningar är tillräcklig för att främja luftvägs härstamning differentiering.
Det kritiska steget för att främja differentiering av definitiv endoderm till epitelceller i luftvägarna med hjälp av lung byggnadsställningar är optimering av decellulariseringen processen. Cellulära komponenter måste tas bort helt medan matriskomponenterna bevaras. Vävnadsfärgning för kärnämne använder DAPI, ultra-structural analys av ställningar med scanning och transmissionselektronmikroskopi, och DNA-analyser kan användas för att bekräfta borttagning av alla cellulära komponenter. ECM proteinsammansättning av byggnadsställningar kan bedömas med hjälp av IF färgning och immunoblotanalys för matrixproteiner: kollagen I, kollagen IV, elastin, fibronektin, heparinsulfat proteoglykaner och laminin 16.
Dessa stamceller som härrör lung epitel kan användas i sjukdoms modellering och läkemedelsforskning plattformar luftvägsrelaterade sjukdomar såsom cystisk fibros. Potentialen hos dessa cellmatriskonstruktioner i regenerativa applikationer såsom vävnadsreparation och cellterapi kan granskas av in vivo transplantation av manipulerade konstruktioner i olika musmodeller. Dessutom kan detta 3D in vitro metod för luftvägs differentiering enkelt anpassas för att studera olika parametrar som påverkar lung härstamning specifikation genom att manipulera tillväxtfaktor tillgänglighet och cell-matrix-signaleringkulturer under olika stadier av differentiering på byggnadsställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inga konkurrerande ekonomiska intressen att förklara.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr Rossant och Dr Bilodeau för Nkx2-1 mCherry ESC används i experiment som avbildas i figurerna 1-3. FACS utfördes i Sickkids-UHN flödescytometri Facility. Detta arbete stöddes av verksamhetsbidrag från den kanadensiska Institutes for Health Research och en bidrags infrastruktur (CSCCD) från den kanadensiska Stiftelsen för innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
